Este trabalho foi financiado pelo NIEHS R01ES014470 (KMZ).

Antes de iniciar este protocolo, recolher os ratos neonatal nos dias pós-natal 1-3 (P1-3) em um recipiente estéril aninhados com roupa de cama gaiola original para proteção e calor. É importante trabalhar com rapidez e eficiência através deste protocolo para otimizar o rendimento da microglia. Por favor, consulte a Tabela 1 para a lista de reagentes completa. 1. Preparação de instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Preparar 10 ml / filhote Microglia Meio Completo (MCM; 1x Essencial Mínimo de Meio Earle [MEM], suplementado com: 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 0,6% v / v D-(+)-glucose, 100 ug / ml penicilina / estreptomicina (P / S), 4% v / v de soro fetal bovino (FBS), 6% v / v de soro de cavalo), e adicionar a cada frasco T-75 (um frasco / cão); tampa e horizontalmente em lugar uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para se equilibrar durante 1 hora. É essencial para equilibrar este meio em frasco (s) antes de iniciar a dissecção. </li><li> Prepare, alíquota, e quente em 37 ° C MCM banho-maria por dissecção (6 ml / filhote de cachorro) e em um tubo cônico MCM separado para a ressuspensão celular (2 ml / filhote de cachorro). Preparar, alíquota, e frio em gelo trituração meios (MM; HBSS suplementado com: 100 mg / ml de P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / cão), e meios de dissecação (DM; MEM suplementado com 100 ug / ml de P / S; 2 ml / filhote de cachorro). </li><li> Esterilizar os seguintes instrumentos cirúrgicos por submersão em etanol 70% por 10 min: tesoura # 1 (1; decapitar), fórceps # 1 (2, para proteger o nariz e remover córtices), tesoura # 2 (1; nonangled; abrir couro cabeludo ), fórceps # 2 (1; remover couro cabeludo), fórceps # 3 (1, para remover o crânio), fórceps # 4 (2; remover meninges), tesoura # 3 (1; picar o tecido cerebral). Deixe secar ao ar em uma almofada estéril. </li><li> Limpe a estação de trabalho do fluxo de ar horizontal e dissecção microscópio com etanol 70%. </li><li> Dispensar DM em 2 estéreis, 100 milímetros placas de Petri para a captura de cabeça (3 ml, 1 prato / 3 filhotes) e dissecção (1 ml;1 prato / filhote; refrigerados em gelo antes da dissecação). Dispensar MM em um estéril, 100 milímetros placa de Petri para picar o tecido cerebral (1 ml, 1 prato / filhote de cachorro). </li></ol> 2. Tecido cerebral Dissecção <ol><li> Antes da eutanásia, higienizar suavemente pescoço e cabeça de cachorro com etanol 70%, utilizando um tecido de laboratório. Com tesoura # 1, eutanásia rapidamente filhote, removendo a cabeça, cabeça de captura previamente preparado em placa de Petri. Eutanásia e completar a dissecação de um filhote de cachorro antes de prosseguir para o próximo animal. </li><li> Transfira a cabeça para o prato dissecção refrigerados; sob microscópio de dissecação proteger a cabeça, apertando o nariz com pinça # 1 (em alternativa, a cabeça pode ser assegurada por piercing fórceps através do soquete do olho); couro cabeludo aberto usando tesoura º 2, criando um Y-cut: começar a partir da base da cabeça e em um ângulo em direção aos olhos. Use pinça n º 3 para remover suavemente couro cabeludo, descamação lateralmente, expondo o crânio. </li><li> Usando fórceps # 3, retire cuidadosamente tecido conjuntivo na base dacabeça. Quando a base do crânio é exposta crânio, cuidadosamente aberta enfiando um braço de pinça entre o cérebro eo crânio (após a fissura inter-hemisférica); aderência; puxe o crânio para cima para rasgar. </li><li> Disrupt tecido conjuntivo sob o lado ventral do cérebro usando pinça n º 1 e, posteriormente, remover cérebro usando a mesma ferramenta. Levante o cérebro fora do crânio, utilizando uma força para cima sob o lado ventral do cérebro. </li><li> Mantenha o cérebro em sua posição anatômica: Lado dorsal voltada para cima para visualizar os córtices sob o microscópio de dissecação; proteger o cérebro no lugar através da inserção de pontas de uma pinça na interseção do mesencéfalo eo córtex; remover completamente meninges corticais com pinça # 4, em seguida, proceder para remover as meninges ventral. Uma vez que as meninges foram completamente removidos, os córtices separar do resto do cérebro utilizando fórceps # 4. É essencial para remover completamente o tecido das meninges para maximizar a pureza e microglia yield. </li></ol> 3. Tecido Cerebral Picar <ol><li> Córtices Transferência para preparado previamente picados prato; continuar a picar passo usando técnica estéril na Classe II cabine de segurança biológica. </li><li> Tecido cerebral Mince usando tesoura # 3; transferência tecido picada de um tubo de 15 ml;. Lavar tesoura e picar prato com 1 ml de MM cada, recolher e distribuir lavagens para o tubo de 15 ml contendo o tecido picada Esta etapa de lavagem irá maximizar o rendimento da microglia, assegurando que todo o tecido residual é transferido para o tubo cónico. Deixe suspensão de tecido sem ser perturbado por 1-2 min, permitindo que o tecido picada para resolver na parte inferior do tubo. Não exceda 2 min como MM não contém nutrientes essenciais. </li><li> Cuidadosamente retire e descarte 2 ml de sobrenadante com genérico 1.000 mL micropipeta com uma ponteira standard, tornando certas para não perturbar o tecido picada resolvido. </li&gt; <li> Adicionar 3 ml de MCM para o tecido moído; tritura-se o tecido com força total usando um genérico 1000 ul micropipeta com uma ponta de pipeta padrão discernível n tecido sólido devem permanecer quando trituração é completa.. Adicionar mais 3 ml de MCM com a mesma ponteira, coletando amostra triturado residual da ponta da pipeta. </li></ol> 4. Crescer células corticais <ol><li> Centrífuga tecido picada para sedimentar as células (215 xg, 5 min; RT; centrífuga clínica com rotor basculante). Retornar células peletizadas para a cabine de segurança biológica, remover e descartar o sobrenadante; delicadamente ressuspender o pellet celular (2 ml / tubo; MCM); adicionar o ressuspensão celular para o T-75 frasco previamente preparado; tampar a garrafa e coloque-o horizontalmente em um humidificado, incubador padrão de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2). Permitir que as células a incubar durante 24 horas. </li><li> Após 24 horas, bata suavemente frasco contra a palma da mão para interromperrestos de tecido. Confira as células antes e depois de tocar para garantir a completa remoção de detritos. Conjunto de frasco vertical; remover e descartar media; adicionar MCM fresco para o fundo do frasco (12 ml; 37 ° C); tampa e volte a colocar na incubadora, horizontalmente. </li><li> Confira as células diariamente para a contaminação e para monitorar o crescimento. </li><li> Em cerca de 17-21 dias in vitro (DIV), as células microgliais estará pronto para a colheita a partir da cultura mista glial. Para determinar se as células estão prontos, examinar células sob um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia estão prontos para a colheita quando a ~ 40% de confluência. Eles aparecem como células esféricas pequenas, brilhantes, crescendo como uma monocamada em cima de outro glia. </li></ol> 5. Isolamento da microglia de cultura mista de glia <ol><li> Para isolar microglia, vigorosamente tocar frasco contra a bancada de laboratório. Esta agitação ajuda microglia separadas de outras células da glia, devido às propriedades de baixa aderência da microglia. </li><li&gt; Selo T-75 tampas de garrafa com Parafilm e girar as culturas gliais mistos (200 rpm; 37 ° C, 5 h). usando um agitador rotativo nonhumidified com temperatura controlada Não permitir que as células a tremer por mais de 5 horas Inspecione visualmente. que microglia ter levantado da superfície do frasco depois de 5 horas, usando um microscópio de contraste de fase invertida. Microglia são luminosos, esférico, de livre flutuação células. Haverá uma camada residual de astrócitos e oligodendrócitos que aderiram ao fundo do frasco. </li><li> Recolhe meios de sobrenadante contendo microglia em um tubo de centrífuga estéril cónica; microglia pelota (215 xg, 5 min; rotor basculante). </li><li> Ressuspender o sedimento em microglia quente Microglial Meio de Crescimento (MGM; MEM suplementado com: 1 mM de piruvato de sódio, 0,6% v / vglucose, 1 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de P / S, 5% v / v de FBS, 2 ~ ml / frasco), determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro, e a placa de 1 x 10 5 células / cavidade em um formato de placa de 24 poços emplástico ou deslizamentos estéreis tampa de vidro (500 mL / poço; MGM). Usando este procedimento, o rendimento médio microglia é de 7,5 x 10 5 células / filhote córtex. </li><li> 24 horas pós-chapeamento, remova todos os meios de comunicação e as células refeed com MGM fresco (37 ° C) para remover as células flutuantes e detritos. Esta etapa é fundamental para a sobrevivência da célula e manter microglia quiescentes. As células podem ser utilizados para a experimentação imediatamente após a realimentação. </li></ol> 6. Tratamentos Exemplo <ol><li> Expor as células a 10 ng / ml de Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / mL de lipopolissacarídeo (LPS) ou de controlo de veículo; incubar durante 2 ou 24 horas, numa incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 7. Analisando Microglia para Funcionalidade Ex vivo via Immunofluorescent Imagem e Imunocitoquímica <ol><li> Após o tratamento, meios de cultura de células da colheita em tubos de microcentrífuga (1,5 ml) e centrifuge usando uma microcentrífuga de mesa (2 min; 900 xg) para limpar a mídia. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo; ensaio imediatamente, ou armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Analisar a concentração de TNF-α em células de cultura sobrenadante através disponível comercialmente kit de TNF-α rato ELISA. </li><li> Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS), e fixar as células com 4% (w / v) de paraformaldeído / 4% (w / v) de sacarose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min; RT). Após a fixação, lavar as células com PBS durante 5 min com agitação suave num agitador orbital. <ol><li> Imunofluorescência / Imunocitoquímica. Após a fixação e PBS lavar, processo microglia para imunocitoquímica. Todas as etapas realizadas com agitação suave. Permeabilizar as células em PBS/0.1% de triton X-100, células de bloco em PBS/10% de soro de cabra normal durante uma hora. Incubar as células S / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-NF-kB (p65 subunidade, 1/1, 250) ou de coelho anti-Iba-1 do anticorpo (1/750) no tampão de bloqueio. Visualize antigénio: anticorpo a seguir à incubação com fluorescência de cabra anti-coelho conjugado anticorpo IgG secundário (1 hora, 1/1, 000). Remover o anticorpo secundário não ligado por lavagem com PBS/0.1% de triton X-100 (3 x 5 min). </li><li> Células contra mancha com 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindole / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). De visualizar o núcleo da célula Todos os derivados de microglia CX3CR1-GFP + / - ratos expressam GFP. Utilizar um filtro de comprimento de onda de 350 nm para visualizar DAPI; de um filtro de comprimento de onda de 488 nm para visualizar GFP, e um filtro de comprimento de onda de 594 nm para visualizar p65 e Iba-1 imunocomplexos. </li></ol></li><li> Monte lamínulas utilizando solução aquosa de montagem e visualizar microglia por microscopia de fluorescência. </li></ol>

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Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

O presente processo oferece um método eficaz para o isolamento da microglia corticais de ratinhos neonatais. Este procedimento tem um benefício duplo de 1) a preservação imunofenotipagem microglia e funcionalidade, como determinado por imagiologia fluorescente, imunocitoquímica, e ELISA, e, 2), permitindo que a microglia para amadurecer na presença de outras células gliais (astrócitos e oligodentrocytes) antes isolamento, o que pode facilitar as interações célula-célula importantes durante o período de matu...

Células microgliais, os macrófagos de vigilância do parênquima do SNC, compreendem cerca de 12% da população total de células de cérebro de mamíferos adultos. Microglia são derivadas do saco vitelino mielóides células precursoras que variam em densidade celular e morfologia em diferentes regiões citoarquitecturais dentro do SNC adulto 1-5. Em um adulto saudável do cérebro, microglia são células pequenas, ramificadas ou polares, com processos dinâmicos finas. Em contraste com a morfologia dos macrófagos periférica, microglia demonstrar um repouso, fenótipo de baixo perfil em cérebros saudáveis ​​que podem aparecer como inatividade celular, no entanto, estudos in vivo de imagens demonstram que processos microgliais estender dinamicamente e retrair para monitorar seu microambiente de uma forma que lembra &quot; amostragem e levantamento &quot;6,7. Microglia são altamente responsivos e diferencialmente a alterações ambientais e fisiopatológicos no cérebro, a mudançaa partir de um vigilante de um estados considerados como seu repouso e activado comumente no estado efectoras, respectivamente. Esta chave na ativação pode ser mediada por um envolvimento de receptores ligados à membrana de reconhecimento de padrões (PRRs), tais como receptores toll-like (TLRs), que respondem a padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), lipoproteínas nomeadamente bacterianas e virais derivadas , ácidos nucleicos, hidratos de carbono e 8-11. Além de PAMPs, PRRs também foram mostrados para induzir a ativação da microglia contra moléculas estéreis, não patogênicas, conhecidos como padrões moleculares perigo / associado a danos (amortece), que representam uma perturbação na homeostase do SNC, tais como danos celulares 12-16. Uma vez envolvido, PRRs iniciar uma cascata de sinalização intracelular, que resulta em alterações na morfologia celular e a expressão do gene da microglia, mais especificamente, a microglia activada adaptar um fenótipo amebóides semelhante, translocar o p65 de NF-kB subunidade (p65) para o núcleo da célula, e regula positivamente a producção e secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 β (IL-1β), juntamente com espécies reativas de oxigênio (ROS) 16-24. Embora integrante da resposta imune inata do sistema nervoso central, estas moléculas segregadas também foram encontradas para aumentar o stress oxidativo neuronal, induzindo e exacerbar a neurodegeneração em estados patológicos, tais como a doença de Parkinson e doença de Alzheimer 25-29. No entanto, os mecanismos de ativação da microglia em estados patológicos não estão completamente esclarecidos. Portanto, o isolamento de microglia é uma poderosa ferramenta de investigação para esses processos biológicos, como muitos em características in vivo de ativação da microglia pode ser reproduzido na cultura. Vários métodos estão disponíveis para o isolamento de microglia, incluindo o isolamento por meio de um gradiente de Percoll a seguir à digestão enzimática de tecido do SNC 30,31. No entanto, a digestão enzimática pode alterara imunofenotipagem de células por redução da superfície da célula expressão de antigénios de 32, e resulta na produção de células por animal menor do que o método aqui descrito. Especificamente, nós relatamos um rendimento médio por microglia filhote córtex de 7,5 x 10 5 células, enquanto anteriormente relatados métodos de isolamento de todo CNS através de um gradiente de Percoll rendimento 3-5 x 10 5 células 30,33,34. O presente processo evita a utilização de enzimas de digestão, isolando microglia com base nas suas propriedades de baixa aderência, preservando assim a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade. No presente estudo, descrevemos o isolamento de células microgliais de culturas mistas gliais derivadas de heterozigotos CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) neonatal e C57BL / 6 córtices murino via agitação mecânica num agitador rotativo, uma extensão do anteriormente método publicado 24,35. Nós utilizamos o ex-tensão do mouse para fácil visualização da microglia, comoestes ratinhos expressam GFP sob o controlo do locus endógeno CX3CR1 - um promotor específico de monócitos 36-38. Este método produz culturas microgliais altamente puros com um imunofenotipagem conservados ex vivo, como demonstrado por alterações morfológicas, a translocação nuclear de p65, e a secreção de TNF-α quando desafiados com o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ou Pam 3 CSK 4, TLR4 e TLR1 / 2 agonistas , respectivamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:233px;">Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">G8270</td>
			<td style="width:143px;">Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &#176;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15140-122</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">25030-081</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Fetal Bovine Serum (Defined)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:233px;">Minimum Essential Medium Earle&#39;s (MEM)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">15-010-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without L-glutamine. Contains Earle&#39;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">16050</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">21-021-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without calcium and magnesium. Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15630-031</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T-75 Flask</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">430641</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">D3571</td>
			<td style="width:143px;">Used to stain cell nucleus.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-Iba1</td>
			<td style="width:149px;">Wako</td>
			<td style="width:155px;">019-19741</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-NF&#954;B (p65)</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:155px;">7970</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A11012</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">10 ml Disposable Serological Pipet</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">13-678-11E</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">50 ml Disposable Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-8</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">15 ml Disposible Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-12</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Sterile Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">875713</td>
			<td style="width:143px;">100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td>
			<td style="width:149px;">Roboz Surgical</td>
			<td style="width:155px;">RS-6010</td>
			<td style="width:143px;">1; 5 inch; used for removing head</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Scissor: Vannas 
			(scissor #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">15000-08</td>
			<td style="width:143px;">1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91501-09</td>
			<td style="width:143px;">1; curved; used to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Forcep: Dumont #7 
			(forcep #1)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91197-00</td>
			<td style="width:143px;">2; used to secure nose and remove cortices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #2 
			(forcep #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11223-20</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #3 
			(forcep #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11231-30</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove skull</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #5a 
			(forcep #4)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11253-21</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table of specific equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Name of Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:143px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Zoom Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:155px;">SZ4060</td>
			<td style="width:143px;">Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Nuaire</td>
			<td style="width:155px;">NU-201-330</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Labconco</td>
			<td style="width:155px;">3440001</td>
			<td style="width:143px;">Class II</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:233px;">Water-Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>97025-836</td>
			<td style="width:143px;">Set to 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out buckets</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006441</td>
			<td style="width:143px;">To be used with Swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006445</td>
			<td style="width:143px;">Max Radius: 19.2 (cm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Sorvall Legend RT+ Centrifuge 
			(clinical centrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-377</td>
			<td style="width:143px;">With swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">AccuSpin Micro 17 microcentrifuge 
			(tabletop microcentrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S98645</td>
			<td style="width:143px;">With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; 
			Cat #: 75003524)&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

Isolamento de microglia de tecido do SNC é um poderoso instrumento de investigação utilizado para estudar biologia microglial ex vivo. O presente método de detalhes de um procedimento para o isolamento da microglia de córtices murino neonatal por agitação mecânica com um agitador rotativo. Esse isolamento microglia método produz microglia corticais altamente puras que apresentam características morfológicas e funcionais indicativos de microglia quiescentes em condições não patológicas normais in vivo. Este procedimento também preserva a imunofenotipagem da microglia e funcionalidade bioquímica como demonstrado pela indução de alterações morfológicas, translocação nuclear da subunidade p65 de NF-kB (p65), e a secreção de citoquina pró-inflamatória característica, fator de necrose tumoral-α (TNF-α ), ao lipopolissacarídeo (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam) desafios. Portanto, o processo de isolamento do presente preserva a imunofenotipagem de ambos quiescente e actimicroglia motivadas, proporcionando um método experimental de investigação de biologia microglia em condições ex vivo.

Mantendo a imunofenotipagem e funcionalidade da microglia ex vivo durante o isolamento é importante ser capaz de utilizar essas células como um modelo de investigação para a biologia da microglia. A fim de demonstrar a conservação bem sucedida da microglia immunofunctionality usando o presente método, foram isoladas a partir de recém-nascidos microglia corticais P3 (CX3CR1-GFP + / - C57BL / 6) e as culturas tratadas quer com LPS ou Pam. Como ilustrado na F...

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Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K visualizações.  Georgetown University Medical Center.  Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 