Bu çalışma Tıbbi Araştırma Konseyi ve Marie-Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon Hibe Programı (JKV için) tarafından desteklenmiştir.

1. CDNA İfade Klonlar Toplama <ol><li> CDNA kütüphanesi, bir 96-gözlü formata gliserol stokları tek bir bakteriyel klonlar olarak sağlanır. Norgen CP7200 ve seçici menüsünden Rearray komutunu kullanarak, bir 96-derin kuyu (1 ml de) plaka 1.5 ml LB / amp içine kaynak plaka ve inokülasyon bakteriyel klon almak. </li><li> Bir gaz-geçirgen keçe ile derin kuyu plakaları ve bir çalkalama kabında 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 2. CDNA İfade Kütüphanesi hazırlanması <ol><li> Bir masa üstü santrifüj plaka adaptör kullanarak 20 dakika 2.000 rpm&#39;de bakteri içeren derin kuyucuklu plakalar Spin. </li><li> Bakteriyel pelet zedelemeden, kuyulardan medya aspire. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi Lab otomasyon iş istasyonunun güverte yapılandırır. Plazmid hazırlama için çözümler 1-5 olukları içine dağıtılır ve derin kuyu plakası güverte üzerine yerleştirilir. Elüsyon çözeltisi ile bir oluk multiwellderin kuyucuklu plakaya bitişik yerleştirilir. İpuçları ucu rafları yüklenir. </li><li> Vakum manifoldunun birleştirin. Plazmid bağlayıcı levha manifoldu içine yerleştirildi ve plazmid filtre plakası manifold üstüne yerleştirilir. </li><li> Aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 250 ul Çözüm 1 (Tekrar Süspansiyonu tamponu) pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 250 ul Çözelti 2 (lizis tamponu) ilave bakterilerin bir parçalayıcı. Plaka mühürlü ve tam karıştırma sağlamak için ters çevrilir. </li><li> 2 dakika zamanlayıcı başlatın. </li><li> 350 ul Çözüm 3 (Nötralizasyon tamponu) ekleyin. Plaka Seal ve 3 kez ters. </li><li> Plazmid filtre plakalarına bakteri lizatları aktarın. </li><li> 5 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Filtre plakasını çıkarın ve manifold üstünde bağlayıcı plaka yerleştirin. 1 dakika için vakum uygulayın. </li><li> Ilave yıkama (AW) tampon 500 ul ekleyin. </li><li> 2 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Yıkama tamponu Çözüm 4 900 ul ekleyin. 2 dakika süreyle vakum uygulayın. </li><li> Tekrar s2.14 tep. Ek bir 15 dakika boyunca vakum uygula. </li><li> Manifoldundaki DNA toplama plakası yerleştirin. Bağlayıcı levha ile elüsyon tampon 100 ul ilave edin ve 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 10 dakika için vakum. </li><li> Nanodrop 8000 kullanarak toplama plakası ve ölçü DNA konsantrasyonu çıkarın. Tipik olarak ~ bir verimle 100 ng / ml &#39;den bu yöntem ile tahmin edilebilir. </li></ol> 3. Hücre Seeding <ol><li> HEK293 hücreleri tripsinize ve sayılır. </li><li> 2 x 10 4 hücre ThermoFisher 96-multidrop kullanarak bir Perkin Elmer Viewplate her oyuğuna dağıtılır. </li><li> Hücreler gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. </li></ol> 4. Transfeksiyon <ol><li> 25 ul serum içermeyen aracı madde içinde başına da 96-kuyulu yuvarlak dipli bir levha içinde 100 ng cDNA ile 100 ng GFP-Grb2 plazmid DNA bir karışım hazırlayın. </li><li> Kuyu başına 0.5 ul Transfectin içeren 25 ul serum serbest medya ekleyin. </li><li> Mix ve zamanlayıcı fo başlarr 30 dk. </li><li> Hafif bir dağıtma yöntemi kullanılarak hücrelere Transfectin / cDNA karışımı 50 ul aktarın. Alternatif olarak, transfeksiyon karışımı levhaları içine ilk olarak dağıtılır ve daha sonra hücreler üzerine ilave edilebilir (ters transfeksiyon). </li><li> 37 hücreleri gece boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li></ol> 5. Image Acquisition <ol><li> Opera yazılımını başlatın. Deney bir düzeneğin ekran görüntüsünü, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. &quot;Yapılandırma&quot; sekmesini seçin ve 20x objektif ve doğru plaka tipini seçin. &quot;Yaka&quot; olun farklı plaka tipleri ile odaklama sağlamak için objektif üzerinde doğru değere ayarlanır. </li><li> &quot;Mikroskop&quot; sekmesini seçin. Olarak FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak maruz tanımlama 1 UV (365 lazer). Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin. </li><li> &quot;Mikroskop&quot; sekmesini seçin. E tanımlayınUV (365 lazer) gibi FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak Xposure 1. Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin. </li><li> Pozlama 1 seçin. Yüksekliği 0 mikron odağı ayarlayın. &quot;Odaklama&quot; öğesini seçin. Bir kez odaklı, kamera 1. açığa. Pozlama düzlemi optimize etmek ve &quot;Al yükseklik&quot; üzerine tıklayın odağı yüksekliğini ayarlayın. ~ 3.000 maksimum piksel yoğunluğu vermek pozlama süreleri ve lazer güç değiştirin. Pozlama parametreleri kaydediniz. Pozlama 2 için tekrarlayın. </li><li> &quot;Experiment Definition&quot; sekmesini seçin. Düzen ve sublayout oluşturun. Sürükle ve ilgili düzeni, pozlama, referans görüntü, skewcrop dosya ve sublayout bırakın. Deney kaydedin. </li><li> &quot;Otomatik Experiment&quot; sekmesini seçin ve görüntüleri elde. </li></ol> 6. (ImageJ 1.46h sürümü dayanarak.) Görüntü Analizi <ol><li> Kullanarak özel PerkinElmer dönüştürün. Esnek dosyaları Tagged Image Format. Tif dosyasıFlex2Volocity Acapella komut. </li><li><ol><li> Bir yığın sonuçlanan bir görüntü dizisi gibi ImageJ görüntüleri aktarın. </li><li> Hyperstack menü öğesi Resim / Hyperstack / Stack seçerek 2 kanal hyperstack içine yığın dönüştürün. Dilim sayısı alınan yığının yarısı ile ayarlanmalıdır. </li><li> Resim / Duplicate komutunu kullanarak GFP kanalı çoğaltın: Yinelenen hyperstack onay kutusunu işaretleyin ve Kanallar belirtin: 1-1. Ahiret çoğaltılamaz yığın kullanın. </li></ol></li><li> İşlem Seçin / 0.01% doymuş piksel Kontrast Geliştir, yığın histogram kullanılarak ve Image/Type/8-bit ile 8 bit dönüştürmek. </li><li> Kontrast eşiği (Parametre 1) q = 30 ile Bernsen algoritması kullanılarak 15 piksel yarıçapı yerel uyarlamalı segmentasyon tanımlayın. Görüntü ayarla / / Otomatik Yerel Eşik menüsünde siyah arka plan onay kutusunu Beyaz nesneleri işaretleyin. </li><li> Segmentasyon kalite kontrol: orijinal görüntüler üzerinde segmante nesnenin kontur bindirme oluşturur. </li><li> Fonksiyonlarıparçacıklar analiz ederek ekstraksiyon re: Ölçüm alanı, demek ve her organel toplam yoğunluğu. Sonuç dosyaları kaydedin. </li><li> R özellikleri sonucu dosya açın ve bir histogram oluşturur. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Normal şartlar altında Grb2 tüm hücre boyunca lokalizedir. Bir büyüme faktörü reseptörünün uyarılması üzerine bunun plazma membranı ile tercüme ediyor ve Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi daha sonra endozomlar içine içsellestirildi. Bağlayıcı Grb2 yeteneğine sahip bir hücre yüzey reseptörü ifade translokasyon uyarmak için yeterlidir. Tipik bir tarama deneyinde, GFP-Grb2 yerelleştirme herhangi bir değişiklik gözlenmiştir. Ancak, bir protein ifade edildiği zaman, bir alt-hücresel siteye askerler Grb2, floresan mikroskobu ile kolaylıkla görülebilmektedir olabilir lokalizasyon bir değişiklik olduğunu. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında relokalizasyon içinde EGFR sonuçları örneği, ifade için (Şekil4). Bu nedenle, bir genom kitaplığı uygulanırken, bu yeni Grb2-bağlayıcı hücre yüzey proteinleri ile tespit edilebilir olması beklenebilir. Bu yöntem, hücre yüzey proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir. Örneğin, Dynamin2 GFP-Grb2 endosome gibi işe (Şekil 5) görüntüleme alt-hücre lokalizasyonu bir değişim olmaktadır. Dynamin2 Grb2 ve C-terminal domain SH3 bağlanır ve bu kompleks 9,10 endositoz yer almaktadır. Dolayısıyla, bu yaklaşım, genel protein bağlayıcı komplekslerin belirlenmesine olanak tanır ve SH2 etki için etkileşim ortak tanımlanması ile sınırlı değildir. Translokasyon birkaç farklı türde başka sitoplazmik veziküler yapı veya çekirdek için, endozomlar için, bu tür plazma membranına yerelleştirme olarak beklenebilir. Bu nedenle, tüm görüntüleri de göz tarafından kontrol edilmesi tavsiye edilir. Bununla birlikte, büyük kümeler tarama sırasında otomatik bir cDNAgörüntü analizi algoritması daha pratiktir. Bu durumda, algoritmalannın birleşiminin bu tür hücresel şekil değişiklikleri belirlemek için mekik nükleer ve genel morfolojik algoritmaları belirlemek için endozomlar, sitoplazma / çekirdek tespit belirlemek için nokta algılama gibi arzu edilen bir durumdur. Bu farklı fenotipik algılama yöntemlerinin kullanılması başka 11 daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> Şekil 1. Deney Genel düzeni. Deneme ayrıntılarının cDNA kütüphanesinin amplifikasyon ve hazırlık, ücretsiz açık yazılım ImageJ kullanılarak cDNA vektörler artı muhabiri yapıları, görüntü elde etme ve görüntü analizi transfeksiyon ile başlayan tam bir yüksek içerik tarama iş akışı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> FTecan Deck ŞEKIL 2. Yapılandırma. (1) sol tarafında, beş 100 ml olukları tamponları 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) ve A4 (100 mi) ile doldurulması gerekmektedir. Yalak A4 prosedürü sırasında bir kez yeniden doldurulması gerekir. (2) vakum manifoldu, bu örnekte pozisyon 14 üzerinde yer alır. (3) Bakteri peletleri ile derin kuyu plakası 25 ml Seyreltme Tampon maddesi ile elüsyon tampon teknesine sonraki pozisyonu, 30 üzerinde yer alır. (4) 8-kanal baş Disposable ipuçları pozisyonu 40 doldurulması gerekir kanallı kafa için sol tarafta ve ipuçları üzerinde ucu raflara yüklenmesi gerekiyor. Bu deneyde kullanılan Tecan FreedomEvo sıvı işleyici 500 ul şırınga ile donatılmıştır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> ŞekilOpera LX görüntü elde etme 3. Otomasyon. A) Yapılandırma sekmesini seçin (1). Deneme (2) için gerekli lazer çizgileri etkinleştirin. Görüntü elde etme (3) kameraları seçin. Deneme (4) plaka tipi ve objektif lens seçin. B) mikroskop sekmesini seçin (1). Işık kaynağı ve pozlama 1 (2,3) için pozlama süresini tanımlayın. Iyi birine odaklanın ve yükseklik (4) alabilir. C) Deney Tanım sekmesini seçin (1). Sürükle ve pozlama, skewcrop, referans, düzen ve sublayout dosyaları (2) bırakın. Sürükle ve deney dosya (3) bırakın. D) Otomatik Deneyi (1) seçin. Sürükle ve deneme dosyası (2) bırakın. Uygun barkod (3) ayırın. Start düğmesine (4) tıklayarak görüntü yakalama başlayın. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strocDNA ifadeye göre ng&gt; Şekil 4. GFP-Grb2 translokasyon. GFP-Grb2 bir transmembran büyüme faktörü reseptör ekspresyonu üzerine endosome benzeri yapılara baskın bir sitoplazmik yerleşim bölgesine yerleştirir ve akabinde endozomlar için içselleştirir. Sol tarafta, COS M6 hücrelerin mikroskop görüntüleri geçici GFP-Grb2 (üst) veya GFP-Grb2 artı EGFR (alt) ile transfekte olduğu gösterilmiştir. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında tehcir EGFR sonuçlarının Co-ifadesi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> Şekil 5. GFP-Grb2 cDNA indüklenen translokasyon örneği. Grb2-aracılı endositoz katılır GTPaz Dynamin2, endosome benzeri yapılar (daire) için GFP-Grb2 yerleştirir. Bu deneyde, GFP-Grb2 HEK293T hücreleri içine DNM2 ile birlikte transfekte edildi. 24 saat ve görüntüleri ope yakalanmaları sonrasında Hücreler Hoechst 33342 ile boyandıra LX. Bir yeşil (GFP) kanal görüş alanı ve UV (mavi; Hoechst 33342) görüntülenir.

<ol>
	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İfade klonlama gibi virüs reseptörleri ve kan hücre antijenleri 12 gibi yeni hücresel bileşenleri tanımlamak için geçmişte kullanılan bir güçlü bir araçtır. Burada, Grb2 bağlanan yeni varsayımsal sinyal iletim reseptörlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolü bir kaç kritik adımlar vardır. <ol><li> Otomatik plazmid hazırlanması için bu bakteriyel pelet tam olarak yeniden süspanse olması kesinlikle gereklidir. Bazı durumlarda, katı bir sallama adım ya da pipet ile daha ileri karıştırma dahil etmek için gereklidir. </li><li> Çözelti, 2 ve 3 eklendikten sonra, karışım tamamlanması önemlidir ve el ile ters mühürlü bir otomatik plaka çalkalayıcısı kullanımı çok daha etkili olduğunu bulduk. Bu DNA kesme yol açacak gibi pipetleme bu aşamada kaçınılmalıdır. </li><li> Bütün vakum adımda, bir sıvı tamamen boşaltılır sağlamak zorundadırplaka. Aksi takdirde, düşük verimler beklenmez. </li><li> Elüsyon sonra, o arındırıldı ve plazmid bağlayıcı plaka alt kısmında, su damlalarının oldukça yaygındır. Bu damlalar elüsyon plakasında toplanırken edilmesi gerekir, bu yüzden plazmid bağlayıcı levha dikkatli bir şekilde kaldırılır ve alt kısmında herhangi bir kalıntı dikkatli bir şekilde damla elüsyon için levha transfer edilmesi tavsiye edilir. </li><li> Transfeksiyondan sırasında kompleks oluşumunun zaman çok önemlidir. Biz genellikle 20-30 dk uymak. Daha kısa sürelerde tavsiye edilmez ise 1 saat kadar uzun kat, verimde bir azalma olmadan gayet iyi. </li><li> Mikroskopi için, büyütme seçimi önemlidir. Burada kullanılan Opera LX sisteminde, 20x çözünürlük yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yeterlidir. Yüksek çözünürlüklü görüntüler gerekiyorsa, nesnel hücrelerin istatistiksel olarak anlamlı numaralarını almak için değişti, ama olabilir, alanlar ve yüksek satın alma kez daha yüksek bir sayı gereklidir. Genel olarak, bu amaçkuyu başına yansıması en az 100 hücre elde etmek. </li></ol> Grb2 translokasyon tahlil EGFR kinaz aktivasyonu 6 küçük molekül inhibitörleri tanımlamak için diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. Bu durumda, EGFR, özellikle ligand plazma membranına Grb2 alımına yol ile aktive edilir. Bu etkileşimin bozulması sonra küçük molekül bileşikleri kullanılarak incelenebilir. Benzer bir şekilde, siRNA ekranlar EGFR-Grb2 sinyal ya da c-Kit veya eritropoietin reseptörü gibi diğer Grb2-bağlayıcı büyüme faktörü reseptörleri ile ilgili endojen genlerin tanımlanması için kullanılabilir, ki öngörülebilir. Bu nedenle, bu yöntem için birden fazla potansiyel uygulamalar vardır. Benzer bir yaklaşım, SHC, Gab veya IRS gibi diğer adaptör moleküller için GFP etiketli muhabiri sistemlere uygulanabilir. Memeli hücrelerinde bu hücre-tabanlı tahlil kullanarak bir büyük avantajı, fizyolojik rel kimlik olanak tanımasıdırTemiz su ve etkileşimleri. Tahlil protein kompleksi oluşumu için bir gösterge olduğunu, ancak daha da önemlisi, ilgili etkileşimler doğru alt hücresel yerinde takip edilmektedir. Bu bağlamda, bu yöntem bu tür maya iki-hibrid ya da in vitro tahlillerin gibi diğer protein-protein etkileşimi yöntemler kalıntıların üstesinden gelir. Bu dolaylı etkileşimleri aynı zamanda Grb2 alım neden olabilir ki, ancak dikkate alınmalıdır. Benzer şekilde, bağlayıcı ortakların transkripsiyonel up-regülasyonu cDNA ifadesi neden olabilir. Bu olasılıklar arasında ayrım için, doğrudan ve dolaylı bağlayıcı etkileri ayırt etmek için uygun ikincil deneyleri gerçekleştirmek için gereklidir. Sonuç olarak, GFP-adaptör molekül translokasyon tahlil genom taraması ve ilaç keşif uygulamaları için yüksek bir potansiyele sahiptir.

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> cDNA kütüphanesi </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gaz geçirgen keçe </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Plazmid Takımı </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Molecular Probes </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Hudson </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Özgürlük Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> Vakum manifoldu ile </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opera LX </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Büyüme faktörü reseptörleri tarafından sinyal iletimi proliferasyon ve farklılaşma korumak için hücreleri için gerekli olan ve sıkı kontrol gerektirir. Sinyal transdüksiyonu bir transmembran reseptörü ve alt sinyalleme kaskadını aktivasyonu için harici bir ligand bağlayıcı tarafından başlatılır. Mitojenik sinyalizasyon bir anahtar regülatör Grb2, enzimatik aktivite yoksun iki SH3 etki ile çevrili bir iç SH2 (Src homoloji 2) etki oluşan modüler bir proteindir. Grb2 bir bileşeni olarak N-terminal SH3 etki yoluyla GTPaz son-of-Sevenless (SOS) ile ilişkilidir. Grb2 ve SH2 etki dolayısıyla SOS-Ras-MAP kinaz sinyal kaskad reseptör aktivasyonu kaplin fosforile tirozin kalıntılar büyüme faktörü reseptörlerine bağlanır. Buna ek olarak, sinyalleme ve reseptör endositoz bir pozitif ya da negatif bir düzenleyici olarak Grb2 için başka roller tarif edilmiştir. Grb2 ve modüler bu bileşimin özelliği, reseptör ve iletimine çeşitli dayayabilirsiniz düşündürmektedirE 1-3 farklı yollar bir sürü boyunca sinyalleri. Burada açıklanan plazma membranına Grb2 alımı izler basit bir mikroskop testtir. Bu yeşil floresan protein alt hücresel lokalizasyonu (GFP) etiketli bir uyarıcı 4-6 yanıt Grb2 değişiklikleri ölçen bir test uyarlanmıştır. Böyle aktive Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör olarak Grb2 bağlamak Plazma membran reseptörleri (EGFR) plazma cDNA ifadesi üzerine membran ve daha sonra hücreye endozomal bölmelere taşınmaya işe GFP-Grb2. Grb2 in vivo protein kompleksleri tespit etmek için bu teknik, Grb2 alt-hücre lokalizasyonu değişikliklere göre bir genom yüksek içeriğine ekran gerçekleştirmek için kullanılabilir. CDNA ifade klonlar, transfeksiyon ve görüntü elde etme hazırlanması aşağıda ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. , Maya-iki-hy olarak protein etkileşim ortakları belirlemek için kullanılan diğer genomik yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Yapışıklıklara, bu yöntem, bir basit-tabanlı tahlil mikroskobu ile etkileşim alt-hücresel yerinde, memeli hücrelerinde protein komplekslerinin görüntülenmesine izin verir. Dolayısıyla böyle bir yerelleştirme şekilleri gibi nitel özellikleri, hem de etkileşim nicel gücü gibi değerlendirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning at JoVE.com

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında öngörülerde<em&gt; In vivo</em&gt; Protein bağlama ve memeli hücrelerinde protein komplekslerinin alt-hücre lokalizasyonu.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Görüntüleme.  University College London. Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında öngörülerde In vivo Protein bağlama ve memeli hücrelerinde protein komplekslerinin alt-hücre lokalizasyonu.

Video: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...