Protokolümüz, hastalığın ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkililiğin yakalanmasını sağlar. Yöntemimiz, klinik numunede genetik akrabalığı yüksek duyarlılık ve özgüllük ile keşfetme olanağı sağlar. Bunun nedeni moleküler ve histopatolojik analizlerin bütünleşmesidir.
Kanser araştırma alanında intratümör heterojenitesinin değerlendirilmesi etkili anti-tümör stratejilerinin tasarlanmasında büyük önem taşımaktadır ve yöntemimiz birçok solid tümör tipi için geniş ölçüde geçerlidir. İlgi kütüphanelerini hazırladıktan ve ölçtükten sonra, her kütüphaneyi çekirdeksiz suda 100 picomolar konsantrasyonuna seyreltin ve seyreltilmiş her kütüphanenin 10 mikrolitresini tek bir tüpte tek bir çalışma için birleştirin. Sonra pipetleme tarafından havuzlu kütüphaneler karıştırın.
Sıralama çalışması başlatmak için önce sıralama sistemine bağlı bir bilgisayarda Torrent tarayıcısını açın. Seçili uygulama için genel şablonu kullanarak ve kitler sekmesi altında Ion Proton sistemini veya Ion Gene Studio S5 sistemini seçin. Fiş türü açılır menüsünden uygun fişi seçin ve kitaplık kiti açılır listesinden Ion AmpliSeq 2.0 Kitaplık Kiti'ni seçin.
Şablon kiti için Ion Chef düğmesini seçin ve şablon kiti açılır listesinden uygun Şef Kiti'ni seçin. Sıralama kiti açılır menüsünden uygun sıralama kitini seçin ve barkod ayarlı açılır listeden Ion Express'i seçin. Eklenti sekmesinin altında, kapsama analizi eklentisini seçin.
Plan sekmesialtında, referans kitaplığı açılır listesinden GRCH37HG19 genomunu seçin. Hedef bölgeler açılır listesinden sıralanacak uygun paneli seçin. Ardından sıralanacak barkod sayısını ayarlayın ve her kitaplık için barkod adını ve örnek adını ayarlayın.
Havuzlu kütüphaneler seyreltme için, bir iyon proton çip ve pipet 50 mikrolitre her seyreltilmiş kütüphane için 25 picomolar konsantrasyonu nükleaz içermeyen su ile stok kütüphane seyreltmek uygun kütüphane örnek tüp altına. Havuzlu seyreltilmiş kütüphaneleri içeren örnek tüpleri kütüphane hazırlama sistemine yükleyin ve klonal amplifikasyonu başlatın. Yeni nesil sıralama için, enstrümanı başlatmayı izlemek için ekrandaki yönergeleri izleyin.
Klonal amplifikasyon bittiğinde, Ion Chef alet kapısını açın, ardından çip yükleme santrifüjünün kapağını açın ve iki yongayı kütüphane hazırlama sisteminden çıkarın. Talaşları ayrı talaş depolama kaplarına yerleştirin ve talaşlardan birini cihazdaki talaş bölmesine yükleyin. Sonra talaş bölmesinin kapağını kapatın ve sıralamaya başlayın.
Mutasyon analizi için, kapsama analizi eklentisini açın ve kapsama derinliğini ve tekdüzeliği doğrulamak için kapsama analizi çıktısını kullanın. Uygun olarak mikrop hattı veya somatik iş akışını seçerek varyant arama gerçekleştirmek için Torrent Variant Caller eklentisini kullanın. Sonra filtrelenmiş varyantları varyant çağrı biçimi dosyaları indirin ve türevleri açıklamayapmak için NCBI RefSeq veritabanında varyant etkisi predictor yazılımı kullanın.
Kopya numarası varyasyonlarını tahmin etmek için, iyon muhabiri yükleme eklentisini kullanarak dizilim verilerini iyon muhabiri yazılımına yükleyin ve verileri analiz etmek için kapsamlı kanser paneli tümör normal çifti iş akışını kullanın. Mutasyonları ve kopya numarası varyasyonlarını yazılım tarafından atanan puanlara göre el ile filtreleyin ve varyasyonları Tümleştirici Genomik Görüntüleyici ile görsel olarak doğrulayın. Daha sonra, kopya numarası varyasyonlarını doğrulamak için, belirli bir gendeki tüm amplicon'ların normalleştirilmiş kapsama alanını, temel çizginin normalleştirilmiş kapsamına karşı normalleştirilmiş kapsama alanı için sıra dışı okumalar için hizalamayı görsel olarak inceleyin.
Her olgu için, mutasyon normal doku veya kan veya primer tümör veya metastaz dizilimi çağrıları indeks. Mikrop hattı olarak işaretle ve mikrop hattı DNA'sının sıralama verilerinden de belirgin olan çağrıları atın. Belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşılan mutasyonları klonal veya kurucu olarak işaretle.
Daha sonra subklonal veya ilerleme veya belirli bir hastanın lezyonlarının tümlerinde değil, bazılarında tespit edilen mutasyonları işaretlayın. Bu temsili deneyde, kanserle ilişkili 409 genin kodlama dizilerini hedefleyen beş solid psödopapiller neoplazm olgusu multi-lezyon dizilimi sekiz gende toplam 27 somatik mutasyon tespit etti. Mutasyonlar, belirli bir hastanın lezyonlarının tümlerinde ancak tümlerinde saptandığında, belirli bir hastanın tüm lezyonları ile progressor veya subklonal lezyonlar arasında paylaşıldığında kurucu veya klonal olarak tanımlanmıştır.
Sürekli olarak, beta-katenin ve KMD6A için immünohistokimyasal boyama karşılık gelen genlerin mutasyonu olan olguların çeşitli lezyonları arasında homojendi. Mutasyona uğramış örneklerde KMD6A için ılımlı boyama genetik değişiklik proteinin ekspresyonundan çok fonksiyonu değiştirmek olasıolduğunu düşündürmektedir. Pankreas tümörlerinde fonksiyon KMD6A kaybı hipoksi belirteci GLUT-1 kadar düzenleme ile ilişkilidir.
Buna göre, GLUT-1 KMD6A mutasyonu taşıyan olgularda ifade edildi. BAP1 ve TP53 immünohistokimyası bu genlerdeki mutasyonların subklonal olduğunu doğruladı. Değiştirilmiş genlerin konumunu, yakınlığını ve kopya numarası durumunu gösteren temsili bir vakanın bu sanal karyotipinde, sıralama verilerini kullanarak kopya numarası varyasyon analizi, analiz edilen tüm örneklerde değişiklikler ortaya koymuştur.
Ve nokta mutasyonlarının aksine, kopya-sayı varyasyon değişikliklerinin çoğu subklonal idi. Mutasyonların ve kopya numarası varyasyonlarının doğrulanması ve indekslemesi ve tümörün normal DNA karşılaştırmasının kullanılması, sonuçları geçersiz kabilecek yapay çağrıların neslinden kaçınmak için önemlidir. Bu prosedür, farklı solid tümör tiplerinin lezyonu arasındaki mutasyonun belirlenmesi için tüm genomu sorgulamayı amaçlayan tüm genom dizileme çalışmalarına da uygulanabilir.
Kanser araştırma alanında, bu teknikler kişiselleştirilmiş ve etkili hedefli tedaviler tasarlamayı amaçlayan önemli klinik etkileri ile hastalıkların biyolojisini anlamak için kritik araçlardır.
