Bu çalışma NIEHS R01ES014470 (KMZ) tarafından desteklenmiştir.

Önce bu protokolü başlayan, doğum sonrası günlerde yenidoğan farelerin toplamak 1-3 koruma ve sıcaklık için özgün kafes yatak ile iç içe bir steril kap içinde (P1-3). Bu mikrogliyal verimi optimize etmek, bu protokol sayesinde hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir. Tam reaktif listesi için Tablo 1&#39;e bakınız lütfen. 1.. Aletleri, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması <ol><li> 10 ml / pup Mikroglia tam ortam maddesi (MCM hazırlanması; 1x Minimal Essential ile desteklenmiş Medium Earle [MEM]: 1 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat,% 0.6 v / v D-(+)-glukoz, 100 ug / ml Penisilin / Streptomisin (P / S),% 4 h / h cenin sığır serumu (FBS), 6 v / v% at serumu) ve her bir T-75 balonuna (1 şişe / yavru) eklemek, kapak ve yeri yatay olarak bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat boyunca dengelenmeye. O diseksiyon başlamadan önce bir şişe (ler) de bu ortamı dengeye için gereklidir. </li><li> Prepare, kısım ve sıcak diseksiyon (6 ml / pup) için 37 ° C su banyosu MCM ve hücre yeniden süspansiyon (2 mi / yavru) için ayrı bir konik tüp MCM halinde. Ve Kesme Media (DM; MEM 100 ug / ml ile takviye edilmiş P /: buz Kıyma Media (,, 100 ug / ml P / S, 0.01 M HEPES 3 ml / pup HBSS ile takviye MM) hakkında Hazırlama, kısım ve soğuk S, 2 ml / pup). </li><li> 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde boğulma yolu ile aşağıdaki cerrahi aletleri sterilize: makas # 1 (1; başını kesmek için), # 1 forcep (2; burun güvenli ve korteks kaldırmak için), makas # 2 (1; nonangled; açmak için kafa derisi ,) makas # 3 (1 meninksler kaldırmak için,), forcep # 2 (1;,) kafatası kaldırmak için forcep # 4 (2; # 3 (1 forcep) derisini çıkarmak için beyin dokusunu inceltmek için). Steril bir pad üzerinde kurumaya bırakın. </li><li> % 70 etanol ile yatay hava akımı iş istasyonu ve diseksiyon mikroskop aşağı silin. </li><li> Başını yakalamak için 2 steril, 100 mm Petri kapları içine DM dağıtın (3 ml, 1/3 yavrular çanak) ve diseksiyonu (1 ml;Diseksiyon önce buz üzerinde soğutulmuş); / yavru 1 tabak. Beyin dokusu (; 1 tabak / yavru 1 ml) kıyma için 1 steril, 100 mm Petri kabı içine MM dağıtın. </li></ol> 2. Beyin Dokusu Diseksiyon <ol><li> Ötenazi öncesinde, hafifçe bir laboratuar dokusu kullanılarak% 70 etanol ile boyun ve yavru başını sterilize. Makas # 1, hızla başını kaldırarak yavru euthanize; yakalama kafasını önce hazırlanan Petri kabındaki. Euthanize ve sonraki hayvana geçmeden önce bir yavru diseksiyon tamamlayın. </li><li> Soğutulmuş diseksiyon çanak kafa transferi, açık kafa derisi bir oluşturarak makas # 2 kullanarak; diseksiyon mikroskobu altında # 1 (alternatif olarak, kafa göz soket aracılığıyla forseps piercing tarafından güvence altına alınabilir) forcep kullanarak burun sıkarak başını sağlamlaştırmak Y-cut: kafa tabanından ve gözleri doğru bir açıyla başlar. Yavaşça kafatası açığa yanal soyulması ile kafa derisi kaldırmak için 3. forcep kullanın. </li><li> Forcep 3. kullanarak, yavaşça tabanının en bağ dokusu kaldırmakkafa. Kavrama,, kafatası tabanı (interhemisferik fissür aşağıdaki) beyin ve kafatası arasında forcep bir kolunu dizilerek, dikkatli, açık kafatası maruz kaldığında yavaşça açık gözyaşı yukarı kafatası çekin. </li><li> Forcep # 1 kullanarak beynin ventral tarafında küçük bağ dokusu bozabilir ve daha sonra aynı aracı kullanarak beyin kaldırmak. Beynin ventral tarafında altında yukarı doğru bir kuvvet kullanılarak kafatası dışına beyin kaldırın. </li><li> Anatomik pozisyonda beyin tutun: sırt tarafında diseksiyon mikroskop altında korteks görselleştirmek için yukarı bakacak, orta beyinde ve korteks kesiştiği forseps ipuçlarını takarak yerine beyin sağlamak için; tamamen forcep # 4 ile kortikal meninksler kaldırmak, sonra ventral meninksler kaldırmak için devam edin. Zarları tamamen çıkarıldıktan sonra, forcep # 4 ile beyin kalan kısmından ayırmak korteks. Tamamen mikroglia saflık ve yiel üst düzeye çıkarmak için zarı doku kaldırmak için gereklidird. </li></ol> 3. Beyin Dokusu Kıyma <ol><li> Transferi Korteksler önce yemek kıyma hazırlanmış; Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril tekniği kullanarak adımı kıyma devam ediyor. </li><li> Makas # 3 kullanılarak kıyma beyin dokusu, bir 15 ml konik tüp transfer kıyılmış doku,., Makas ve MM her 1 ml ile kıyma çanak durulayın toplamak ve kıyılmış doku içeren 15 ml konik tüp içine durulama dağıtmak Bu durulama adım maksimize edecek Tüm kalıntı doku konik tüpe aktarılır sağlayarak mikroglia verimi. Kıyılmış doku tüpün dibinde yerleşmek için izin, 1-2 dakika boyunca rahatsız doku süspansiyonu bırakın. MM gerekli besinleri içermez gibi 2 dk aşmayın. </li><li> Dikkatlice çıkarın ve yerleşmiş kıyılmış doku bozmak için değil bazı yapım, standart bir pipet ile jenerik 1.000 ul mikropipetöre ile 2ml&#39;si atın. </li&gt; <li> Kıyılmış-dokuya MCM 3 ml ekleyin, standart bir pipet ile bir jenerik 1.000 ul micropipettor kullanarak tam güçle doku çiğnemek trituration tamamlandığında hiçbir discernable katı doku kalmalıdır.. Pipet ucu kalıntı toz haline numune alınması, aynı pipet ucu ile MCM bir 3 ml ilave edilir. </li></ol> 4. Büyüyen Kortikal Hücreler <ol><li> Santrifüj hücreleri (215 xg, 5 dk; RT; sallanan bir kova rotor ile klinik santrifüj) pelet için kıyılmış doku. Biyolojik güvenlik kabini için pelet hücreleri dönün, kaldırmak ve süpernatant atılır; yavaşça hücre pelet (; MCM 2 ml / tüp); tekrar süspansiyon önceden hazırlanmış T-75 balona hücre tabanda ekleyin; şişesi kapağı ve içine yatay olarak yerleştirin , nemlendirilmiş, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2). Hücreler, 24 saat boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> 24 saat sonra, yavaşça bozmaya avucunuzda karşı şişeyi dokunundoku enkaz. Öncesi ve enkaz tümüyle kaldırılmasını sağlamak için dokunarak sonra hücrelerin kontrol edin. Set Şişe dikey, kaldırma ve ortam atılır; şişenin dibine yeni MCM ekle (12 mi, 37 ° C), kapağı ve yatay olarak geri inkübatör içine yerleştirin. </li><li> Kontaminasyon için günlük hücreleri kontrol ve büyümesini izlemek için. </li><li> In vitro (DIV) içinde yaklaşık 17-21 gün, Mikroglial hücreleri karışık glial kültür hasat için hazır olacak. Hücreler hazır olup olmadığını belirlemek için, bir ters faz-kontrast mikroskop altında hücrelerini inceleyen. Mikroglia hasat için hazır olduğunuzda% 40 confluency ~ at. Başka glia üstünde bir tek tabaka olarak büyüyen küçük, parlak, küresel hücreler olarak görünür. </li></ol> 5. Karışık Glial Kültür gelen mikrogliya İzolasyonu <ol><li> Mikroglianın ayırmak için, kuvvetli bir laboratuvar tezgah karşı şişesi dokunun. Bu ajitasyon mikroglia düşük yapışma özellikleri nedeniyle diğer glial hücrelerden ayrı mikroglia yardımcı olur. </li><li(; 37 ° C, 200 rpm, 5 saat). Parafilm ve karışık glial kültürlerin döndürmek&gt; ile Seal T-75 şişe kapakları sıcaklık kontrollü, nonhumidified döner karıştırıcı kullanılarak hücreler 5 saat daha uzun süre sallamak izin vermeyin gözle kontrol. bu mikroglia ters bir faz kontrast mikroskop kullanılarak, 5 saat sonra şişe yüzeyden kaldırdı. Mikroglia serbest yüzen hücreler, küre şeklinde, parlak. Astrositler ve şişenin dibine oligodendrosit yapışan bir kalıntı tabakası olacaktır. </li><li> Pellet mikroglia (215 x g,, 5 dak; kepçe rotor sallanan) süpernatantı steril bir konik santrifüj tüpüne mikroglia ihtiva eden ortam toplayın. </li><li> ~ 2,% 0.6 v / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 ug / ml P / S,% 5 v / v FBS 1 mM sodyum piruvat:; sıcak Mikroglial Büyüme Ortamı (MGM olarak mikroglial pelletini ile takviye edilmiş MEM ml / şişe), bir hemositometre kullanılarak, hücre konsantrasyonunu saptamak ve plaka 1 x 10, 24 oyuklu bir plaka biçiminde 5 hücre / gözplastik veya (500 ul / kuyu; MGM) steril cam kapak fişleri., bu prosedürü kullanarak ortalama mikrogliya verimi 7.5 x 10 5 hücre / yavru korteks. </li><li> 24-saat post-kaplama, yüzen hücreleri ve enkaz kaldırmak için taze MGM (37 ° C) ile medya ve tekrar çember yükleme hücreleri kaldırmak. Bu adım, hücrenin yaşamını ve sakin mikroglianın korumak için önemlidir. Hücreler hemen sonra refeeding deney için kullanılabilir. </li></ol> 6. Örnek Tedaviler <ol><li> Pam 3 CSK 4 (PAM) / ml, 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) ve araç kontrolü 10 ng hücreleri açığa, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 2 ya da 24 saat süreyle inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2). </li></ol> 7. İşlevsellik Ex vivo yoluyla Immunofluorescent Görüntüleme ve İmmünositokimya için mikrogliya Analizi <ol><li> Mikrofüj tüplerine (1.5 ml) ve centr tedavisi, hücre kültür ortamı hasat sonrasındamedyayı temizlemek için; ifuge bir masa mıkro (900 xg 2 dak) kullanarak. Temiz bir mikrofüj tüpüne süpernatant aktarın, tahlil derhal veya mağaza -20 ° C&#39;de kullanmaya hazır olana kadar. Ticari olarak temin edilebilen, fare TNF-α ELISA kiti ile hücre kültür tortusu içinde TNF-α konsantrasyonu analiz edin. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hücreleri yıkayın ve% 4, hücreler (ağ / hac) paraformaldehit /% 4 (ağ / hac) sakroz / PBS pH 7.4 (% 4 PFA, 15 dakika, RT). Tespit sonra, yumuşak bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak 5 dakika boyunca PBS ile yıkama hücreleri. <ol><li> İmmünofloresan / İmmünositokimya. Sabitleme ve PBS immünsitokimya için, süreç mikroglianın yıkayın. Nazik sallayarak ile yürütülen tüm adımlar. PBS/0.1% triton X-100 hücreleri geçirgenleştirmek, bir saat boyunca PBS/10% normal keçi serumu içinde blok hücreler. Ya da bloke edici tampon içinde tavşan anti-Gözler-1 antikoru (1/750), tavşan anti-NF-KB antikoru (1/1, 250 p65 alt ünite) ile 4 ° C&#39;de hücreler O / N inkübe edin. Görselantijen ize: floresan konjüge keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (1 saat, 1/1, 000) ile, inkübasyonu takiben antikor kompleksi. PBS/0.1% Triton X-100 (3 x 5 dk) ile yıkanarak bağlanmamış ikinci antikor çıkarın. </li><li> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol / PBS (DAPI; 0.1 ug / mL) ile leke hücreleri. Hücre çekirdeği görselleştirmek için CX3CR1-GFP + / türetilmiş tüm mikroglia - farenin GFP ifade eder. DAPI görselleştirmek için bir 350 nm dalga boyu filtre kullanmak; GFP görselleştirmek için bir 488 nm dalga boyu filtre ve 594 nm dalga boyu filtre p65 ve İba-1 immünokompleksler görselleştirmek için. </li></ol></li><li> Dağı kapak sulu montaj solüsyonu ve floresan mikroskop kullanarak mikroglianın görselleştirmek kayıyor. </li></ol>

<ol>
	<li>Ranshoff, R. M. P. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39, 151-170 (1990).</li><li>Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+&amp;#34;resident&amp;#34;+myeloid+cells:+The+case+of+the+microglia.">Development and homeostasis of &amp;#34;resident&amp;#34; myeloid cells: The case of the microglia.</a> Glia. 61, 112-120 (2013).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.+Nature+reviews.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews.</a> Immunology. , 11-775 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+free+radical+production+by+porcine+microglia.">Cytokine and free radical production by porcine microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).</li><li>Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+a+growing+family+of+immune+receptors+that+are+differentially+expressed+and+regulated+by+different+leukocytes.">Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes.</a> J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).</li><li>Lee, S. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+inflammation+in+the+CNS.">Toll-like receptors and inflammation in the CNS.</a> Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).</li><li>Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-mediated+neurotoxicity:+uncovering+the+molecular+mechanisms.">Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).</li><li>Halle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-beta.">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta.</a> Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Duewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasomes+are+required+for+atherogenesis+and+activated+by+cholesterol+crystals.">NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals.</a> Nature. 464, 1357-1361 (2010).</li><li>Stewart, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+ligands+promote+sterile+inflammation+through+assembly+of+a+Toll-like+receptor+4.">CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4.</a> 11, 155-161 (2010).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+Alters+Toll-Like+Receptor+Expression.">alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression.</a> Front. Neurosci. 5, 80 (2011).</li><li>Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+microglia..">Cytotoxicity of microglia..</a> Glia. 7, 111-118 (1993).</li><li>Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Amyloid+stimulation+of+microglia+and+monocytes+results+in+TNF+alpha-dependent+expression+of+induciblenitric+oxide+synthase+and+neuronal+apoptosis.">beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis.</a> J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).</li><li>Kim, Y. S., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia,+major+player+in+the+brain+inflammation:+their+roles+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).</li><li>Colton, C., Wilcock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+activation+states+in+microglia.">Assessing activation states in microglia.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).</li><li>Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+activates+microglia+to+enhance+the+production/secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF)+without+induction+of+deleterious+factors+in+vitro.">Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro.</a> J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li><li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+(NFkappaB)+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+(JNK)-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+(p38MAPK)-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+(TNFalpha)+induction+in+lipopolysaccharide+(LPS)-stimulated+microglia.">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson's+Disease+Protein+alpha-Synuclein.">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).</li><li>Minghetti, L., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+as+effector+cells+in+brain+damage+and+repair:+focus+on+prostanoids+and+nitric+oxide.">Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide.</a> Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).</li><li>Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+and+Parkinson's+disease.">Glial cells and Parkinson's disease.</a> J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+inflammation-mediated+neurodegeneration.">Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration.</a> Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).</li><li>Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+microglialinnate+immunity+in+Alzheimer's+disease+by+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).</li><li>Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease:+are+microglia+pathogenic+in+either+disorder.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder.</a> Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murinemicroglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigenpresentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

Yazarlar araştırma ilgi potansiyel bir çatışma şeklinde olabilir herhangi bir ticari veya finansal ilişkilerin yokluğunda yapılmış olduğunu beyan ederim.

Bu prosedür, neonatal farelerde kortikal mikroglia izolasyonu için etkili bir yöntem sunmaktadır. Bu prosedür, flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve ELISA ile tespit edildiği üzere, 1) koruyucu mikroglia immunfenotipik ve işlevsellik iki kat yararı vardır, ve 2) mikroglia önce diğer glial hücreleri (astrositler ve oligodentrocytes) varlığında, olgun izin glial kültür olgunlaşma döneminde önemli hücre-hücre etkileşimleri kolaylaştırabilir izolasyon. Önemlisi, izole hücreler ko...

Mikroglial hücreleri, CNS parankima gözetim makrofajlar, erişkin memeli beyin, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık olarak% 12 ihtiva eder. Mikroglia yolk kesesi miyeloid öncü hücrelerinden türetilen ve yetişkin CNS 1-5 içinde farklı bölgelerde cytoarchitectural hücre yoğunluğu ve morfolojik olarak değişmektedir. Sağlıklı bir yetişkin beyninde, mikrogliya ince, dinamik süreçleri ile, küçük dallanmış veya polar hücrelerdir. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme çalışmaları mikroglial işlemleri dinamik &quot;andıran bir şekilde uzanır ve mikro izlemek için geri göstermektedir; çevresel makrofaj morfolojisi aksine, mikroglia hücresel işlem olarak görünebilir sağlıklı beyinlerinde bir hareketsiz, düşük profilli bir fenotip göstermektedir örnekleme ve &quot;6,7 ölçme. Mikroglia geçiş, yüksek ve diferansiyel olarak beyinde çevresel ve patofizyolojik değişikliklere duyarlısırasıyla bir efektör devlet-genellikle kendi dinlenme olarak kabul ve aktif devletler, bir surveillant dan. Aktivasyonuna Bu anahtar, bu patojenle ilişkili moleküler kalıpları yanıt toll benzeri reseptörler (TLR), (PAMPs), yani bakteri ve viral türevli lipoproteinler olarak membrana bağlı görüntü tanıma reseptörleri (PRR) arasında takılma ile aracılık edilebilir , nükleik asitler, karbonhidratlar ve 8-11. PAMPs ek olarak, PRR&#39;ler, aynı zamanda, hücre hasarı 12-16 gibi CNS homeostatisinde sarsımına temsil tehlike / hasar ile bağlantılı moleküler kalıpları (DAMPS) olarak bilinen steril, patojenik olmayan moleküllere karşı, mikroglial aktivasyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir. Bir kez yerleştikten sonra PRR mikroglial hücre morfolojisi ve gen ekspresyonunda değişiklikler ile sonuçlanır bir hücre içi sinyalleme kaskadını başlatabilir, özel olarak ise, aktive edilmiş mikroglia bir amoeboid benzeri fenotip adapte hücre çekirdeğine NF-KB p65 alt ünitesi (p65) yerini değiştirmek ve upregüle süredenşeklinde gösterilmektedir ve bu reaktif oksijen türleri (ROS) 16-24 ile birlikte, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-1 β (IL-1β) gibi proenflamatuar sitokinlerin salgılanması. CNS&#39;nin doğuştan gelen immün yanıt olarak tamamlayıcı olsa da, bu salgılanan moleküller de bu şekilde, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi hastalık durumlarının 25-29 nörodejenerasyonu neden olan ve arttıran, nöronal oksidatif stres geliştirmek için bulunmuştur. Bununla birlikte, patolojik durumların mikrogliyal aktivasyonun mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Mikroglial aktivasyonun vivo özellikleri birçok kültür değinmeyecek olabilir Bu nedenle, mikroglia izolasyonu, bu biyolojik süreçlere güçlü bir araştırma aracıdır. Çeşitli yöntemler CNS doku 30,31 enzimatik sindirimi takip eden bir Percoll gradyanı ile izolasyon dahil olmak üzere, mikroglia, izole edilmesi için kullanılabilir. Bununla birlikte, enzimatik sindirim değiştirebilirAntijen ekspresyonu 32 hücre yüzeyi azaltılması ve burada tarif edilen yönteme göre, hayvan başına daha düşük hücre verimle sonuçlar ile hücrelerin immünofenotipi. Daha önce bir Percoll verim 3-5 x 10 5 hücre 30,33,34 yoluyla tüm CNS izolasyon yöntemleri rapor ederken Özellikle, biz, 7,5 x 10 5 hücre yavru korteksinde başına ortalama mikrogliya verim rapor. Bu prosedür, bu şekilde mikroglial immünfenotip ve işlevselliğini korumak, düşük-yapışma özelliklerine göre mikroglia izole edilmesi ile sindirim enzimlerinin aşılmaktadır. Döner bir karıştırıcı, daha önce bir uzantısına mekanik ajitasyon ile, ve C57BL / 6 faregiller korteks - Bu çalışmada, neonatal heterozigot CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /) türetilmiş karışık glial kültürlerinden mikroglial hücreleri izole edilmesini tarif 24,35 yayınlanan yöntem. Biz mikrogliya kolay görsellik için eski fare zorlanma kullanmak gibibir monosit spesifik promoter 36-38 - Bu farenin endojen CX3CR1 mahalinin kontrolü altında GFP ifade eder. Bu yöntem, bir korunmuş immünofenotipi ex vivo bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) veya Pam 3 CSK 4 ile meydan morfolojik değişiklikler, p65 nükleer translokasyonu ve TNF-α salgılanması ile gösterildiği gibi, TLR4 ve TLR1 / 2 agonistleri ile son derece saf bir kültür Mikroglial üretir sırasıyla.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &amp;deg;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30239.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Defined)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Earle&#039;s (MEM)</td><td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td>Without L-glutamine. Contains Earle&#039;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td>Without calcium and magnesium. Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-031</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Used to stain cell nucleus.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NF&amp;kappa;B (p65)</td><td>Abcam</td><td>7970</td><td>Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td></tr><tr><td>10 ml Disposable Serological Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Disposable Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Disposible Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6010</td><td>1; 5 in; used for removing head</td></tr><tr><td>Scissor: Vannas&lt;br/&gt; (scissor #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp</td></tr><tr><td>Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1; curved; used to mince brain tissue</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #7&lt;br/&gt; (forcep #1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>2; used to secure nose and remove cortices&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #2&lt;br/&gt; (forcep #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>1; used to remove scalp</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #3&lt;br/&gt; (forcep #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>1; used to remove skull</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #5a&lt;br/&gt; (forcep #4)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-21</td><td>1; used to remove meninges</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Specific Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoom Stereo Dissection Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ4060</td><td>Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td></tr><tr><td>Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-201-330</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3440001</td><td>Class II</td></tr><tr><td>Water-Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>VWR</td><td>97025-836</td><td>Set to 37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Swing-out buckets</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006441</td><td>To be used with Swing-out rotor</td></tr><tr><td>Swing-out Rotor</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006445</td><td>Max Radius: 19.2 (cm)</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge&lt;br/&gt; (clinical centrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>With swing-out rotor</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17 microcentrifuge&lt;br/&gt; (tabletop microcentrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S98645</td><td>With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

CNS dokusundan mikrogliya İzolasyonu ex vivo mikrogliyal biyolojisi okumak için kullanılan güçlü bir araştırma aracıdır. Mevcut yöntem, döner bir karıştırıcı, mekanik çalkalama ile neonatal murin kortekslerinden mikroglia izolasyonu için bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, mikroglia izolasyon verimi canlı içinde normal ve patolojik olmayan koşullarda sakin mikroglia göstergesidir morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini gösteren yüksek ölçüde saf bir kortikal mikroglia. Morfolojik değişiklikler, NF-KB (p65) bir p65 alt birimi nükleer translokasyonu ve ayırt edici özelliği pro-enflamatuar sitokin salgılanması, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α endüksiyonu ile gösterildiği gibi, bu prosedür, aynı zamanda mikroglial immünfenotip ve biyokimyasal özelliğe korur ), lipopolisakarid&#39;e (LPS) ve Pam 3 CSK 4 (Pam) zorluklar üzerine. Bu yüzden, bu izolasyon prosedürü ve hareketsiz acti hem de immünfenotip korurex vivo koşullarda mikrogliya biyolojiyi araştıran deneysel bir yöntem sağlayan çıkartılır mikrogliya.

Izolasyonu sırasında mikroglia ex vivo immunfenotipine ve işlevselliğini İstinat mikrogliyal biyoloji için bir soruşturma model olarak bu hücreleri kullanmak edebilmek için önemlidir. (- Ve C57BL / 6 CX3CR1-GFP + /) ve LPS veya Pam ya ile tedavi edilen kültürler, bu yöntem kullanılarak mikroglia immunofunctionality başarılı bir şekilde korunması göstermek amacıyla, P3 yenidoğanlardan kortikal mikroglia izole edilmiştir. Şekil 1A&...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates at JoVE.com

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Görüntüleme.  Georgetown University Medical Center.  Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikr...

Video: Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...