This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme <ol><li> Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap). </li><li> NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD 2 O ile lamelleri batırmayın. </li><li> Steril GKD 2 O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın. </li><li> Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri. </li><li> Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün. </li><li> Yaygın steril GKD 2 O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD 2 O bunları bırakın. </li><li> Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin. </li><li> Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD 2 O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık <ol><li> , 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir. </li><li> HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın. </li><li> İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml&#39;lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın. </li><li> Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki. </li><li> , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre. </li><li> 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin. </li><li> % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD 2 O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir. </li><li> Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın. </li><li> , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır. </li><li> Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin. </li><li> Tam steril GKD 2 O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm &#39;lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın. </li><li> Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim. </li><li> 3 güne kadar, 4 ° C&#39;de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın. </li></ol> 3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir. <ol><li> Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın. </li><li> Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına. </li><li> Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm. </li><li> Bir 60 ° C &#39;de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın. </li><li> Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm 2 microstamps. </li><li> Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps. </li></ol> 4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller <ol><li> 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon. </li><li> Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ &lt;200 nm) model-up yerleştirin. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir 1 cm&#39;lik 2 PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin. </li><li> Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga. </li><li> , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın. </li><li> Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır. </li><li> Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga. </li><li> Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır. </li><li> Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi. </li><li> Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın. </li><li> İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir. </li><li> Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi <ol><li> Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın. </li><li> 37 ° C&#39;de steril PBS ile 75 cm 2 kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız. </li><li> G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C&#39;de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de ve% 5. </li><li> Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin. </li></ol>

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM&#39;nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için...

Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem 1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası. ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere 2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın 6, 7 fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik 8, ya da plazma destekli teknikleri 9 micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar 10 oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların 11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) 15 popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir. PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının 16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile 17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer 18 varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV&#39;ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning 19 (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu. Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir. Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde. Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>UV/Ozone Photoreactor</td><td>Ultra-Violet Products</td><td>Model PR-100</td><td></td></tr><tr><td>Rocking plate</td><td>IKAcWerke</td><td>Model KS 130 Basic</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Model Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum degassing chamber</td><td>Applied Vacuum Engineering</td><td>DP- 8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel forceps with fine tip</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dressing tissue forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes in polystyrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil, thickness 0.5&amp;nbsp;mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>Isopore membrane filter (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Millipore</td><td>GTTP Filter code</td><td></td></tr><tr><td>Round glass coverslip (22 mm diameter)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>Round glass coverslip (25 mm diameter)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>Variable volume micropipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>Protein microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (powder)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-Methylenebis(acrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxyethylacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Amonium PerSulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from EHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Double-distilled water (ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth medium</td><td>Cells Applications</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA laboratories</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution 1 M in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics-antimycotics</td><td>PAA laboratories</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline solution</td><td>PAA laboratories</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phaloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vinculin antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td><td>Molecular Probes</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin (rabbit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin antibody (rabbit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir. Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.

Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml&#39;lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalı...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K Görüntüleme.  Université de Mons.  Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin. 

Video: Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biyokimya

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular stress and traction generation is currently unknown. Therefore, we present here a mechanics-based protocol to probe the influence of gap junction connexin 43 (Cx43) has on endothelial biomechanics by exposing confluent endothelial monolayers to a known Cx43 inhibitor 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) and measuring the impact this inhibitor has on tractions and intercellular stresses. We present representative results, which show a decrease in both tractions and intercellular stresses under a high chalcone dosage (2 &#181;g/mL) when compared to control. This protocol can be applied to not just Cx43, but also other gap junctions as well, assuming the appropriate inhibitor is used. We believe this protocol will be useful in the fields of cardiovascular and mechanobiology research.

Here, we present a mechanics-based protocol to disrupt the gap junction connexin 43 and measure the subsequent impact this has on endothelial biomechanics via observation of tractions and intercellular stresses.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Biyomühendislik

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Biyoloji

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Gelişim Biyolojisi

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

ECM Sertleşmesine Hücresel Tepkileri Araştırmak için Fototize Edilebilir Biyobaskılı Hidrojeller

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

Yazar Spotlight: 3D Baskılı Fototable Hidrojeller Kullanarak Kronik Akciğer Hastalıklarını Anlamak 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller