Yazarlar, plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 onun tür hediye için plazmid onun tür hediye pQE9 AC 10 ATRP&#39;si 12, Dr Tom Muir (Princeton Üniversitesi), Dr David Tirrell (Caltech) kabul etmek istiyorum plazmid onun tür hediye pJD757 13 için plazmid pET30-Cuta-Tip1 10, ve Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) onun tür hediye Dr Takehisa Matsuda (Teknoloji, Hakusan, Ishikawa, Japonya&#39;da Kanazawa Enstitüsü) . Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER, ABD Hava kuvvetleri Yip ve Norman Hackman İleri Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

1.. Plasmid Yapı Not: tüm genler, üreticinin talimatına göre Phusion High Fidelity-DNA polimerazı kullanılarak PCR reaksiyonları, standart altında amplifiye edildi. Klonlama için kullanılan primerler, daha önce 9 tarif edilmiştir. Tüm yapılar, Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. <ol><li> Cuta-NpuN (N, Tablo 1) oluşturmak için: <ol><li> PCR, uygun primerler kullanılarak, sırasıyla, plazmidler pET30-Cuta-Tip1 10 ve KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, ikinci Cuta ve NpuN genleri amplifiye. </li><li> Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve ardışık T7 promoteri ve N-(Şekil 2A) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin. </li></ol></li><li> NpuC-S-Cuta (C, Tablo 1) oluşturmak için: <ol><li> PCR güçlendir NpuC, Cuta ve S parçalanmasınaUygun primerler kullanılarak plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 ve 10 pQE9 AC sırasıyla ATRP 12, ikinci t [3 AG (PEG)] 10,. </li><li> Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve sırasıyla T7 promoteri ve C (Şekil 2B) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin. </li></ol></li><li> : NpuC-S-SH3 lig Cuta-(Cı-SH3 lig, Tablo 1) oluşturmak için <ol><li> PCR yükseltin Cuta bir SH3 Lig (PPPALPPKRRR) ve fragman SH3 lig-Cuta oluşturmak için esnek bir bağlayıcı (GGGGS) 2 ihtiva eden primerler kullanılarak. </li><li> Fragmanı SH3 lig-Cuta ile C Cuta geni değiştirin. </li></ol></li><li> SH3-GFP (Tablo 1) oluşturmak için: <ol><li> Kullanılarak plazmid pJD757 13 SH3 geni yükseltinUygun astarlar. </li><li> GFP geni, bu sigorta fragmanı ve T7 promotörü (Şekil 2C) ve bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörü içine yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression <ol><li> Uygun ekspresyon plazmidi ile, kimyasal olarak kompetan Escherichia coli BL21 (DE3) 50 ul dönüşümü. </li><li> Transformasyondan sonra, seri olarak, bu hücreler, seyreltik ve Luria-Bertani (LB) bunları plaka / 50 ug / ml kanamisin içeren agar plakaları. </li><li> ~ 15 saat boyunca 37 ° C &#39;de, dönüştürülmüş hücreler içeren inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, koloniler 50-100 ihtiva eden bir levha almak ve LB suyu içinde 5 ml tüm koloniler tekrar süspansiyon. </li><li> Aktarım 1 L kanamisin içeren LB suyu (50 ug / ml) süspansiyonu ve 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de hücreler büyür. 600 nm (OD 600) de emicilik izleyin. OD 600 ~ 0.8 kadar kültür büyütün. <ol><li> C ve C-SH3 lig için, kültür (1 mM nihai konsantrasyon), izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile protein sentezlenmesinin uyarılması ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 4 saat boyunca 37 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li><li> N ve SH3-GFP için, kültür soğutmak için ~ 5 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde kültür şişesi içine daldırarak 18 ° C. Kültürü (1 mM nihai konsantrasyon) için IPTG eklenerek protein ifadesini uyarmak ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 14-18 saat boyunca 18 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> Protein ekspresyonu sonrasında pelet toplamak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj kültür. -80 ° C&#39;de kullanıma kadar saklayın hücre pelet. </li></ol> 3. Protein Saflaştırma <ol><li> N saflaştırılması (denatürasyon koşulları) <ol><li> Islak topak, 10 ml / g Tampon A (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> ImmersBir buz-su banyosu içerisinde pelet süspansiyon e ve (1 sn darbe ve 1 dakika için 6 saniye ara ile Amp 10) sonikasyon ile hücrelerin bozulması. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüje lizat </li><li> Süpernatant atın. (8 M üre ihtiva eden) Tampon DA pelet yeniden süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 xg&#39;de santrifüj süspansiyon </li><li> Daha önce tampon DA ile dengelenmiş bir 5 ml Ni-nitrilotriasetik asit (NTA) kolonundan süpernatant geçirir. </li><li> 45 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon DA 30 ml ile kolondan yıkanır. 150 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon DA 20 ml kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi. </li><li> 3.1.7.1 ve 3.1.7.2 &#39;de verilen aşağıdaki yöntemlerden birini biri ile &lt;1 mM protein numunedeki üre konsantrasyonunu azaltmak: <ol><li> &lt;20 kDa kesme ile tüpler kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca DPBS tamponu (Tablo 2) protein Dialyze. </li><li> Santrifüj, 30 ve # protein saflaştınldı160, 2,800 xg kDa ultra-süzme spin kolon, 4 ° C hacme kadar az 1 ml&#39;dir. Protein numunesinin seyreltilmesi için sütun 14 ml DPBS tamponu ekleyin. Santrifüj / seyreltme üç kez daha tekrarlayın adımları. </li></ol></li><li> Tampon değişimi sonra, saflaştırılmış protein (final 2 mM) ile ditiotreitol (DTT) ekleyin ve 2,800 x g&#39;de, 30 kDa&#39;lık bir ultra-süzme spin kolon, 4 ° C ile santrifüj ile ~ 100 mg / ml protein konsantre </li><li> Kullanılana kadar -80 ° C&#39;de konsantre edilmiş protein ve mağaza kısım. </li></ol></li><li> C ve C-SH3 lig saflaştırılması (yerli koşul) <ol><li> Tampon B 10 ıslak topağın ml / g 1x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş (pH 6.0) (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları. Hedef proteinin proteolitik bozulmasını en aza indirmek için asidik tampon kullanarak. </li><li> 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile bir hücre süspansiyonu bozabilir. Lys santrifüj4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 xg&#39;de yedi ve süpernatant tutun. </li><li> Daha önce tampon B ile dengelenmiş bir 5 ml&#39;lik Ni-NTA sütunu üzerinden Çözünür lizat KATKISI </li><li> Tampon B ile yıkayın kolon 45 mM imidazol ile takviye edilmiş ve 150 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon B, 20 ml hedef proteininin elüt edilmesi. </li><li> C, 3.2.6 adıma atlayın. C-SH3 lig için, adımda verildiği gibi kısmen bozulmuş protein çıkarmak için ek bir iyon değişimli arıtma adımı 3.2.5.3 için 3.2.5.1 gerçekleştirmek <ol><li> 3.1.7 &#39;de tarif edilen prosedür takip edilerek &lt;1 mM&#39;ye kadar C-SH3 lig NaCl konsantrasyonunu azaltır. </li><li> Daha önce sodyum fosfat tampon maddesi (50 mM, pH 7.0) ile dengelenmiş bir 5 ml anyon değiştirici boncuklu agaroz matrisi sütunu üzerine hedef proteini yerleştirin. </li><li> 10 mM Tris-HCl pH 8.0 Buffe ihtiva eden bir çözeltiden bir gradyan çalıştırarak kolondan Elute hedef protein1 M NaCI ile takviye edilmiş aynı tampon ihtiva eden bir çözeltiye r. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) göre en yüksek saflıkta protein yıkama ve havuz örnekleri sırasında numune alın. </li></ol></li><li> 3.1.7 &#39;de tarif edildiği gibi, DPBS tamponu içine, saflaştırılmış proteini Tampon değişimi. </li><li> Saflaştırılmış protein (nihai konsantrasyon 2 mM) ile DTT eklenir ve 3.1.8 tarif edildiği gibi ~ 100 mg / ml, 30 kDa&#39;lık bir ultra-süzme spin kolon kullanarak protein konsantre edilir. Kısım ve mağaza -80 ° C&#39;de kullanıma kadar protein konsantre. </li></ol></li><li> SH3-GFP saflaştırılması <ol><li> Islak topak, 10 ml / g Tampon A kullanılarak yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile pelet süspansiyon bozabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de lizat santrifüj ve supernatant toplamak. </li><li> Daha önceden dengelenmiş bir 5 ml&#39;lik bir Ni-NTA sütunu üzerinden süpernatant (Çözünür lizat) geçmekA. Tampon </li><li> Tampon A içinde 30 ml &#39;si ile yıkayınız sütun 45 mM imidazol ile takviye edilmiştir. Tampon A içinde 20 ml 150 mM imidazol ile desteklenmiş kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi. </li><li> Tampon 3.1.7 &#39;de tarif edilene benzer bir yaklaşım kullanarak DPBS tamponu içine, saflaştırılmış protein değişimi ve protein konsantre ~ 150 mg / 3.1.8 de tarif edildiği gibi, 30 kDa&#39;lık bir ultra-süzme spin kolon kullanılarak ml. </li><li> Kısım ve mağaza -80 ° C&#39;de kullanıma kadar protein saflaştırılmış. </li></ol></li><li> Cuta içeren saflaştırılmış numunelerin SDS-PAGE analizi <ol><li> NaCl ~ 1 mM&#39;ye kadar konsantrasyonunu azaltmak için iki kere distile edilmiş su içinde her bir saflaştırılmış proteini seyreltin. Bu NaCl konsantrasyonda, Cuta trimer proteinlerin çoğu SDS-PAGE jelleri üzerinde monomerler olarak çalışır. </li><li> 2x SDS numune tamponu (0.5 M Tris-HCI, pH 6.8, Gliserol,% 10 ağırlık / hacim SDS,% 0.1 v bromo-fenol kırmızı,% 2 β-merkaptoetanol / ağ% 20), 95 ° C&#39;de inkübe örnekleri ile karıştırın 5 dakika boyunca. </li><li> Sam&#39;e yükleyinples bir% 12 SDS-PAGE jeli üzerine. ~ 50 dakika için 200 V sabit gerilimde elektroforez yapınız. </li><li> Standart protokollere (Şekil 1 C), aşağıdaki Coomassie parlak mavisi R250 ile boyanmıştır jellerde protein dikkate alınmalıdır. </li></ol></li></ol> 4. Hidrojel Oluşumu NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu çalışmada yapılan örnek hidrojeller her bir hidrojel yapı bloğunun 1.6 mM içerir. Bu protein konsantrasyonu yumuşak ve dengeli bir hidrojel elde edilir. DİKKAT: sodyum azid (NaN3) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ağırlık / hacim olarak% 0.5 &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar hidrojel eklenir. NaN 3 derece zehirli ve Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda belirtildiği gibi aşırı bir dikkatle ele alınmalıdır. <ol><li> 100 ul numune hidrojel içinde 1.6 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için gerekli olan konsantre edildi proteinlerin her biri için ses hesaplayın. Örneğin: N konsantrasyonu:100 mg / ml N, Molekül ağırlığı: 26.3 kDa (Tablo 1&#39;e bakınız) İstenen hacmi: 100 ul istenen konsantrasyonu: 1.6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> 100 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, C mix (x ul hacim 4.1 &#39;e göre hesaplanmıştır),% 5 NaN3 (10 ul) ile, 100 mM DTT (5 ul) ve N-(y ul hacim göre hesaplanır 4.1), 2 ml bir cam şişe içinde. </li><li> 100 ul&#39;lik bir son hacim elde etmek için şişeye (y) ul - - ​​x (85), ve manüel bir pipet kullanarak bir girdap hareketi ile tüm bileşenleri karıştırmak DPBS tamponu ekleyin. Not: Solüsyon karıştırma üzerine çok viskoz hale gelir. </li><li> Hava kabarcıklarını çıkarmak için 8000 x g&#39;de 2 dakika boyunca karışımın santrifüjleyin. </li><li> Karışımı oda inkübeintein trans-yapıştırma reaksiyonun tamamlanması için bir gece sıcaklığı. Ters tüp çevirerek hidrojel oluşumunu onaylayın. Bir hidrojel oluşturulur ise, proteinler, akmayacaktır. </li><li> 3.4 (Şekil 1C) de tarif edildiği gibi, daha önce adım 4.2 ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde adım 4.5 sonra toplanan numuneleri (her biri 0.5 ul) kontrol ederek intein trans-birleştirme verimi tahmin. </li></ol> 5. Yerleştirme Protein (DP) ve Docking Station aracılığıyla GFP İmmobilizasyonu Peptit (DSP) Etkileşim <ol><li> 50 ul GFP-işlevselleştirilmiş hidrojel (1.2 mM) yapmak için bir 1.7 in 1:1 molar oranında (4.1 göre hesaplanan, x ul) C-SH3 LIG birleştirmek ve SH3-GFP (y ul, 4.1 &#39;e göre hesaplanan) ml mikrosantrifüj tüpü ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> X - - ​​&lt;5% 3, NaN (5 ul), 100 mM DTT (2.5 ul), (42.5 eklemeaynı tüp em&gt; y) ul DPBS. N ve C-SH3 lig 1:1 &#39;lik bir mol oranının elde edilmesi için N-(y ul, 4.1&#39; e göre hesaplanan) eklenir. Bir girdap hareketi tarafından bir pipet kullanarak örnek karıştırın. </li><li> 2 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ve karışım karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca karışım inkübe edin. İnkübasyon sırasında SH3-GFP formları kapsül bir hidrojel. </li></ol> 6. Organik çözücü içinde, enzimatik bir reaksiyon için bir immobilizasyon iskelesi olarak 1.6 mM hidrojelin kullanımı <ol><li> Bir model enzim olarak HRP kullanın. DPBS HRP (28 mg / ml ya da 0.63 mM) bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> HRP tutulmasıyla, 30 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, bir iç C HRP (2 ul),% 5 NaN3 (3 ul) ve DTT (100 mM, 1.5 ul) ile (x ul, 4.1 &#39;e göre hesaplanan) kombine 1.7 ml santrifüj tüpü. </li><li> N (y Ekle &lt;/ Em&gt; 4.1 göre hesaplanan ul) ve DPBS (23.5 - x - y) ul. Bir girdap hareketi ile bir pipet ucu ile karıştırın. </li><li> 2 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ve karışım gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. DİKKAT: Aşağıdaki aktivite deneyi için kullanılan reajanlar oldukça zehirlidir. Ilgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formları ile özel güvenlik tavsiyelerini kullanın. </li><li> Enzimatik reaksiyon için,, n-heptan 14 N, N-dimetil-p-fenilen diamin (5.8 mM), fenol (5.8 mM) ve tert-butil hidroperoksit (2.9 mM) içeren reaksiyon kokteyli 1 ml hidrojel daldırın. El ile hidrojel ve çözücünün temas yüzey alanını artırmak için bir pipet kullanarak jel bozabilir. </li><li> Bir plaka okuyucusu (Şekil 5) 546 nm &#39;de farklı zamanlarda alınan örneklerin optik absorbans ölçülerek, HRP ürün, bir indofenol tipi boya algılar. </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol>
	<li>Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Engineering+in+the+Development+of+Functional+Hydrogels.">Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).</li><li>Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+protein+trans-splicing+by+a+naturally+split+DnaE+intein+from+Nostoc+punctiforme.">Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme.</a> FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).</li><li>Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+split+Npu+DnaE+intein+exhibits+an+extraordinarily+high+rate+in+the+protein+trans-splicing+reaction.">The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction.</a> FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).</li><li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+implications+for+heavy+metal-induced+reversible+assembly+and+aggregation+of+a+protein:+the+case+of+Pyrococcus+horikoshii+CutA.">Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA.</a> FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).</li><li>Sawano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+basis+for+the+stabilities+of+three+CutA1s+from+Pyrococcus+horikoshii,Thermus+thermophilus,+and+Oryza+sativa,+with+unusually+high+denaturation+temperatures.">Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures.</a> Biochemistry. 47, 721-730 (2008).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyper-thermostability+of+CutA1+protein,+with+a+denaturation+temperature+of+nearly+150+degrees+C..">Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C..</a> FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).</li><li>Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+erosion+rate+of+artificial+protein+hydrogels+through+control+of+network+topology.">Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology.</a> Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).</li><li>McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+directed+syntheses+of+new+polymeric+materials.+Expression+of+artificial+genes+encoding+proteins+with+repeating+-(AlaGly)3ProGluGly-+elements.">Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements.</a> J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).</li><li>Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intein-triggered+artificial+protein+hydrogels+that+support+the+immobilization+of+bioactive+proteins.">Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).</li><li>Ito, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+hydrogel+formation+driven+by+protein-peptide-specific+interaction+and+chondrocyte+entrapment.">Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment.</a> Biomaterials. 31, 58-66 (2010).</li><li>Lockless, S. W., Muir, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+protein+splicing+utilizing+evolved+split+inteins.">Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).</li><li>Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+an+artificial+protein+hydrogel+through+leucine+zipper+aggregation+and+disulfide+bond+formation.">Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation.</a> Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).</li><li>Dueber, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+protein+scaffolds+provide+modular+control+over+metabolic+flux.">Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.</a> Nat. Biotechnol. 27, (2009).</li><li>Bruns, N., Tiller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+network+as+nanoreactor+for+enzymes+in+organic+solvents.">Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents.</a> Nano Lett. 5, 45-48 (2005).</li><li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+gelation+of+an+amino+acid-based+amphiphile.">Water gelation of an amino acid-based amphiphile.</a> Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).</li><li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tandem+modular+protein+based+reversible+hydrogels.">Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels.</a> Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+specific+interaction+of+lysine-containing+proline-rich+peptides+with+the+N-terminal+SH3+domain+of+c-Crk.">Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk.</a> Structure. 3, 215-226 (1995).</li><li>Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+basis+of+proline+recognition+by+SH3+and+WW+domains:+Design+of+n-substituted+inhibitors.">Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors.</a> Science. 282, 2088-2092 (1998).</li><li>Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yielding+Behavior+in+Injectable+Hydrogels+from+Telechelic+Proteins.">Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins.</a> Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).</li></ol>

Hiçbir rakip mali çıkarları var.

Bu çalışmada, oldukça dengeli bir intein aracılığında protein hidrojel sentezini ortaya koymuştur. Bir bölünme kullanılması intein koşullu iki sıvı faz bileşenlerinin karıştırılması tepki olarak şekillendirilecek olan hidrojel sağlar. Özel olarak, bölünmüş intein kovalent da kendi kendine bir hidrojel halinde birleşmektedir bu birimler çapraz bağlanması ile çevrili bir polipeptit ünitesi hasıl, bir trans-ekleme tepkimesi aracılığı ile, iki sıvı faz yapı taşlarını ba...

Proteinlerin tamamen yapılmış Hydrogcls ölçüde doku mühendisliği, ilaç dağıtım ve biofabrication 1 gibi çeşitli alanları ilerlemek için potansiyeli taşımaktadır. Onlar biyouyumluluk ve noninvaziv biyoaktif küresel proteinlerin birleşmesiyle desteklemek için potansiyeli de dahil olmak üzere geleneksel sentetik polimer hidrojeller üzerinde avantajları sunuyoruz. Bu çalışmada, bir protein immobilizasyon iskelesi olarak bölünmüş bir intein aracılı protein trans-birleştirme reaksiyonu ve uygulama (Şekil 1) ile oluşturulan yeni bir protein hidrojel gelişimini tarif eder. Bu hidrojel için yapı blokları her bir (IN ve IC) intein bir bölünme ve çapraz bağlayıcı bir multimerik proteinin bir alt birimin N-ya da C-terminali fragmanını ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Intein Nostoc punctiforme (NPU) gelen DnaE 2,3 intein bölünmüş ve küçük bir trimerik protein Pyrococcus (12 kDa) Cuta horikoshii &lt;olarak kullanılmıştır/ Em&gt; çapraz bağlayıcı protein, 4,5 olarak kullanılmıştır. Farklı çapraz bağlayıcı bir çok çapraz bağlanmış protein ağı (hidrojel) oluşumuna yol açan, intein katalize trans-birleştirme reaksiyonu yoluyla birleştirilmektedir. NPU intein nedeniyle hızlı reaksiyon kinetiği (t 1/2 = 63 sn) ve yüksek trans-yapıştırma verim (yakın% 80) 2,3 seçildi. Cuta protein yüksek stabilite nedeniyle çapraz bağlayıcı olarak seçildi. Cuta trimerleri 150 ° C civarındaki bir sıcaklığa sahip ve denatürasyon kadar 5 M kadar guanidin hidroklorür 4,6 ihtiva eden çözeltiler içinde trimerik kuaterner yapıyı muhafaza eder. Farklı çapraz bağlayıcı arasındaki alt birimi değişimi fiziksel hidrojel yüzey erozyonu 7 önemli bir etken olduğundan, Cuta de çok güçlü arası alt birimi etkileşim daha istikrarlı bir hidrojel lider, bu tür alt birimi alışverişi caydırıcı olmalıdır. Bu yapı taşlarından bir su da kolaylaştırmak üzere, orta blok olarak çok hidrofilik bir peptid S-fragmanını içerirtutma 8. İki hidrojel yapı taşlarından karıştırılması her iki terminalinde de çapraz bağlayıcı ile daha uzun bir polipeptid zincirini üreten, fragmanları intein IN ve IC arasında bir trans-ekleme reaksiyonunu başlatır. Birden fazla bu tür moleküler birimlerden çapraz bağlayıcılar yüksek çapraz bağlanmış hidrojel ağ (Şekil 1A) oluşturan, birbirleri ile etkileşim. Belirli bir &quot;bağlantı istasyonu peptit&quot; (DSP), bir &quot;bağlantı proteini&quot; (DP) ile etiketlenmiş, hidrojel içine hedef proteini kararlı hareketsiz kılınmasını temin etmek için, hidrojel yapı taşlarından birine dahil edilir. Hidrojel montaj aracılık etmek intein bir bölünme kullanılması hedef proteinler önce hidrojel oluşumuna yüklü olarak, protein sentezi için hidrojel ek bir esneklik sağlar, ancak aynı zamanda tüm hidrojel boyunca hedef proteinin yüksek yoğunluklu, düzgün yüklenmesini sağlar sadece. Intein aracılığında protein hidrojel oldukça sta olduğuile sulu bir çözelti içinde ble az-oda sıcaklığında 3 ay sonra tespit erozyon. Stabilite pH (6-10) ve sıcaklıklarda (4-50 ° C), geniş bir aralıkta muhafaza ve hidrojel aynı zamanda organik çözücüler ile uyumludur. Yeşil floresan protein (GFP) ve yaban turbu peroksidazı (HRP) Bu hidrojel, iki küresel proteinlerin immobilizasyonu için kullanılır. Ikinci protein tutulmasıyla Hidrojel, bir organik çözücü içinde, Biocatalysis gerçekleştirmek için kullanılır.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

Bir bölünmüş intein katalizli protein trans-ekleme reaksiyonu ile aracılık ettiği bir hidrojel oldukça dengeli bir protein sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Bir çok hidrofilik gelişigüzel kıvrımlı bir su tutma için blok-kopolimerlerin birine sokulur. İki protein blok kopolimerlerinin karıştırılması iki ucunda çapraz bağlayıcı ile bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-birleştirme reaksiyonu tetikleyen bir hidrojel içine hızlı bir şekilde kendi kendini toplanır. Bu hidrojel, 50 ° C &#39;ye kadar, ve organik çözücüler içinde sıcaklıklarda, hem asidik hem de bazik koşullar altında, çok kararlıdır. Kesme kaynaklı rüptür sonra hidrojel hızla reformlar. Hidrojel yapı bloğunun bir &quot;bağlantı istasyonu peptid&quot; dahil edilmesi &quot;yerleştirme protein&quot;-etiketli hedef proteinlerin uygun bir birleşme sağlar.Hidrojel, bir doku kültürü büyüme ortamı ile uyumlu olan 20 kDa moleküllerin difüzyon destekler ve küresel biyoaktif proteinlerin immobilizasyon sağlar. Organik bir çözücü ile uyumlu katalizör olarak intein aracılı protein hidrojelin uygulama yaban turpu peroksidaz enzimi içine alıcı ve destekleyici aktivitesi ile gösterilmiştir.

Intein aracılığında protein hidrojel oluşturulması için bir şematik Şekil 1A &#39;de sunulmaktadır. Hidrojelin yapı blokları protein Cuta-NpuN (N) ve NpuC-S-Cuta (C) (Şekil 1A, Tablo 1) kopolimerleridir. NpuN / C Nostoc punctiforme (NPU) için intein doğal olarak bölünmüş DnaE en N-/C-fragments bulunmaktadır. Cuta Pyrococcus horikoshii 4,5 Bir kararlı trimerik proteindir. (Şekil 1 A ve 1 C) lige ürünü (Cuta-S-...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel at JoVE.com

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve kolayca fonksiyonel küresel olan proteinleri içermektedir.

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Görüntüleme.  Texas A&M University, College Station.  Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH...

Video: Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Monolayer sentezi, Montaj ve Karakterizasyonu Protein Monolayer Elektrokimya Korumalı Altın Nanopartikül Filmler

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Biyomühendislik

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Domuz Kalbe Yerel Kateter Enjeksiyon için bir Enjekte ve İlaç yüklü Supramoleküler Hidrojel

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Teknik hidrojel tabanlı Micromachines manyetik olarak duyarlı bileşenleri ile Facile ve hızlı üretim için üretim bir katkı

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D gözenekli selüloz Nanocomposite hidrojel iskele baskılı

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.