Bu çalışma Moleküler Biyoteknoloji, Ibio, Inc ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (hibe # HDTRA1-07-C-0054) için Fraunhofer ABD Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr tarafından cömert hediyeler kabul. Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue Üniversitesi (Agrobacterium tumefaciens) ve Büyük Ölçekli Biyoloji Corp Wayne Fitzmaurice&#39;nin (N. excelsiana tohum) yanı sıra, ABD Nicotiana Koleksiyonu, North Carolina State University (N. yonga tohumlar Jennifer Nicholson Stanton Gelvin .) Yazarlar bitkiler ve mükemmel teknik yardım sağlamak için Margaret Shillingford ve Christopher Hull teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca Dr teşekkür ederim. Editoryal yardım için Stephen Streatfield ve Natasha Kushnir.

1.. Bitki Yetiştirme Sonraki agroinfiltration için biz iki vahşi-tip Nicotiana türleri kapalı tesislerde taşyünü üzerine hydroponically yetiştirilen (N. benthamiana ve N. yonga) ve melez (N. excelsiana) değerlendirildi. <ol><li> Bir bitki gübre çözeltisine taşyünü döşeme bekletin. </li><li> Doğal tipte N. tohumları ekmek benthamiana, N. talaş ve N. besin excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana&#39;nın melez) taşyünü yüzeyi ıslatılır. </li><li> Için kontrol edilen koşullar altında (24 ° C ve% 40-65 bağıl nem) altında tohumlardan bitkilerin ve (130-150 μE m aydınlatılması ile 14 saat ışık ve 10 saat karanlık, -2 sec-1) uzun bir gün değerindeki fotoperiod büyümek N. 4-5 hafta ve N. benthamiana excelsiana ve N. 5-6 hafta excelsior. </li></ol> Agroinfiltrat için Vektörlerin 2. İnşaatıiyon <ol><li> Influenza virüsü (HAC1) en A/California/04/2009 suşundan sentetik bir raportör geni (yeşil flüoresan protein [GFP]), tam uzunlukta hemagglutinin (HA) ekleyin ve yeniden tasarlanmış likenaz enzim (LicKM) 18 ayrı olarak içine başlatmak vektör pBID4-GFP, pBID4-HAC1 sırasıyla pBID4-LicKM, 18,32,41,47 elde etmek 18 (TMV-tabanlı vektör) pBID4. </li><li> A. elektro hücrelerine 10-50 GFP taşıma pBID4 arasında ng veya HAC1 tanıtılması A. elektro hücrelerine GV3101 ırkına ve LicKM tumefaciens turnefaciens gen MicroPulser elektroporatörü ile GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 ve A4 suşları. </li><li> Aksi belirtilmedikçe, infiltrasyon deneyleri için dönüştürülmüş Agrobacteria&#39;yı kullanın. </li></ol> 3.. Nicotiana Bitkiler içine Agrobakterinin İnfiltrasyon Vakum <ol><li> A. büyüyecek tumefaciens LB ortamı, YEB Med (O / N), gece boyunca suşlarıamonyum ya da AB ortamı 200-250 rpm&#39;de çalkalanarak 28 ° C&#39;de Kanamisin 50 mg / L ile takviye edilmiştir. </li><li> 4.000 × LB veya YEB ya da AB yetiştirilen 0,5 veya santrifüj Agrobacterium hücreleri, 600 nm&#39;de bir optik yoğunluğa (600) için Milli-Q su içinde Agrobacteria&#39;yı seyreltin 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca g, 0.5 A 600 indüksiyon ortamına (1x MS tuzu, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon,% 2 sukroz [MMA]) içinde yeniden askıya ve 1-3 için oda sıcaklığında karışmaya hr, aksi kaydetti. </li><li> Agrobacterium süspansiyonu içinde hava Nicotiana bitki dokuları daldırılması ve 30 ya da 60 saniye boyunca bir 50-400 mbar vakum uygulanarak bir vakum odası içinde bitkiler sızmak. Optimal infiltrasyon rutin olarak 60 saniye boyunca 50-100 mbar&#39;da uygulanır. </li><li> Vakum bozuldu sonra, vakum odasından bitkiler kaldırmak su içinde durulama ve önceden infiltrasyon büyüme için kullanılan aynı yetiştirme koşulları altında 5-7 gün için büyümeye. </li><li> Etkinliğini test etmek içinAgrobacterium vir geni, asetosiringon, farklı konsantrasyonlarda (0, 100, 200 ya da 400 uM) indükleyici kimyasal sızma tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi Agrobacteria (1x MS, 10 mM MES,% 2 glukoz) çözeltisine ilave edildi. Vir geni, glukoz (0, 1, 2 veya% 4), farklı yüzdelerde indüksiyonu üzerinde monosakkaridin etki için nüfuz etme tampon maddesi (1x MS, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon) içinde süspansiyon haline getirilmiş Agrobacterium ilave edildi. N. adım 3.3 ve 3.4), yukarıda belirtildiği gibi benthamiana bitkileri infiltre edilmiştir. </li><li> Agrobacterium laboratuar A 600 0.5. N&#39;ye Milli-Q su içinde seyreltilmiştir GV3101, C58C1 ve LBA4404 ve vahşi tip soyları A4, At06, AT10 ve At77 pBID4-LicKM vektörü barındıran suşları benthamiana bitkileri adımları 3.3 ve 3.4 &#39;de, yukarıda belirtildiği gibi, her bir suş ile infiltre edilmiştir. </li></ol> Viral susturma Bastırıcı boyunca 4. Co-agroinfiltration Prosedür <ol><li> Mix 01:01 de GFP geni ve domates çalılık büyümeyi durdurucu virüs (TBSV) viral susturma bastırıcı P19 taşıyan Milli-Q su içinde sulandırılmış GV3101 Agrobacterium kültürleri, 02:01, 03:01 ve 04:01 oranları. N. sızmak yukarıda tarif edildiği gibi benthamiana bitkileri. </li><li> N. sızmak İki Milli-Q su ile seyreltilmiş Agrobacterium GV3101 kültürlerin bir karışımı ile benthamiana bitkileri: pBID4-HAC1 plazmid taşıyan birinci ve susturma baskılayıcılar birini taşıyan ikinci - TBSV veya Citrus tristeza virüsü p23 p19, pCassp plazmide ( pCassp19) ve 35S promoteri oranının sırasıyla 04:01 (PGR-P23), altında PGR ikili plasmid içinde. </li></ol> 5. Western Blot Analizi <ol><li> N. rastgele yaprak örnekleri toplamak benthamiana, N. talaş veya N. excelsiana 4-7 dpi&#39;de bitki ve ince bir toz halinde sıvı azot içinde toz haline. </li><li> % 0.5 Triton 1x PBS tampon maddesinin üç sayılarınıX-100, her bir örnek için. </li><li> Yavaşça 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca sallayın ekstre örnekleri </li><li> 5 dakika için özü Spin ve temiz bir Eppendorf tüpüne toplam çözünür protein toplar. </li><li> 1x PBS ekstraksiyon tamponu içerisinde uygun bir seyreltme (1:100 01:50) ile özü seyreltilir ve 5 x numune tamponu (250 mM Tris-HCI [pH 6.8],% 10 SDS,% 0.5 bromofenol mavisi,% 50 gliserol ekleyin nihai konsantrasyon 1 x v / v, ve 500 mM DTT). </li><li> 5 dakika için kaynatılır örnekleri. </li><li> 10% SDS-PAGE ile ayrı proteinler, Immobilon-P Transfer membranı üzerine transfer ve% 0.5 I-blok ile bloke eder. </li><li> 1:5,000 da poliklonal tavşan anti-GFP antiserumu kullanarak HAC1 1 saat boyunca bloke etme çözeltisi içinde 1:1,000 de fare anti-poli-histidin GFP monoklonal antikor kullanılarak tespit eder. </li><li> Birincil Antikor etiketleme işleminden sonra, 10 dakika 1 x PBST-20 ile her biri için membranlar üç defa yıkamak ve 1:5,000 da konjüge-a turp peroksidaz (HRP) bağlı anti-tavşan antikoru ya da HRP-konjügatı ile inkübe1 GFP ve HAC1 tespiti için saat, sırasıyla 1:10,000 d anti-fare antikoru. </li><li> SuperSignal West Pico Chemiluminescent alt-tabakası kullanılarak Western blot işleyin. </li><li> Protein bant yoğunluğu analiz ve bant kalibre miktarda elde etmek GeneTools Yazılımını kullanın. </li></ol> Protein üretimi: (örnek kalibre miktarı x seyreltme) /, yüklü olan örnek miktarı) = 4 mg / kg x. Denklem: Protein üretimi (P), Kalibre miktar (C), numune (D) seyreltilmesi ve yüklenen Numune miktarı (S). 6.. Zimogramı Assay <ol><li> Toplayın pBID4-LicKM-sızmış N. benthamiana rasgele doku örnekleri alındı. </li><li> Western blot analizi için yukarıda tarif edilen ile aynı yöntem kullanılarak ekstrakte proteinleri ve daha sonra% 0.1 lichenan 10% SDS-PAGE ile analiz jeller dahildir. </li><li> Elektroforezisten sonra, 100 mM Tris-HCI [pH 8.0] ve% 0.1 Triton X (yıkama tampon maddesi içinde 10 dakika her biri için köpükler iki kez yıkayın-100) Ve daha sonra 1 saat boyunca 65 ° C &#39;de yıkama tamponu içinde inkübe edilir. </li><li> İnkübasyondan sonra, yıkama tamponu atmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Congo kırmızısı ile jeller leke. </li><li> 10 dakika her biri için Milli-Q su içinde köpükler üç kez yıkayın ve likenaz aktivitesi görselleştirmek için 1 M NaCI ekleyin. Saflaştırılmış protein bakteriyel likenaz enzim aktivitesi için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. </li></ol> 7. GFP Görüntüleme <ol><li> Bir elle tutulan uzun dalga boylu bir UV lambası kullanılarak bütün geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde GFP floresans algılama görsel yapın. </li><li> Fotoğraf geçici bir Sarı 8 üzerinden bir dijital kamera ile bitkiler dönüştürülmüş, 52 filtresi (pozlama süresi 15 saniye) ES. </li><li> Western Blot görüntüleri elde edilir bir GeneGnome üzerinde GeneSnap yazılımı kullanarak saflaştınldı ve GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisi ile, GeneTools yazılımını kullanarak analiz sonuçlarını ölçmek. </li><li> Purifi göre bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak HAC1 proteinini ölçmekİnfluenza virüsünün A/Indonesia/05/05 gerginlik ed HAC standart protein. </li><li> 3-4 ortalama değerlerini hesapla Tüm deneyler için çoğaltır. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, fırlatma vektörünü taşıyan Agrobacterium suşları kullanılarak seçilebilir Nicotiana türlerinde rutin geçici protein üretimi için basit bir protokol agroinfiltration geliştirdik. Buna ek olarak, bizim geçici bir bitki ekspresyon sisteminde en yüksek bir araya getiren protein üretim seviyesini elde etmek için uygun koşullar belirledik. Seyreltilmiş A. Vakum infiltrasyon N. içine fırlatma vektör pBID4 barındıran GV3101 ırkına tumefaciens benthamiana, N. excelsiana ve N. talaş gibi Alfalfa mozaik virüsü barındıran GV3101 ile infiltre Pisum sativum gibi diğer bitki türlerine göre 7 dpi olan hedef protein üretiminin yüksek seviyeleri ile sonuçlanmıştır - ya da salatalık mozaik 35S promotörün kontrolü altında GFP raportör geni ifade virüsü-esaslı vektörler 41 ya da Lactuca sativa, Solanum LyCOA suşu C58C1 ile infiltre persicum ve Arabidopsis thaliana beta-glukuronidaz raportör geni 57. N. taşıma tumefaciens ve N. benthamiana excelsiana% 90-95 sızma verimliliği ile, 30-60 saniye boyunca 50 mbar&#39;daki sızmak vakum kolay oldu. Yaprak alanının geri kalan% 5-10, çünkü vakum uygulanması sırasında Agrobacterium süspansiyonu yüzeyinde yaprakların bir yüzer infiltre edilmiş değildi. Fırlatma vektör hücreden hücreye hareket 18 için yeteneğine sahip olduğu için, geçici protein birikimi 7 dpi&#39;de tüm yaprak hem de yaprak sapı oluşur. PBID4 ekspresyon vektörü hücreden hücreye hareket edebilmektedir, ancak, sistemik 18 taşımak için değil, çünkü 10 dpi anda, tahmin edilen GFP üretim biraz daha düşük olmuştur; Bu nedenle, yeni çıkan yaprak vektörü içermeyen ve hedef üretimine katkıda bulunmazlar. Buna ek olarak, yeniden birleştirici proteinin bozulması fazla zaman mBugün 10 dpi düşük protein seviyesine katkıda bulunur. Bizim sonuçlar A&#39;nmkidir infiltrasyon N. geçici protein üretiminin turnefaciens gerginlik GV3101 aracılı yüksek seviyede benthamina. Bundan başka, hedef proteini likenaz için N-terminal, C-terminal veya iç füzyonları (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanaz Clostridium thermocellum bir termostabil enzim ve birçok hedef için termostabilite kazandıran olarak tasarlanmış olabilir protein füzyon 18. N. Sızma A ile benthamiana yaprak kıvrılma, yaprak sapı uzama, ve saç: hafif ya da ciddi semptomlar ortaya çıkar genini barındıran vahşi tip suşu (AT6, AT10 ve at77) tumefaciens. Patolojik semptomlar N gözlendi Bazı genler GV3101 suşları pBID4 içine yerleştirilir ve laboratuvara dönüşmüş ise benthamina, boş pBID4 vektörü barındıran laboratuvar GV3101 ırkına ile sızmış, C58C1 veya LBA4404&#39;tü hafif nekrotik yanıtları ve yaprak elicitedkloroz / yaprakların infiltre bölgelerinde semptomları sararma. Vahşi tip Agrobacterium veya solanaceous bitkilerde devreden suşlarının neden olduğu nekrotik semptomlar daha önce 56,57 bildirilmiştir. Nekrotik tepki tip III sekresyon sisteminde, Tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine aktarılır bakteriyel proteinler ve / ya da flagellin&#39;in 58-60 duyarlılık hastalık oluşturma faktörlerinin neden olabilir. Bu heterolog proteinlerin üretimi de geçici patojenik ortaya çıkarabilir ve infiltre bitkide, hipersensitif bir cevap bırakır bulduk. Birçok araştırmacı, dengeli bir şekilde dönüştürülmüş bitkiler 28,57 ile karşılaştırıldığında geçici protein üretiminin 5-20 kat daha yüksek seviyelere kadar üretilen bitki ikili vektörleri ile, farklı bitki türleri bu agroinfiltration bildirdi. Bizim veri gösteriyor ki N. benthamiana GV3101 için bildirilen GFP verim benzer bir GFP arasında pBID4-GFP geçici olarak ifade edilen yüksek düzeyde barındıran ile infiltreN. benthamiana Agrobacteria&#39;ı PiCh-GFPSYS viral vektör (toplam çözünen proteinin% 80) 44 taşıma ile sızmış. Bizim başlatmak vektörü kullanılarak Agroinfiltration termo protein LicKM yüksek üretimi ile sonuçlanmıştır, standart bir ikili plasmid 18 ile gözlenenden daha yüksek, 50-kat. A. enfeksiyon test etmek için turnefaciens ve fırlatma vektör istikrar, N. biri düz sızmış benthamiana pBID4-GFP plazmid GV3101 aynı Milli-Q su ile seyreltilmiş kültür kullanılarak 8 saat boyunca her saat. Bizim veri GV3101 gerginlik verimli, en az 8 saat ve pBID4 (başlatma vektörü) için enfektif olduğunu gösterdi 8 saat süren infiltrasyonu sırasında çok kararlı. -80 ° C&#39;de saklanır fırlatma vektör pBID4-HAC1 (hücre bankası) barındıran GV3101 soyunun gliserol stoku geçici prote değişiklik olmadan üç yıl boyunca çok stabil olduğu gösterilmiştirSüzülmüş bitkilerin üretimde. Optimal koşullar ve 35 ile 42 gün sonra ekim altında yetiştirilir N. benthamiana bitkiler vakum infiltrasyon dolayımlı geçici gen ifadesi 40 için uygun olmuştur. (3-4 haftalık), genç bitkiler için hücre süspansiyonu yüzey ve bir vakum uygulanarak mekanik etkilerinden doku hasarı üzerinde yüzen yaprak tamamen nüfuz edilemez. 45 gün, N. daha büyük tesislerde benthamiana kullanılan en iyi ışık koşulları altında, aşama vidalama, geçici ekspresyon seviyesi düşüktür. Düşük molekül ağırlıklı bileşikler, fenolik (asetosiringon) ve monosaccharaides (glikoz) 55,61 tumefaciens A&#39;da vir genlerin neden olduğu bilinmektedir. Ayrıca, N. infiltrasyonu 50-600 uM konsantrasyonlarda asetosiringon varlığında, ikili vektör pCAMBIA (GFP) ile benthamiana hafif geçici artış gösterildiGen ekspresyonu 40. Biz 3 saat MMA pBID4-GFP barındıran GV3101 kültürlere bu bileşikleri ekleyerek sisteme acetosyringone ve glikozun farklı konsantrasyonlarının etkisi okudu ve GFP hiçbir fark bulunamadı. İlginç bir şekilde, pBID4-GFP barındıran ve 0.5 &#39;lik bir A 600 için Milli-Q su içinde seyreltildi ve vir gen indüksiyonu olmadan nüfuz GV3101 kültürler neden kültürleri ile infiltre gibi GFP ile aynı miktarda ifade edilmiştir. A. tumefaciens vir gen (ler), potansiyel bitki fenolik bileşikler (asetosiringon ve sinapinik asit) ve yaprak dokusunda mevcut bitki monosaccharaides (glikoz ve fruktoz) neden olabilir. Bu nedenle, eksojen vir geninin indükleyicilerin varlığında veya yokluğunda, GFP ifade benzer düzeylerde bitki hücrelerinde GFP-ifade başlatmak vektörün çoğaltma sırasında mevcut sitoplazmik vir geninin indükleyicilerin etkisinin bir sonucu olabilir spekülasyon. N. benthamiana geçici protein üretimi için bir model 49 ana olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, N. benthamiana &#39;in nispeten düşük biyokütle verim rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için bir uygulama engellemektedir. Optimum ana geçici, yüksek bir ifade seviyesi, serada kolay büyüme birleştirmek ve Agrobacterium infiltrasyon 2 duyarlı olmalıdır. Alternatif bir ana seçmek için, bir melez incelemeleri Nicotiana&#39;da (N. benthamiana ve N. Excelsior), iki farklı vahşi-tip türler sızmış ve A. ile excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) pBID4-GFP plazmid GV3101 ırkına tumefaciens. Bu üç tür arasında, GFP ekspresyon düzeyinin N. biraz daha yüksekti benthamina. N. talaş bitkiler, kendi kösele yapraklara vakum agroinfiltration güçlüğü gösterdi ve N. excelsianaüretilen, yaklaşık olarak aynı yetiştirme koşulları altında daha fazla biyo-kütle, iki kat. 7 dpi GFP geçici üretim N. nispeten benzer ve N. benthamiana excelsiana. Bu nedenle, N. excelsiana yeniden birleştirici protein üretimi için daha uygun bir ev sahibi olabilir. Agrobacterium-aracılı geçici protein üretim geni bitki virüsü kökenli 62 bastırıcıları susturma ko-ekspresyonu ile aşılabilir PTGS 26 ile sınırlıdır. Geçici protein üretimi yukarıda infiltre dokularda 34&#39;te PTGS inhibe TBSV of p19 proteini varlığında, 50-kat artırılabilir gösterilmiştir. Çalışmamızda, biz ayrı lansman vektörü pBID4-HAC1 ile birlikte sızmış iki viral susturulması bastırıcılarının (p19 ve p23) etkisi değerlendirildi. Bu susturma bastırıcılarının ko-infiltrasyon HAC1 sadece hafif bir artış ile, HAC1 geçici ekspresyonu üzerinde çok az etkiye sahip görünüyorduco-infiltre p23 ya da p19 varlığında protein birikimi (% 15-25). Pozitif protein üretimini etkiler için, susturma bastırıcılar, özellikle hedeflenen bitki türleri ve viral vektör 63 için geçerli olmak üzere seçilebilir gerekebilir. TMV RNA helikaz susturma aktivitesi 64,65 arasında bir bastırma sahiptir. PBID4-HAC1 ile p23 veya p19&#39;un ko-infiltrasyonu GFP hiçbir artış ya da geçici HAC1 protein üretiminde hafif bir artışa neden olduğu gibi, bizim veri bu gözlemi doğrulamaktadır. Sonuç olarak, değiştirilebilir ve optimize edilmiş bitki ve Agrobacterium büyüme koşulları ve vakum infiltrasyon verimliliğini iyileştirilmiştir. Bu teknoloji bir kaç saat içinde bitki materyali yüzlerce kilogram büyümek ve sızmak için bize sağladı. Biz başarıyla geçerli İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) koşullar altında endüstriyel ölçeklerde yüksek verimli aşı üretimi için tesis geçici ifade tekniği otomatik. Abo Daha fazla bilgi içinut otomasyonu ve cGMP koşullar altında alt-birim aşı adayları da dahil olmak üzere yeniden birleştirici proteinlerin üretimi için bitki geçici protein üretim sisteminin kullanımı, okuyucu web olarak adlandırılır <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Bitkiler şimdi heterolog rekombinant biyofarmasötikler ve endüstriyel proteinleri 1-3 üretmek için güvenli, güvenilir, ölçeklenebilir ve ucuz platformu olarak tanınan ve mikrobiyal ve hayvan hücre ekspresyon sistemleri üzerinde 4 önemli avantajlara sahiptir. Bitkiler monte Multimerik antikorlar 5-7 gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, düzgün katlanmış proteinleri ifade edebiliyoruz. Çeşitli bitkisel kaynaklı rekombinant ilaç proteinlerinin klinik değerlendirme 8. geçiyor. Bu non-Hodgkin lenfoma 9, hemagglutinin bazlı pandemik ve mevsimsel influenza aşısı adayları 10,11 (Cummings ve diğerleri., Vaccine sunulan), anti-yüzey antijen Streptococcus I tedavisi için hastaya özgü rekombinant idiotip aşılar (scFv) gibi / diş çürüklerinin tedavisi 12, 13 ve diyabet tedavisi için insan insülini için II antikor. Bundan başka, insan recoGaucher hastalığında enzim replasman tedavisi için mbinant glikoserebrosidaz İsrail ve ABD&#39;de onaylandı ve ABD 14,15 dışındaki Genişletilmiş Erişim Programı kapsamında sağlanır. Heterolog proteinlerin kararlı şekilde dönüştürülmüş (Transjenik veya transplastomik) ya da geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde üretilebilir. Geçici protein ifadesi ve üretimi birikimi 16 elde etmek için kısa bir zaman dilimi içeren transjenik bitkilerde, üretim üzerinde çeşitli avantajlar sunar ve bitki dokuları 4 içine bakteri ikili vektörler ya da rekombinant bitki viral vektörleri sokulması ile elde edilebilir. En gelişmiş geçici ekspresyon sistemi, bitki virüsleri ve ikili plazmid bileşenlere ve agroinfiltration 17,18 tarafından teslim &#39;başlatmak vektörleri&#39; kullanımına dayanmaktadır. Tütün mozaik virüsü (TMV) dayalı bir fırlatma vektör Agroinfiltration başarıyla laboratuvarda uygulandı, insan papilloma virüsü 19, Yersinia pestis 20 gibi patojenlere karşı aşı antijenlerinin üretilmesi için büyütülebilir, influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 virüs ve N. çiçek hastalığı virüsü 24 benthamiana yaprak. Agrobacterium aracılı geçici sentezleme aynı zamanda birden fazla protein 2,25-27 eş zamanlı üretimi için gelecek vaat eden bir yöntemdir. Örneğin, bitki, geçici ifade sistemleri, tümör spesifik rekombinant antikor 28,29, epidermal büyüme faktörü reseptörü 30 karşı glikosile edilmiş bir rekombinant antikor ve şarbon koruyucu bir antijen 31,32 için özel bir monoklonal antikor üretmek için kullanılmıştır. Bir hedef genin ve gelişmiş hedef protein ekspresyonu 33,34 gen susturma sonuç süpresör Nicotiana benthamiana bitkilerinin Co-infiltrasyonu. Agroinfiltration düzgün Introdu için yaygın bir yöntemdirbitkiye ilgi konusu bir geni barındıran cing bakteriler 35-37 dokular. Bozulmamış bitki içinde geçici gen ekspresyonu yaprak için Agrobacterium vakum infiltrasyonu transgenik bitkiler 38-41 oluşturmak için gerek kalmadan yabancı proteinlerin üretimi için hızlı, ölçeklenebilir ve kullanışlı bir yöntemdir. Vakum agroinfiltration sırasında, bitkiler baş aşağı çevirdi ve üstü kısımları Agrobacterium süspansiyon batık. Daha sonra vakum gazlar stoma yoluyla yaprak arası boşluklarından tahliye neden uygulanır. Yaprak içine Agrobacterium süspansiyonunun infüzyon vakum sonuç hızlı yeniden basınçlandırma aşağıdaki serbest bırakma. Agrobacteria&#39;nın vakum infiltrasyonu sonra, bitkiler yetiştirilir ve hedef ekspresyon izlenir. Hedef en yüksek ifade seviyeleri tipik olarak 2-3 gün sonra ekspresyon seviyesi tipik olarak azaltarak üzerine bir başlangıç ​​vektörü ile bir ikili vektör ve 4-7 dpi ile infiltrasyon (dpi) sonrası gözlenenses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens protein üretimi için bir bitkiye ilgi konusu bir genin sağlanması için en yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Agroinfiltration N. derece iyi çalıştığını benthamiana ama nispeten zayıf Arabidopsis thaliana 46 de dahil olmak üzere pek çok diğer bitkiler içinde. Bu çalışmada, 5-6 haftalık N geçici protein üretimi için basit, etkin ve ekonomik bir yöntem geliştirdi benthamiana A kullanılarak infiltrasyonu Tumefaciens. Agroinfiltration tekniğin endüstriyel ölçekleme en büyük dezavantajı &#39;hasat bakteri ve 4&#39;-hidroksi-3 ihtiva eden bir ortam içinde bakteri pelet yeniden süspansiyon santrifüj olup, 5&#39;-dimetoksiasetofenon (asetosiringon), monosakkaritler, ve 2 - (N-morfolino) -etansülfonik asit (MES) vir genlerinin indüksiyonu için tampon. Biz Agrobakteriyi optimize ederek bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olmuştur </em&gt; AB ortamı (minimal ortamı) içinde büyüme doğrudan Milli-Q su içinde ve infiltrasyon süresini ve koşullarının kontrol ile inceltilir. Ayrıca vahşi tipli tütün ana türleri N. hedef protein üretimini karşılaştırmıştır ve N. benthamiana Excelsior, hem de melez N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Bitkilerde Agrobacterium aracılı geçici protein üretim kısa bir süre içinde aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, bu teknoloji sadece şimdi üstesinden ediliyor büyütmek için büyük ölçekli üretim gibi birçok teknolojik engellerin uygulanacak başlıyor. Burada, Agrobacteria başlatmak vektörleri taşıyan Nicotiana bitkiler vakum infiltrasyon göre endüstriyel ölçekli geçici protein üretimi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymaktadır. AB ortamı içinde Agrobacterium yetiştirme optimizasyonu sızma sürecinin basitleştirilmesi, Milli-Q su içinde bakteri kültürüne doğrudan seyreltme sağlar. Nicotiana, N., üç test edilmiş türler arasında, excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) nedeniyle sızma kolaylığı en umut verici ev sahibi olarak seçildi, yüksek muhabiri protein üretimi düzeyi, ve yaklaşık iki-fkontrol edilen çevre koşulları altında eski yüksek biyokütle üretimi. Agrobacterium örneğin asetosiringon ve monosakkarit gibi kimyasal madde kullanarak pBID4-GFP (Tütün mozaik virüsü-esaslı) barındıran indüksiyonu protein üretim seviyesi üzerinde herhangi bir etkisi olmamıştır. 30 ya da 60 saniye için 50-100 mbar altında infiltratif bitki bitki yaprak dokularının yaklaşık% 95 infiltrasyonu ile sonuçlanmıştır. Agrobacterium GV3101 ırkına laboratuar ile infiltrasyon Agrobacteria laboratuar suşları ve LBA4404 C58C1 ve vahşi tip Agrobacteria at77 ve A4, AT10, AT6 suşları ile karşılaştırıldığında en yüksek protein üretimi göstermiştir. N. bir viral RNA susturma bastırıcı, p23 ya da p19, ve Co-sentezleme benthamiana hedef proteinin (influenza virüsü hemaglutinin) önceki birikimi ve üretim artışı (% 15-25) ile sonuçlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.0K Görüntüleme.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi. 

Video: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biyoloji

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...