Protokol çok önemlidir, çünkü hücresiz protein sentez sistemlerinde, hatta yerel E.coli parametrelerinden bile doğrusal DNA şablonlarının hızlı, kolay ve doğrudan kullanılmasını sağlar. Başlıca avantajları, klonlamadan, lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonlarından ve gama veya chi DNA gibi koruyucu takviyelerden kaçınarak tasarruf edilen zaman miktarıdır. İlgilenilen farklı organizmalar için kendi kendini bildiren sentez ekstraktları geliştirildiğinden, yöntemimiz doğrusal DNA kullanarak bu ekstraktlarda prototiplemeyi hızlandırmanın bir yolunu sunar.
Başlamak için, BL21 Rosetta-2 delta recBCD'yi eksi 80 santigrat derece gliserol stoğundan, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram içeren ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe eden 2x YTP agar plakasına streak suşu yerleştirin. Daha sonra, agar plakasından tek bir koloniyi, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram ile desteklenmiş 40 mililitreden biraz daha fazla 2x YTP'ye aşılayın ve gece boyunca 200 RPM sallama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, gece kültürünü 100 kez, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram içeren dört litre taze 2x YTP ortamına seyrelterek bir alt kültür yapın.
Ortamın dört litresini dört ayrı şişeye bölün. 1.5 ila 2.0 optik yoğunluğa ulaşmak için yaklaşık üç ila dört saatlik bir büyüme için 37 santigrat derece, 200 RPM'de inkübe edin. Kültürü buza koyun, hücreleri dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 5.000 G'de döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
Ardından, hücre peletlerini DTT ile 800 mililitre soğutulmuş S30A'da yeniden askıya alın. Yine, hücreleri daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 5.000 G'de döndürün ve süpernatantı dekantasyonla atın. DTT ile 160 mililitre soğutulmuş S30A'da hücre peletlerini yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri soğutulmuş ve önceden tartılmış 50 mililitrelik tüplere aktarın.
Hücreleri 2000 G'de dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca döndürün ve daha sonra dekantı boşaltarak atın. Yine, hücreleri 2000 G'de dört dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün ve ardından bir pipet kullanarak kalan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Ardından, hücre peletinin ağırlığını hesaplamak ve hücre peletlerini eksi 80 santigrat derecede tutmak için tüpün ağırlığını yeniden ölçün.
Hücre peletlerini eksi 80 santigrat dereceden aldıktan sonra, bir ila iki saat boyunca buz üzerinde çözün ve hücre peletlerini, hücre peletinin ağırlığının gramı başına DTT tamponu ile 0.9 mililitre S30A'da yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça pipetleyin, mümkün olduğunca üst köpükten kaçının. Yeniden askıya alınan hücrelerin bir mililitrelik alikotlarını 1.5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin ve bunları dört santigrat derecede buz veya önceden soğutulmuş soğuk bir blok üzerinde tutun.
Daha sonra, üç döngü için% 20 genlik kurulumuna sahip bir sonikatördeki her tüpü sonikleştirin ve lizatı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 G'de döndürün. Süpernatantı bir pipetle topladıktan sonra, 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre lizatını 80 dakika boyunca 200 RPM ajitasyonda 37 santigrat derecede inkübe edin.
Lisatı aşağı doğru döndürdükten ve süpernatantı önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik mikrotüplerde topladıktan sonra, tüm tüpleri buz üzerinde tutarken, önceden soğutulmuş PCR 8 şeritli tüplerde aliquot 30 mikrolitre. Flash, lizat alikotlarını kuru buz üzerinde dondurur ve eksi 80 santigrat derecede saklar. Makalede açıklandığı gibi tampon hazırlama sekmesine göre bir ana karışım hazırlayın.
10.5 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi için, 1.05 mikrolitre farklı Mg-glutamat stok konsantrasyonları ve 9.45 mikrolitre ana karışım ekleyin ve yavaşça karıştırın. Yukarıdaki reaksiyonların 10 mikrolitresini pipet, 384 delikli kare tabanlı bir mikro plakaya dönüştürür ve yapışkan bir plaka contası kullanarak örtün. Floresan verilerini, dakikada 307 döngüde sürekli yörüngesel sarsıntı ile 30 santigrat derecede sekiz saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla bir plaka okuyucu ile kaydederek floresan çıkışı olarak gen ekspresyonunu ölçün.
Son noktada en yüksek floresan değeri ile sonuçlanan Mg-glutamat konsantrasyonunu belirledikten sonra, K-glutamat kalibrasyonuna geçin. Deneyi çalıştırın ve test edilen K-glutamat konsantrasyonları arasından en yüksek floresan değerini tanımlayın, böylece bu lizat için Mg-glutamat ve K-glutamat için en uygun tampon bileşimini tanımlayın. Mg-glutamat ve K-glutamat değerleri belirlendikten sonra, elde edilen parti hacmine göre optimize edilmiş tampon bileşiminin stok tüplerini hazırlayın.
Gerekli tampon tüplerinin sayısını hesapladıktan sonra, tüp başına 38 mikrolitre aliquot ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, optimum ana karışım hazırlığı için 1,5 mililitrelik bir mikrotüpü etiketleyin. Tamponun ve lizatın doğru hacimlerini ekleyin ve nazikçe karıştırın.
Daha sonra, önce DNA örneklerini pipetleyin, ardından nükleaz içermeyen su ve son olarak en uygun ana karışım. Hücre içermeyen reaksiyonu, plaka okuyucuya eklemeden hemen önce bir pipetle nazikçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. Plaka okuyucudaki reaksiyonları ayarladıktan sonra, kinetik çalışmalar, dakikada 307 döngüde sürekli yörüngesel sarsıntı ile 30 santigrat derecede sekiz saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla floresan verilerini kaydetti.
Lisatın kalibrasyonundan sonra, Mg-glutamat optimal konsantrasyonu, hem doğrusal hem de plazmid DNA'sı için ekstraktlar arasında sekiz milimolar'da benzerdi. Bununla birlikte, plazmid DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu 140 milimolar, lineer DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu ise 20 milimolar'dır. Kalibrasyon adımlarından sonra, GFP ekspresyon seviyeleri, vahşi tip, delta recB ve delta recBCD ekstraktlarındaki lineer ve plazmid DNA'ları arasında karşılaştırıldı.
Lineer DNA'dan GFP ekspresyonu, delta recB ve delta recBCD suşlarından elde edilen ekstraktlarda plazmid DNA'sından ekspresyonun sırasıyla% 102 ve% 138'ine ulaştı. Protokoldeki en önemli şeyler, hücrenin sonikasyon lizisidir ve tampon kalibrasyon adımları, özellikle doğal parametreleri kullanırken, doğrusal ve plazmid DNA için ayrı ayrıdır. Bu teknik, biyolojik tasarımların hücresiz sistemlerde, örneğin biyosensörlerin, enzimlerin ve yolakların taranması veya sentetik genetik devrelerin prototiplenmesinin hızlandırılmasına yardımcı olacaktır.
