This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme <ol><li> Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap). </li><li> NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD 2 O ile lamelleri batırmayın. </li><li> Steril GKD 2 O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın. </li><li> Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri. </li><li> Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün. </li><li> Yaygın steril GKD 2 O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD 2 O bunları bırakın. </li><li> Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin. </li><li> Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD 2 O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık <ol><li> , 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir. </li><li> HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın. </li><li> İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml&#39;lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın. </li><li> Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki. </li><li> , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre. </li><li> 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin. </li><li> % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD 2 O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir. </li><li> Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın. </li><li> , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır. </li><li> Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin. </li><li> Tam steril GKD 2 O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm &#39;lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın. </li><li> Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim. </li><li> 3 güne kadar, 4 ° C&#39;de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın. </li></ol> 3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir. <ol><li> Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın. </li><li> Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına. </li><li> Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm. </li><li> Bir 60 ° C &#39;de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın. </li><li> Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm 2 microstamps. </li><li> Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps. </li></ol> 4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller <ol><li> 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon. </li><li> Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ &lt;200 nm) model-up yerleştirin. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir 1 cm&#39;lik 2 PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin. </li><li> Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga. </li><li> , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın. </li><li> Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır. </li><li> Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga. </li><li> Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır. </li><li> Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi. </li><li> Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın. </li><li> İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir. </li><li> Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi <ol><li> Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın. </li><li> 37 ° C&#39;de steril PBS ile 75 cm 2 kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız. </li><li> G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C&#39;de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de ve% 5. </li><li> Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin. </li></ol>

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM&#39;nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için...

Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem 1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası. ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere 2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın 6, 7 fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik 8, ya da plazma destekli teknikleri 9 micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar 10 oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların 11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) 15 popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir. PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının 16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile 17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer 18 varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV&#39;ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning 19 (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu. Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir. Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde. Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">UV/Ozone Photoreactor</td>
			<td style="width:71px;">Ultra-Violet Products</td>
			<td style="width:119px;">Model PR-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Rocking plate</td>
			<td style="width:71px;">IKAcWerke</td>
			<td style="width:119px;">Model KS 130 Basic</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">Model Vortex Genie2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Vacuum degassing chamber</td>
			<td style="width:71px;">Applied Vacuum Engineering</td>
			<td style="width:119px;">DP- 8-KIT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Stainless steel forceps with fine tip</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z225304-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dressing tissue forceps</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F4392-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes in polystyrene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5731-500EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminium foil, thickness 0.5&#160;mm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">266574-3.4G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopore membrane filter (0,2 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GTTP Filter code</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (22 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (25 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Variable volume micropipette</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z114820</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Protein microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel handles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2896-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2771-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cell culture flasks (75 cm2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430641</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z613983-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Polydimethylsiloxane&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acrylamide (powder)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3553</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N&#8217;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N-Hydroxyethylacrylamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">697931</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Amonium PerSulfate (APS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1805</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Human Plasma Fibronectin</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Laminin from EHS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Double-distilled water (ddH2O)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:71px;">Cells Applications</td>
			<td style="width:119px;">211K-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HEPES buffer solution 1M in H20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264-500ML-F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Antibiotics-antimycotics</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">P11-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H15-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phaloidin</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-vinculin antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V9131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-2762</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Fibronectin</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">F3648</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">41469</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin antibody</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">L9393</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3924-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459844-2.5L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir. Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.

Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml&#39;lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalı...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K Görüntüleme.  Université de Mons.  Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin. 

Video: Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Biyomühendislik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...