Onların destek ve verimli tartışmalar için, ekibimizin üyeleri, teknik yardım için özellikle MC Blache yanı sıra M Irla ve B Imhof teşekkür ederiz. Deflasyon ve lohusalık ile ilgili rakamlar Doğa Yöntemleri izniyle çoğaltılamaz. Bu proje, CNRS, İNSERM ve Marseille Üniversitesi, ve Région Provence-Alpes-Côte-d&#39;Azur, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche (belirli hibe tarafından kurumsal hibelerle desteklenmektedir ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) ve Fondation pour la Recherche medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR Ligue Nationale Contre le Kanser bir burs ile desteklenmektedir.

Bu videoda, belirli bir membran reseptör hedefleyen kuantum noktaları kullanarak, tam bir tek parçacık izleme deneyi sunuyoruz. Bu deneyin temel amacı canlı hücrelerin plazma zarının içinde ölçülen moleküler difüzyon davranışları ayırt farklı tipte oluşur. Gerçekten de, membran ortaya çıkan moleküler hareketleri genellikle doğrusal olarak yönlendirilmiş veya örneğin nanodomains 26-29, içinde sınırlı kalarak Brownian difüzyon sapabilir. Biz canlı bir hücre zarı içinde meydana dinamikleri ortaya çıkan çeşitli bir anlık sağlamak için, aynı zamanda teknik olarak mümkün olduğunca çok sayıda reseptör olarak takip hedefliyoruz. Bu, nihai olarak hücre yüzey reseptörü sinyalleşme düzenleyen mekanizmalarının deşifre izin beklenmektedir. 1. Hücre Kültürü <ol><li> Hücresel örnek hazırlayın: endojen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) 30 ifade yapışık COS-7 hücreleri kullanır. Ne zamanantibiyotik hazırlanması sırasında her zaman uygun steril teknikleri kullanarak herhangi bir gizli alt saptanabilir kirlenme var emin olmadan canlı hücreleri ile çalışıyor. </li><li> Bunların sahip özen,% 7 CO 2 ile 37 ° C &#39;de, tam bir ortam (% 10 buzağı serumu ile DMEM,% 1 glutamin,% 1 HEPES ve% 1 sodyum piruvat, aşağıda özel reaktiflerin tablosu bakınız) hücre büyümesi Lab-Tek onları yayılmadan önce alt birleşmiş, üstel büyüme. </li><li> Gün deneyden önce, 8-kuyu odaları (Lab-Tek) in / de 5.000 hücreleri yayılmış ve bir gece inkübe edin. Hücrelerin sayılması, hücre başına kuantum nokta tekrarlanabilir bir oranı böylece sabit bir hücre yoğunluğu sağlar. </li></ol> 2. Hücre Etiketleme Özel bir kaplama ile kuantum noktalar hazırlayın. Kuantum-nokta yarıiletkenler oluşan floresan nanopartiküller vardır. Onlar klasik kıyasla çok parlak ve ışığa, çünkü bu nanopartiküller yüksek bir faiz sunmaktek bir molekül görüntüleme için gürültü oranı (SNR) için uygun bir sinyal başarı sağlayan floresan probların 31,32. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 21 deneyden önce, papain ile sindirim, hibridom hücre çizgisinden (mAb 108, ATCC HB-9764) gelen EGFR karşı Fab parçaları üretir. </li><li> Konjuge biotin ile Fab, üreticinin talimatlarına (EZ-link sülfo-NHS-LC-biyotinilasyon Kiti; Thermo Scientific, Şekil 1A.) Başı olarak. </li><li> 605 nm (hücresel otofloresans gelen parlaklık, algılama ve ayrılması için en uygun emisyon dalga boyu) streptavidin (Invitrogen) ve yayan ile fonksiyonelleştirilmiş kuantum nokta kullanın. </li><li> Kuantum nokta çevresinde Mevcut streptavidins yanı sıra, toplama ve hücrelere ve coverslip üzere spesifik olmayan bağlanma önlemek için doyurmak üzere, (spesifik reaktiflerin tablosu) tam medyum içinde etiketleme çözeltisi hazırlayın. </li><li> Iki ara çözümler hazırlayın:Kuantum-nokta-streptavidin biyotinile Fab ile başka biri, 20 nM her ile bir. </li><li> Bu iki çözüm eşit hacimde bir karıştırın: kuantum nokta kompleksi: 10 nM Fab son bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1:1 oranında Fab ile kuantum noktalar karıştırın. Eşmolar bir oranı kullanılarak bir kuantum-noktalı ve bir biyotinile Fab parçası oluşan mono-fonksiyonlu kompleksleri oluşumu birleştirmektedir. Bu reseptör 33,34 çapraz bağ nedeniyle artifakı gözlemler sınırlayıcı monovalan, etiketleme yanadır. </li><li> Agregasyonunu önlemek için dakikada 1200 dönüş bir çalkalayıcı kullanarak, 25 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. Karışımı canlı hücreler üzerinde kullanıma hazırdır. </li><li> 7% CO 2 ile 37 ° C de 5 dakika için karışımın 100 ul hücre inkübe. </li><li> Olmayan autofluorescent görüntüleme ortamı (HBSS tampon,% 1 HEPES, özel reaktiflerin tabloya bakınız) 37 önceden ısıtılmış ° C hücreleri yıkayın </li><li> Dikkatle un önlemek için etiket aşırı kaldırmakGerekli geniş görüntüleme ortamı, son yıkama önce en az 5 dakika gecikme ile oda sıcaklığında tipik olarak 5 kez, her iyi yıkayarak, odak dışında kuantum nokta, ilişkisiz tarafından SNR bozulmadan. </li></ol> 3. Optik Ayarı Video-mikroskopi kurulum dört ana bölümden oluşmaktadır: <ol><li> Belirli bir floresan küp (FF01-457/50 uyarma, FF495-DI02 dikroik ve FF01-617/73 emisyon filtreleri, Semrock) ve yüksek sayısal açıklık (1.3 veya 1.49) yağ immersiyon 100x amacı ile bir inverted mikroskop. </li><li> A 100 W civa lambası (termoregülasyon engel kaçınarak, bir fiber optik aracılığıyla mikroskop akuple). </li><li> Bir 512 x 512 piksel yüksek hassasiyeti yeterli SNR ulaşmak için kamera EMCCD. </li><li> Deney süresince 37 ° C&#39;de biyolojik örnekler tutmak için bir kuluçka. </li></ol> 4. Edinme <ol><li> Izole ve iyi yayılmış hücreleri seçin. Buiyi membran moleküllerini düzlemsel hareket aramak için adapte güzel, düz lamellipodia, uzatılması yanadır. </li><li> Iletilen ışık ve floresan hem de görünüşü ile hücresel fizyolojik durumunu değerlendirin: yoğun veziküler trafik, nekrotik ya da apoptotik işaretler, düşük otofloresans ve ortalama güçlü kuantum nokta etiketleme (genellikle hücre başına en fazla 1.000 kuantum nokta olmaması, bkz Şek. 1B, C). </li><li> Aynı anda mümkün olduğunca çok reseptörleri izlenmesi için kritik bir yüksek etiketleme yoğunluğu seçin. Bu aslında her ikisi tarafından fizyolojik (yüzey ekspresyonu, epitop erişilebilirlik, yanal hareket) ve algoritmik parametreleri (örtüşmeyen noktadan yayılan fonksiyonları (PSF), hatta uygun algılama ve yeniden bağlanma izin vermek için, hareket nedeniyle hesap bulanıklık dikkate alınarak). Sınırlıdır </li><li> Her hücre, önce daha fazla, hücre yönü kontrol izin veren bir aydınlık alan görüntüsü (varsa tercihen, DIC kullanarak) eldeve lamellipodia mekansal sınırları. </li><li> Bu sözleşmeler ile bu yana, dic adlı bir alt klasörde, video-yığını (örneğin örneğin cell1.tif &amp; cell1.stk gibi) aynı ismi kullanarak bu görüntüyü kaydet, algoritma otomatik olarak eşleşen görüntüyü bulabilirsiniz Her yığını. </li><li> Tipik olarak 36-ms oranı, bu fotoğraf makinesi ile full frame ulaşılabilir en hızlı oranda, sürekli hücre başına 1 ila 3 videoları edinin. Ancak bir artmış duyarlılık ve / veya daha az piksel ile özel CCD kullanarak, yukarı 1-ms oranı, yüksek frekanslarda edinebilirler. Çerçeve aktarım teknolojisi kareler arasında ihmal edilebilir bir gecikme sağlar. </li><li> Elektron çarpma geliştirme her zaman, en az 20 dB (verimli doruk tespit 1) Yukarıda, yeterli SNR, tipik olarak yaklaşık 25-30 dB tek bir molekül hassasiyeti ulaşmasını sağlamak için azami (sadece doygunluk altında, ilgili ise) olarak ayarlanmalıdır. </li><li> Genellikle video, günah başına 300 kare eldece yörüngeleri çoğunlukla uzun yanıp sönen olayları ile sınırlı ortalama ~ 100 kare üzerinde yeniden inşa edilir. Video frekansı ve uzunluğu, örneğin daha uzun izleri gerektirebilir verilen bir ölçüsüdür için adapte edilebilir. </li></ol> 5.. MTT Analizi <ol><li> Matlab veya Octave verilen bir veri kümesi değerlendirmek video dosyalarını içeren dizinin yolunu seçin. </li><li> Tam automatized analiz 1,35 başlatmak için, Matlab Octave, ya MTT23i, komut detect_reconnex23 yazın. Bu program &quot;kullanıcı arayüzü ile, sürüm 2.3&quot; anlamına gelir ve 2.2 önceki sürümü ile birlikte yüklenebilir. Şek olarak ilk olarak, kullanılan tüm parametreleri listeleyen bir grafik ara gösterir. 2. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar MTT otomatik olarak daha da tamamlanan tespit ve tahmin hedeflerinin izleri, teslim etmek, her kaydedici video analizgibi kapatılma algılama gibi vestigations. Bu sonuçta hücre görüntüleri (Şekil 1C &amp; 3) üzerinden haritalama izleri sağlar. MTT Açıklama Çekirdek MTT analizi 3 ana görevleri (Şekil 3) çağırarak, her kare üzerinde gerçekleştirilir: <ol><li> Sürgülü iki hipotez karşılaştırıldığında arda her piksel etrafında bir alt bölge içinde bir hedef (kuantum nokta), varlığı veya yokluğunun tespiti: PSF ile varlığını ya bir sinyal, bir iki boyutlu bir Gauss pik olarak modelized veya kare başına daha az bir sahte algılama ile, yeterince düşük yanlış alarm sigortalanması bir eşik kullanarak sadece gürültü. Bu tespit bir olasılık haritası yol açar. Her yerel maksimum onun olasılık seviyesinde Yanlış Alarm (PFA) istenen Olasılık göre ayarlanmış bir minimum değer, daha yüksek olduğunu sigortalanması, varsayılan bir hedef olarak kabul edilir. Bu sınır verimli sig ayrımcılık yeterince düşük ayarlıGürültüden nals hala tespit yeterince yüksek bir olasılık verirken teorik olarak tahmin edilen optimum ulaşan 1, en ​​iyi sahte tespitleri (varsayılan olarak 10 -6 PFA, 512 x 512 piksel görüntülerde daha az bir hata sigorta) de kaçınmak. Bir alt-bölge kullanarak şartı görüntü sınırlarının (7 x 7 piksel varsayılan pencere için 3 piksel) değerlendirilemez ima ettiğine dikkat edin. </li><li> Gibi alt-piksel konumu ve sinyal yoğunluğu olarak ilgili parametreler, her tespit edilen hedefin, Tahmin,. Her tespit edilen hedefin, bir en-kare Gauss-Newton uyum yanındaki tespit Gauss pozisyonunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için yapılır. Bu özellikle boyanın alt-piksel pozisyonlar (tipik SNR değerleri ve hareketsiz veya yavaş difüzyon boyalar için 10 ila 20 nm doğruluğu, 0.1 mikron 2 / s difüzyon boyalar için ~ 100 nm kadar artan) sağlar. </li><li> Ile yeni hedeflerin Reconnectionizleri zaten önceki çerçeve üzerine inşa. Yeni hedeflerin seti önceki izleri seti ile eşleşti. Bu amaç için, bir iz üzere her bir hedef tayin etmek için mümkün olduğunca, algılama adımda elde edilen mevcut tüm istatistiksel bilgi pozisyonu sadece, kullanılabilir, fakat, aynı zamanda yoğunluğu, genişliği, yanıp sönen ve ilişkili istatistikleri edilir. Bu nedenle, hedefler, sadece en yakın iz atanmamış: geçen izleri, yoğunluk, hız, genişlik ve yanıp sönmesi durumunda dikkate alınacaktır. Bu istatistiksel optimum yeniden bağlanma skoru sunar. Yakın komşularına karşı yeniden bağlanma kutuplama mümkün olduğunda, bu strateji, kaçınır. </li></ol> Tespit zirveleri kendi tahmin veya yeniden bağlanma başarısız olursa reddedilir sonradan olabilir. Özel bir test yeni izleri önerge sunacağını yeni zirveler tespiti, işler. Bu test, daha sıkı PFA (10 -7) kullanan bir iz için bir zirve yeniden bağlamadan yana bir doğrulama o gibi fiili yorumlanabilir<html> f alaka (bu kriter yeni zirveleri için geçerli değildir tanımı olmak üzere). Yörünge Analizi Olası geçici doğumdan sonraki ters yerel difüzyon 24-29 ile ilgili bir fonksiyon tarafından değerlendirilir. Bir eşik uygulamak bölüm sınırlı tanımlamak veya olmayan sağlar. Bütün izlerini üzerinden bu yineleme, biz geçici hapsetme açısından / olayları yavaşlatmak, membran dinamikleri eşleyebilirsiniz. Bu alternatif ikili veya doğumdan indeksi ayrık değerler kullanılarak temsil edilebilir. Varsayılan olarak, MTT otomatik olarak bir metin dosyasına 8 zirve kaydetme parametrelerini, bu görevleri gerçekleştirir: kare sayısı, i ve j konum, sinyal şiddeti, yarıçapı, ofset ve videonun her karesini (7 satır grubu) ve eser (sütun) için, yanıp sönmeye . Örneklendiği gibi bu çıkış parametreleri, Matlab veya Octave fazla yani izleri veya sinyal yoğunlukları analizi için fread_data_spt alfabeyi kullanarak tekrar edilebilir<html> Ekinde &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example komut. Ayrıca analizler her hücrenin üzerinde izleri eşlemek için (Şekil 1C &amp; 3) ve ilgili parametreleri (örneğin pik şiddetlerini, SNR veya yerel difüzyon değerleri gibi) için histogram dağılımını sağlamak için yol. Her dosya için, ortalama ve her parametrenin standart sapma histogramlarının bir görüntü ile birlikte, bir metin dosyasına kaydedilir. Böyle r 2 kare yer değiştirme gibi Logaritmik dağılımları, geometrik ortalama yol açar. Difüzyon katsayısı D MSD eğrisinin ilk beş puan üzerinden bir doğrusallaştırma hesaplanır. Bu değerler, hücresel reaksiyonlar veya membran organizasyonu etkileyen ilaç / enzimatik tedavilerin örneğin kinetiği için içeren bir deney genel bir bakış sağlar. MTT bir açık kaynak kodu olduğu için, bu yönü kolayca herhangi bir özel soruşturma adapte edilebilir. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1.. MTT ile membran reseptörleri dinamikleri izlenmesi. Gibi EGFR (A) Membran bileşenleri, olan biyotinile Fab parçaları (her molekülün yaklaşık olarak doğru ölçeklendirme ile şematik çizim) ile birleştiğinde kuantum nokta ile etiketlenmiş. (B) Tipik floresan görüntüyü tek tek etiketli reseptör karşılık kırınım-sınırlı zirveleri gösteren, 36-ms pozlama süresi ile, canlı bir COS-7 hücre elde. (C) MTT analiz çıktısı hücrenin aydınlık görüntü üzerinde kaplanmış reseptörlerinin rekonstitüe yörüngeleri, görüntülenmesi. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. MTT giriş parametreleri. MTT23i Koşu olarak bizim daha önceki yayın 1 açıklanan tüm giriş parametreleri, adları ve varsayılan değerleri listeleyen bir grafik kullanıcı arayüzü açılır. Algoritması, uzay ve zaman parametreleri (arama pencereler, tepe çapı, maksimum difüzyon<html> ve yanıp sönen) boyutsuz standart birimleri, piksel ve çerçeveler bulunmaktadır. Kalibrasyon çıkış sonuçlar dönüştürmek için sonradan uygulanabilir. 156 nm / pxl ve çerçeve gecikmesi: 36 ms / çerçeve 100x büyütme ile Cascade 512BFT karşılık Varsayılan değerler, piksel boyutu vardır. Müfettişler bu beklenen maksimum difüzyon katsayısı (&quot;Fark max&quot;) ve maksimum yanıp yok (&quot;T kapalı&quot;) gibi birkaç kritik parametreleri, optimize gerekir. Bu iki uzay ve zaman sınırları hemen hemen belli bir deneysel durum için, diğerleri sağlam varsayılan değerlerine ayarlı yeniden ele alınması gereken tek olanlardır. Örneğin, yanlış alarm sayısını doğrudan çoğu durumda tatmin edici kare başına bir daha dolayısıyla daha az milyon piksel başına daha az bir hata sağlamak için ayarlanır. Tüm parametreler kullanıcılar analiz için kullanılan hangi ayarları daha sonra doğrulamak için izin çıktı klasöründe bir metin dosyasına kaydedilir. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 3 &quot;/&gt; Şekil 3. MTT analizi önemli adımlar atıldı. Floresans görüntülerin deneysel bir yığın başlayarak, zirveleri sırayla ve otomatik olarak algılandı, bir Gauss uyum ve çerçeveler üzerinden yeniden (operasyonlarının ilk aralığı, akış şeması üst kısmı) tarafından tahmin edilmektedir. Izleri daha sonuçta ilgili tanımlayıcıları (operasyonların saniye aralığında, alt kısım) ile dinamik bir haritası yol açan, örneğin olası sınırlandırıcı için analiz edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Etiketleme değerlik MTT etkilemez. Artefactual multivalan etiketleme ile getirilen olası yanıltıcı değerlendirmek için, MTT analizi yörüngeleri haritaları oluşturmak ve analiz etmek için, 2 farklı şemaları kullanarak tagged endojen EGFR izlemek için yapıldı. Protokolü açıklandığı gibi (A) Reseptör, biyotin Fab ve kuantum-dots605-streptavidin etiketlenen.Bu durumda, kuantum-noktalar ve streptavidins bir çok-değerliği tek bir boya için birçok reseptör birleştirme ile sonuçlanabilir. (B) reseptörleri doğrudan organik bir boya, Atto647N akuple Fab etiketlenmiş edildi. Bu durumda, bir Fab, dolayısıyla bir reseptörü, birden fazla boyası ile bağlanabilmektedir. (C) kare yer değiştirme (MSD) eğrisi kuantum nokta veya ATTO boyalar (sol ve sağ grafikler, sırasıyla) ile ya etiketli, her hücre için tüm izleri için hesaplanmıştır ortalama. Difüzyon katsayıları MSD (kırmızı noktalı çizgi) beş ilk puan üzerinden doğrusallaştırma tarafından hesaplanmıştır. Benzer difüzyon değerleri (merkez grafik) neden etiketleme Her düzen. Qdot: kuantum dots605 (n = 5 hücreleri), ATTO: Atto647N (n = 7 hücreleri), ns: anlamlı değildi (Student t-testi p&gt; 0.05).

<ol>
	<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).</li><li>Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+molecule+diffusion.">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).</li><li>Lommerse, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+the+H-ras+membrane-anchor+reveals+domains+in+the+cytoplasmic+leaflet+of+the+cell+membrane.">Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane.</a> Biophys. J. 86, 609-616 (2004).</li><li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+in+the+plasma+membrane:+how+to+combine+fluidity+and+order.">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).</li><li>Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+dynamics+of+glycine+receptors+revealed+by+single-quantum+dot+tracking.">Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li><li>Harms, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+l-type+Ca(2+)+channels+in+live+cells.">Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells.</a> Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).</li><li>Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+imaging+of+green+fluorescent+proteins+in+living+cells:+E-cadherin+forms+oligomers+on+the+free+cell+surface.">Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface.</a> Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).</li><li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+EGFR+signalling+on+the+surface+of+living+cells.">Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells.</a> Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).</li><li>Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+lipid+microdomains+in+a+muscle+cell+membrane+visualized+by+single+molecule+microscopy.">Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy.</a> Embo. J. 19, 892-901 (2000).</li><li>Seisenberger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+imaging+of+the+infection+pathway+of+an+adeno-associated+virus.">Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus.</a> Science. 294, 1929-1932 (2001).</li><li>Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+fluid+mosaic+model+of+membranes.">Revisiting the fluid mosaic model of membranes.</a> Science. 268, 1441-1442 (1995).</li><li>Saffman, P. G., Delbruck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brownian+motion+in+biological+membranes.">Brownian motion in biological membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Papoulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , (2001).</li><li>Van Trees, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).</li><li>Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mountains+yield+nanoscale+cell+images.">Single-molecule mountains yield nanoscale cell images.</a> Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Andrew, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies.">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li><li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e., Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories.">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+effects+of+corrals.">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li><li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane.">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li><li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis.">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tek parçacık izleme, hücre ve mikroskop yönleri yanında, analiz çalışmalarının önemli bir bölümünü temsil eder. , Tespit tahmin ve her kare üzerinde zirve reconnecting: Bu üç ana görevleri gerçekleştirmek için kullanılan algoritma giderir. Ama bu işin sonucu yönü son, ekstra adımlar (örneğin, hareket tarzları, etkileşimleri veya stokiyometri deşifre gibi) için aslında herhangi bir yeni özel soruşturma için adapte edilmesi gerekebilir algoritması kendisi, tertipleyerek bulunur. <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> COS-7 hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5.000 hücreler / kuyu </td></tr><tr><td> Ca 2 olmadan HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> % 0.05 Tripsin EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Lab-Tek 8-iyi </td><td> Nunc </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Tinile Fab (Fab sentezi için, referans 21) </td></tr><tr><td> MAb 108 den Fab </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 mikrogram </td></tr><tr><td> NHS-Biotin<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18.5 mikrogram </td></tr><tr><td colspan="4"> Orta tamamlayın </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Görüntüleme orta </td></tr><tr><td> Ca 2 ile HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 ul </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Referans </td></tr><tr><td> Inverted mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Floresan lambası </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1.3 NA 100x objektif </td><td> Nikon </td><td> Fluor 1.30 planlayın </td></tr><tr><td> 1.49 NA 100x objektif </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1.49 </td></tr><tr><td> Kamera </td><td> Roper Bilimsel </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Termostatlı kutusu </td><td> Yaşam Görüntüleme Hizmetleri </td><td> Kutu </td></tr></tbody></table> Ek: MTT ek analiz örneği script fonksiyonu MTT_example (file_name) MTT çıkış sonuçlarını nasıl kurtarılacağını gösteren%%% Temel örnekleri %%% Her trac çizmek içine ve histogram oluşturmak için Floresans yoğunluğu%%% nargin &lt;% 1 eğer hiç file_name sağlanmaktadır? Dosyaları = dir (&#39;* stk.&#39;); Boşsa (dosya), disp (&#39;simdiki veri yok&#39;), dönüş, sonu ise . file_name = dosya (1) adı;% varsayılan: İlk stk dosyası disp ([&#39;varsayılan&#39; file_name &#39;kullanarak&#39;]) son file_param = [file_name &#39;_tab_param.dat&#39;];% çıktı dosyası %% Yük verileri versiyonuna göre bir CD (&#39;output23&#39;)% veya (&#39;output22&#39;), kullanılan % Yasal Uyarı: sürüm 2.2, sadece 7 parametre üretir % Ekstra bir parametre, gürültü, sürüm 2.3 &#39;de eklendi Tek bir tabloda, aynı anda tüm parametreleri okumak için% % Tab_param = fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (02:08: sonunda :); tab_j = ... Ayrı tablolarda tüm parametreleri (frame_number hariç) okumak için% % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); eser sayısı ve kare sayısı, bilgilendirici olmayan, atılır, çünkü% dizini 3&#39;tür! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); Iz üzerinden%% Döngü N_traces = boyut (tab_i, 1); % Tablolar N_frames kolon tarafından N_traces hatları N_traces: ITRC = 1 için No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0; sadece% dışı yanıp adımları arsa (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (piksel)&#39;), ylabel (&#39;j (piksel)&#39;) başlık ([&#39;iz #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;sonraki izleme için herhangi bir tuşa grev Lütfen&#39;), duraklatma son %% Fluo histogram N_datapoints = sum (tab_blk (:)&gt; 0);% dışı yanıp adımlar yalnızca 2sqrt (N) kutuları kullanılarak geçmiş (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% xlabel (&#39;yoğunluğu (au)&#39;), ylabel (&#39;olay&#39;) title (&#39;parçacıkların floresans şiddetinin histogram&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

Amacımız farklı biyolojik fonksiyonları hücre zarının meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir açıklaması elde etmektir. Çoklu Hedef İzleme (MTT) 1: Biz yüksek yoğunlukta Tek Parçacık Takibi (SPT) adanmış analitik araçları geliştirerek, tek-molekül düzeyinde karmaşık organizasyon ve plazma zarı dinamikleri karakterize hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik 1-11 çözünürlük sunan tek-molekül videomicroscopy, doğru, hücre reseptörlerine lokalizasyonu, mobilite, tutuklama veya etkileşimleri gibi tanımlayıcılar eşleyerek membran organizasyonu 12-14 ayrıntılı bir temsilini sağlar. Biz hem deneysel hem de algoritmik, SPT gözden. Deneysel açıdan moleküler dinamik dinamik bir anlık sağlamak için, mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğu ulaşan özel bir vurgu ile, kurulum ve hücre etiketleme optimize dahilHepsi bu zarının içinde oluşur. Tepe algılama, tahmin ve yeniden bağlanma, görüntü analiz 15,16 belirli araçları tarafından ele: Algoritmik sorunları yörüngeleri yeniden inşası için kullanılan her adımı ilgili. Algılama sonra deflasyon Uygulama tahlisiye zirveleri başlangıçta komşu, güçlü zirveleri tarafından gizli sağlar. Not olarak, algılama geliştirerek doğrudan yörüngeleri içindeki boşlukları azaltarak, yeniden bağlanma etkiler. Performans genellikle yüksek zamanmekansal çözünürlükte paralel ölçümleri için iki büyük sınırlama temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri, Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir. Photoswitching veya non-lineer optik on / off ya arda kullanarak, tek moleküllerin için elde edilen nanometrik doğruluk 17, ayrıntılı gözlemler sunabilirsiniz. Bu tür 17 STORM 18, PALM 19,20, 21 ya da RESOLFT 22,23 STED, WHI olarak nanoscopy yöntemlerin temelich genellikle görüntüleme sabit örnekleri gerektirebilir. Merkezi görevi tek moleküllerin kaynaklanan kırınım-sınırlı pik tespit ve tahmin edilmesidir. Bu yüzden böyle Brown hareketi yerine sürekli bir pozisyon hassasiyetini ele almak gibi yeterli varsayımlar sağlayarak, MTT ve sade bir dille Ortaölçek analizleri için uygundur. Dahası, MTT temelde herhangi bir ölçekte kullanılabilir: moleküller için değil, aynı zamanda hücreleri veya hayvanlar için değil, sadece örnek olarak sayılabilir. Bu nedenle, MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulur güçlü bir izleme algoritması olduğunu.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT at JoVE.com

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K Görüntüleme.  Parc scientifique de Luminy. Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Video: Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biyoloji

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.