Bu çalışma Han&#39;a bir Lundbeck Gençler Grubu Lideri Bursu ile desteklenmiştir. PWW Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe fon desteği kabul eder. Biz Ayrıca disk mikroskobu iplik erişim için Güney Danimarka Üniversitesi Danimarkalı Moleküler Biyogörüntüleme Merkezi&#39;ni teşekkür ederim.

KICS analiz için plazma membranında EGFP-etiketli proteinlerinin kazanılması Epifloresans mikroskop, bir TIRF kurulum veya ilgi membran görüntüler elde etmek için ayarlanmış bir dönen disk mikroskop üzerinde yapılabilir. Görüntü kareleri arasında Kamera piksel boyutu hem de zaman analiz için gereklidir. 4-30 Hz çerçeve hızında 100-1,200 kare görüntü dizileri analizi için kullanılabilir. Edinimi sırasında, görüntüleme süresince odak membran tutmak ve floresans düzgün bir şekilde dağılmış olduğu düz bir zarın bir kısmı üzerinde odaklanmak için önemlidir. Kabarcıklara hareketli membran bölgeleri ve hücre organellerini çıkıntılı sonra analiz sürecinde dışarı kırpılmış olabilir. Hücrenin herhangi bir kayma ya da hareket olmadığı, böylece zaman alıcı seçilmelidir. MATLAB için kICS kod komut almak için, Paul Wiseman başvurun (Paul.Wiseman @ McGill.ca). İlk kez kICS kod, açık MAT kullanılırLAB ve dosyayı tıklatın, sonra da set yol, alt klasörler ile ekleyebilir tıklayın ve kICS kod bulunduğu bilgisayarda klasörü bulmak. Ardından ok tıklayın kaydedin ve kapatın. Şimdi önümüzdeki puan açıklanan ürünlerin analizi ile devam ediyor. 1.. TIFF Stack olarak Görüntüleme Analiz Programı içine İlgi görüntü sırası alma Stack1.tif: adı ile dosyayı kaydedin. <ol><li> Membran hareketli hücre organelleri hariç ve membran bölgeleri çıkıntılı düz kısmında ilgi alanları (ROI) dikdörtgen bir bölge seçin. Yeterli istatistik iyi k 2 araziler için oluşturulan böylece ekin boyutu seçilir. </li><li> Bölgeyi kırpın ve uygun bir klasörde TIFF dosyası olarak kırpma kaydedin. Aynı film çeşitli bitkiler varsa, örneğin &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot; bir sayı artışı kullanın. </li><li> Yerel bitkileri içeren klasörü yerleştirinbilgisayarda değil, bir sunucu üzerinde, kICS analiz yaparken. </li></ol> 2.. Analizi gerçekleştirin One tarafından Analizi Yazılım One&#39;a Bitkileri alma <ol><li> Komut penceresi ve basın açık MATLAB ve tip &quot;icsgui&quot; ENTER. ICS GUI görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programı için yürütülebilir adıdır. </li><li> ICS GUI &quot;kICS&quot; sekmesine tıklayın. Analiz penceresinin bir ekran görüntüsü, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Klasör adı &quot;MATLAB kod&quot; ile klasörünü bulun ve dosya adı &quot;Scripts&quot; ile dosyaya ilerleyin ve çift tıklayarak bu açın. Alternatif olarak, dosyaya sağ tıklayın ve &quot;MATLAB ile açmak&quot; veya dosyaya gidin, MATLAB açık ve komut dosyasını açın seçin. Bu dosya Editör denir. </li><li> Editör kaydırma &quot;Load kICS veri setleri&quot;, daha sonra komut satırına kopyalamak veya tipi dosya adı ve klasör konumu başlar içindeimg = örneğin &quot;: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif C&quot; ile. Örneğin [1:500] - klasör konumu altında komut satırında analiz edilecek kare sayısını ayarlayın. Veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullan. Odak kayması sonraki kare varsa, bu analize dahil edilmelidir. </li><li> Editör tıklatın &quot;kurtarmak&quot; ve ardından &quot;hücre değerlendirmek&quot; tıklayın. Veri kümesi şimdi analiz yazılımı yüklenir. </li><li> GUI kICS Analizi penceresinde, analiz için ayarları girin: <ol><li> &quot;T-hücresi&quot; kutuları unclick. </li><li> Giriş zaman sayısı analiz edilecek kalmaktadır. Gecikme süresi (τ) sayısı difüzyon arsa üzerinde etkisi olacaktır ve difüzyon arsa doğrusal şekilde seçilmelidir. 25 ile girerek başlayın ve daha sonra difüzyon arsa doğrusal olduğu için azalır. τ sayısı kICS analiz karşılaştırır zaman-gecikme ve bir gecikme zamanı between bir kare ve bir sonraki. Lineer bir çizgi veren küçük değer seçilmelidir. Süresi en fazla doğrusal uygun daha yüksek bir değer hat takılamaz bilgi verir seçimi, elde edilir, böylece seçilir kalmaktadır. </li><li> Maksimum k 2 değerini girin (Şekil 1 daire 1 bakınız), genellikle 20-50 olduğunu. İyi bir k 2 arsa bir hat boyunca dağıtılmış olan birçok veri noktası olduğu bir grafiğidir. 70 ile girerek başlayın ve daha sonra k 2 ve difüzyon araziler değerlendirilerek sonra azalma ve düşük değerini seçmek nerede düz bir çizgi etrafında veri noktaları küme. K 2 değeri Fourier uzayında mekansal k-vektörünün kare büyüklüğü. Iyi K 2 araziler: Başlangıçta, analiz iyi değerler belirleninceye kadar, daha sonra seçilmiş ayarları verilere iyi bir uyum vermesi kontrol her zaman veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullanabilirsiniz ama tekrar edilmelidirve lineer difüzyon arsa. </li><li> &quot;Store ayarları ve devam&quot; tıklayın. </li><li> Tüm grafikleri göstermek için &quot;evet&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Load görüntü serilerini&quot; (Şekil 1 daire 2 bakınız) tıklayın, ardından &quot;çalışma alanı&quot; tıklayın. </li><li> &quot;ImgSerCrop&quot; seçeneğini seçin, ardından &quot;Workspace al&quot; seçeneğini tıklatın. </li><li> Görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Kutu &quot;piksel boyutuna&quot; in görüntü yığınlarının satın alınan hangi görüntüleme sistemi için öngörülen piksel boyutunu girin. AQP3-EGFP&#39;nin için, 0.111 kullanılmıştır. Kutusuna &quot;çerçeveler arasındaki süreyi (ler) gir&quot;, 0,1150 AQP3-EGFP&#39;nin için kullanıldı. </li><li> &quot;1&quot;, ok tıklayın ve &quot;bütün görüntüyü kullanmak&quot; girin &quot;İB&#39;leri seçin&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> &quot;Do kICS analizi&quot; ni tıklayın ve &quot;hareketsiz filtreleme&quot; yapmak için tıklayın evet. Sonuçlar görüntüleri otomatik olarak açılacaktır. </li><li> Ayarlar penceresini minimize, hücre bilgi windo en aza indirmekw ve PHOTOPHYSICS penceresini minimize. Dinamikleri penceresinde, dinamik arsa veri noktaları korelasyon ve ücretsiz difüzyon kabul edilebilir, yani bir negatif eğimli bir çizgiye veri doğrusal bir uyum gösterdiğini kontrol edin. Belirli bir zaman gecikme için difüzyon katsayısı kaydedin ve 2 ayarları (bu uyum standart sapması dikkat etmek gerekli değildir) k. K 2 parsellerde veri noktaları gecikme belirli bir süre için hat etrafında kümelenmiş gerekir. </li><li> Tick ​​box &quot;görüntüler olarak açık rakamları kaydet&quot;, daha sonra neden dosyaları kaydetmek için &quot;görüntü olarak açık rakamları kaydet&quot; seçeneğini tıklayın. C altında yeni bir klasöre kaydet: Users Documents AQP3diffusion. &quot;Net güncel veri&quot; tıklayın ve bir sonraki ürün analizi ile devam ediyor. </li></ol></li></ol> Hesaplanan Difüzyon Katsayısının 3.. Ortalama Analiz Verilerin bir bakış Get Hesaplanır <ol><li> Bir spre her ROI bireysel difüzyon katsayıları girinadsheet (τ not ve 2 değerlerini k emin olun), yukarıda belirtilen ürünlerin adları kullanın. </li><li> Bir elektronik tablo programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısı ve standart sapma hesaplayın. </li><li> Kolmogorov-Smirnov testi veya öğrencilerin% 5 anlamlılık düzeyi kullanılarak istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için t-testi gerçekleştirin. Hücreler (örneğin, tedavi edilmeyen genel muamele edilmiş) arasında Niceliksel karşılaştırmalar yapılabilir. </li><li> Her ürün için analiz yazılımı tarafından üretilen ve her zaman lag için her durum için verileri ortalama difüzyon parsellerin elektronik tablo sürümünü açın. Gazetelerde veya sunumlarda sunmak için yeni bir ortalama difüzyon arsa üretmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu kağıt floresan proteinleri ile etiketli proteinlerin mikroskopi görüntüleri difüzyon katsayıları belirlemek için kICS analiz yöntemi uygulamak için nasıl ayrıntılı adım-adım bir bakış sundu. Analiz etiketleme yoğunluğunda çok geniş bir dinamik aralık ile prob seçimi bağımsızdır ve bu yüzden aynı zamanda Kuantum noktalarının yanısıra boyalar ve EGFP gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri uygulanabilir. Proteinler için geçerli difüzyon ...

Plazma zar proteinlerinin dört boyutlu uzaysal Organizasyon ve yanal hareket sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve protein fonksiyonu, aktivite ve protein-protein etkileşimleri, bir rol oynayabilir. Plazma zarı proteinlerinin yanal difüzyon, geleneksel kuantum nokta time-lapse görüntüleme gelen tek parçacıklar için difüzyon katsayılarını hesaplayarak veya etiketli plazma zarı proteinleri 2-4 boya tarafından incelenmiştir. Bu yaklaşım, protein katlanmasına ve işlevini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, bazı proteinler için elde edilemez kuantum nokta ya da boya etiketleme için plazma zar proteini, bir hücre dışı etiketi sokulmasını gerektirir. Kuantum nokta sterik hacmi, proteinin 5 difüzyonunu yavaşlatmak için ve ayrıca, popülasyondaki proteinlerin sadece çok küçük bir bölümü kuantum noktaları ile etiketlenir gösterilmiştir, ve bu fraksiyon toplam temsili ise bilinmemektedir plazma zarı proteinlerinin havuzu. Tek parçacık trakuantum dot etiketli proteinlerin görüntü dizisinden difüzyon katsayıları cking (SPT) ölçümleri haritalayan iki boyutlu Gauss olan parçacıkların görüntülenmiş zirve pozisyonları kapsamlı analizi algoritmaları ardından uyar içerir. Analiz açıklayan parçacık yörüngeleri içine mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (genellikle iki boyutlu uzamsal Gauss) ve partikül pozisyonları sonraki bağlayan yaklaşımları bir time-lapse dizisi her resim çerçevesi uydurma geniş doğrusal olmayan eğri gerektiren hesaplama çok yoğun tek moleküllerin 6,7 hareketi. Yakın zamanda geliştirilen görüntü korelasyonu tekniği, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) floresan plazma zarı etiketli proteinlerin difüzyon katsayılarının göreceli basit ölçümler sağlar. Rutin kICS tarafından floresan proteinleri ile etiketlenmiş membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını hesaplamak için olasılık tutan benzersiz bir araçtırGeleneksel kuantum üzerinde çeşitli avantajları SPT analizi dot: hücre dışı etiketleme alıcı dışı etiketleri ve zaman hiçbir ekleme (floresan proteinleri ifade hücre hatları kullanılabilir) gereklidir; difüzyon katsayıları kuantum noktaları ile etiketlenmiş bir alt ile karşılaştırıldığında floresan proteinlerin toplam miktarından çıkarılır; Analiz tek proteinler izlemek için gerek olmadan basit ve analiz ek kullanıcı programlanması için bir şartı ile olan bir kodu kullanarak gerçekleştirilebilir. Difüzyon katsayılarının hızlı hesaplama ve hesaplamayı sağlayan bir ortalama tekniktir çünkü yöntem hızlıdır. Protein nüfusun bu hızlı difüzyon ölçümleri özenli SPT yöntemlerle nüfusun bir alt kümesi için elde daha ayrıntılı moleküler taşıma bilgileri tamamlar. kICS sefer ilk Fourier uzayında dönüştürülmüştür floresan mikroskobu görüntü dizileri ilişkilidir ve böylece fl ayırırMoleküler ulaşım 1 dolayı olanlardan fotofizikten nedeniyle uorescence dalgalanmalar. Sonuç olarak, kICS, sayı yoğunluğu belirlemek akış hızı ve kompleks ışıkla ağartma ile ilgili olan ya da florofor yanıp sönen difüzyon floresan etiketli moleküller olabilir. Bu, hızlı bir şekilde özel kICS yazma algoritmalar için gerek kalmadan floresan etiketli hücre zarı proteinlerinin difüzyon dinamiklerinin belirlenmesi için uygun bir araç sağlar. Bunun yanı sıra floresan etiketli proteinler, kICS da kuantum dot-işaretli zar proteinleri 8 uygulanabilir. Bu kağıt kodu ve nasıl oluşturulan araziler, değerlendirmek için nasıl kullanılacağını, kırpma yerleştirmek için nasıl göstererek EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayıları ayıklamak için kICS kullanmak için nasıl bir adım-adım giriş sağlayan difüzyon itibaren katsayıları ayıklanır. Bir örnek olarak, yarı toplam iç yansıma disk mikroskopi dizi eğirme ile elde edilen veriler floresanEGFP&#39;nin ile etiketlenmiş bir böbrek su kanalı proteini aquaporin-3 (AQP3) ve nce (TIRF) modu, sunulmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) 1 doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar. İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir &quot;yamaçlarında yamaç&quot; oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.

KICS ile analiz edilmesi için uygun resim yığınları elde etmek için, farklı bir mikroskop sistemleri kullanılabilir. Bu bir epi-floresan mikroskop gibi bir TIRF veya dönen bir disk kurulumu görüntü dizileri analiz etmek mümkündür. Membran herhangi bir büyük hareketli hücre organelleri olmayan veya kesecikleri / hareketli nesneleri düz olmalıdır. Bu kağıt 9.2 Hz&#39;lik bir kare hızında plazma zarı ayarlanmış bir odaklanma ile dönen disk mikroskop görüntülü canlı MDCK hücrelerinde EGFP&...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Görüntüleme.  Aarhus University.  Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar. 

Video: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biyoloji

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Dijital Görüntü Korelasyon kullanma Vasküler Doku Örneklerinin Yerel düzensizliğin karakterize etmek

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...