Bu ifade için basit bir yöntemin bir göstergesidir, çıkarma, ve rekombinant insan IgG arındırma Tütün ile ilgili Nicotiana benthamiana bitkilerde GFP erimiş. Bu protokol, bitki üretilen antikorların, antikor füzyonlarının ve kolon kromatografisi ile saflaştırılabilen proteinlerin çoğunun saflaştırılması ve görselleştirilmesi için kullanılabilir. Bu protokol, üniversite çalışma laboratuarlarında araştırmacıların ve öğrencilerin protein üretim sürecinin en adımlarında GFP etiketli proteinleri görselleştirmelerine olanak tanır.
Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve tam genişleme için turba pelet üzerinde daha önce haşlanmış, hala sıcak su dökün. Peletlerin tamamen genişlemesi birkaç dakika sürer. Paletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde iki ila üç Nicotiana benthamiana tohumları yerleştirin.
Bu yapıldıktan sonra, tepsinin alt kapsayacak şekilde su yaklaşık 0,5 inç dökmek gerekir. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketlemeyi unutmayın. Fideleri her gün uygun miktarda gübre ile sulamaya devam edin.
Tepsi bir humidome üst ve bir büyüme odasında yer ile kaplı olmalıdır. Tohumlu turba pelet 16 saatlik fotoğraf süresi ve% 60 bağıl nem ile 23-25 santigrat derece büyüme odasında tutulmalıdır. Bir hafta sonra, pelet sadece bir fide ile her turba palet bırakarak ekstra bir bitki kaldırın.
Bitkiler iki ila üç haftalık olduğunda, nem kontrollü toprak içeren ayrı bir pota her turba pelet aktarın. Her gün litre gübre başına bir gram ile fidanları sulamaya devam edin, toprağı asla tamamen kuru bırakmayın. Bitkiler 5-6 haftalıkken sızmaya hazırdırlar.
Bunsen brülör yanında aşağıdaki adımlar yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için temel aseptik teknikler uygulanmalıdır. Bir Lb kanamisin plaka gerekir. Mililitre kanamisin konsantrasyonu başına bir mikrogram.
istediğiniz kanamisin dirençli yapı ve bir gecede yetiştirilen barındıran iki mutasyon EHA105 ile sıkı. EHA105, Agrobacterium iki mutasyonunun en sık kullanılan suşlarından biridir. Kültüre başlamak için, lb medya 10 mililitre ile konik tüp doldurun, sonraki, mililitre kanamisin başına 100 mikrolitre 100 mikrolitre, ayrıca e-coli kontaminasyonunu önlemek için rifampisin mililitre başına 2,5 mikrogram 10 mikrolitre ekleyebilirsiniz.
Plakadan, yeni kültürünüzü geliştirmek için PCR tarafından doğrulanmış tek bir izole koloni kullanırsınız. İzole koloniseçin ve lb içine aşılamak. Aşıyı çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
30 santigrat derece ve 120-150 RPM gecede kuluçka. Ertesi gün, Agrobacterium kültürü 0,6 ile 0,9 arasında od600'e çekilirse sızma için kullanılabilir. Bir ila iki mililitre yukarıda büyümüş ise antibiyotik ile taze bir lb transfer edilmelidir ve gerekli OD600 yetiştirilen.
Uygun OD600'de kültürleri bir santrifüje yerleştirin, santrifüjün dengeli olduğundan emin olun. Bakteriyi 4, 500G'de oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj ile pelt. Her iki örnekten de üstünlük yapamazlar.
Sonra son OD'yi 0,4'e getirmek için her pelet ve bir X sızma arabelleği yeniden askıya alın. Her bir tüpte yapı başına 0,2 son OD'yi elde etmek için her IgG füzyon yapısının eşit hacimli kısmını hafif zincir yapısıyla birleştirin. Bir ataç ve beş ila altı haftalık ve benthamiana bitki adım bir alın.
Ataş keskin kenarı açık kullanarak yaprağın ilk epidermal tabakasında küçük bir delik yapmak. Yaprağı delmekten kaçının. İkinci adımdan hazırlanmış Agrobacterium çözeltisi ile bir mililitrelik şırıngayı iğne olmadan doldurun.
Şırınganın ucuyla bir önceki adımda yapılan deliği kapatın. Ve yavaşça yaprağın arkasından nazik karşı basınç uygularken yaprağın içine bakteri enjekte etmek için itin. Yaprağın çoğuna sızmaya çalışın ve yaprağı en fazla 3-4 kez dürtün, fazla yaprak hasarı protein verimini engelleyebilir.
Çözelti şırıngaya çok fazla basınç uygulamadan enjekte edilirken yaprağın koyulaşmasına dikkat edin. Sızmış bitki yaprağı çoğunlukla alt görünümden karanlık görünür. Bu bakteriyel çözelti nin her yapı için en az üç ila dört bitki için yeterli olması gerektiğini unutmayın.
Otoklav atmadan önce kalan bakteriyel çözelti. İğnesiz infiltrasyonu bitirdikten sonra, bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve her gün su almaya devam edin. Kloroz, nekroz ve GFP floresan, kış uzun ve kısa dalga UV lambası için gözlenen yapraklar.
Genellikle dördüncü ve beşinci günlerde en yüksek GFP floresansını gösterirler. Hasat dört ila beş gün sonrası infiltrasyon tüm yaprakları ve yaprak malzemenin toplam miktarını tartmak. Yaprak malzemeyi hemen aşağı işleme için kullanabilirsiniz, ya da negatif 80 santigrat derece ye kadar dondurabilirsiniz, kullanılmaya hazır olana kadar sızmış bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve günlük olarak su almaya devam edin.
kloroz, nekroz, infiltrasyonlu bölgelerde renk ve yaprak dokusu ölümü değişiklikleri için yaprakları gözlendi. GFP floresan için gözlenen bitkiler. GFP uzun ve kısa dalga UV lamba altında mevcut ise.
Protein ekspresyonu zamanla artar, her iki GFP yapılarının en yüksek floresansı genellikle dört ve beş gün arasında meydana gelir. Hasat dört ila beş gün sonrası infiltrasyon tüm yaprakları ve toplam yaprak malzeme tartmak. Akış aşağı işlemleri için hemen kullanın veya kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede dondurun.
Harmanlama işlemi sırasında, kullanmadan önce buz veya dört derece santigrat tamponlar ve blender bardak tutmak için emin olun. Dördüncü adımdan itibaren bitki dokusunu duruşma öncesi blender kabına yerleştirin. Blender kabına ilgili PMSF ve sodyum askorbat konsantrasyonları içeren soğutulmuş ekstraksiyon tampon.
Blender fincanı blender üzerine yerleştirin, para film önceden kesilmiş bir levha almak ve blender fincan üstüne streç. 22 aralıklarla 80 hayal için ekstraksiyon tampon ile yaprak dokusu karıştırın. Gerektiğinde karışım döngüleri arasında iyice karıştırmanız gerekir.
Karışım yaprak malzeme parçaları olmadan homojen görünmelidir. Harmanlanmış malzemeyi bir kabına aktarın. Bir tavada ve protein çözünürlüğünü artırmak ve katı ların yağış sağlamak için 30 dakika boyunca dört derece santigrat için karıştırın.
Buz üzerinde temiz bir bez üzerinde çıplak bez iki kat yerleştirin ve büyük yaprak enkaz kaldırmak için üzerinden özü dökün. Tüm özü ayna bezi ile dökülür sonra artık yaprak ekstresi sıkmak için ayna bezi katlayın. Ekstre görünür partiküller olmadan koyu yeşil görünmelidir.
Özü santrifüj tüplerine aktarın. 4 santigrat derece 20 dakika için 16, 000Gs ekstresi santrifüj. Bu, çözünmez herhangi bir malzeme yiyecektir.
Her iki tüpün de dengeli olduğundan ve rotor kapağının güvenli bir şekilde sıkDığından emin olun. Santrifüjden sonra, pelet görünür olmalı, supernatant demek ve pelet atın. 50 mililitrelik şırınga ve cam elyaf filtresi kullanarak supernatant filtre.
Daha sonra analiz için bir örnek ve etiket ham özü 50 mikrolitre toplamak. 20 mililitre numune tutan bir polipropilen sütun ayarlayın. Hedef immünglobulin tipine ve rezorine olan yakınlığına bağlı olarak gerekli bulamaç miktarını tahmin edin.
Bu gösteride, üç mililitre bulamaç kullanıyoruz. Genellikle 1.5 mililitre yatak hacmi ile toplam bulamaç üç mililitre antikor birkaç miligram saflaştırma için etkilidir. Kapaklı kolona gerekli miktarda yeniden askıya alınmış bulamacı dikkatlice pipetle.
Sütun çıkışını sütunun altındakinden açın ve arabellek gidene kadar boşalmasını bekleyin. Hemen üzerine bir kez PBS yıkama tampon 10 mililitre dökün. Drenaj ve bu yıkama adımı iki kez tekrarlayın.
Filtrelenmiş örneği beşinci adımdan sütuna uygulayın ve akış tantanasını toplayın. Aliquot 50 mikrolitre akış-through daha sonra analiz için. Antikor rezorna bağlanmadı diye akan geri kalanı kaydedin.
Spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için reçiyiyi bir kez PBS'nin 10 mililitresiyle iki kez yıkayın. İstenirse, aliquot 50 mikrolitre yıkama tampon udoğrulamak için sütun üzerinden drenaj hedef antikor bir yıkama tampon ile ima olmadığını doğrulamak için. Yıkama tamponu reçine, kurulum ve etiket beş mikro santrifüj tüpler ifin ile çalışırken steril 125 mikrolitre, bir molar tris-HCL pH sekiz elüsyon tampon nötralize etmek için.
Alternatif olarak, daha konsantre eluate almak için iki azı tris baz 30 mikrolitre ekleyin. Elüsyon sırasında, UV ışığı görselleştirme için kullanılabilir. Bunun elüsiyon süresi boyunca yapılması gerekmez.
Uv kullanılıyorsa, gözlere ve cilde zarar vermemek için uygun kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Uv ışığının elüsyon adımı sırasında kullanılması gerekmez. Kolona beş mililitre elüsyon tamponu uygulayarak antikorları eute ve bir mililitre fraksiyonları toplamak, önceki adımdan her belirlenen tüp için.
Hemen 20 mililitre ve ardından 10 mililitre yıkama tampon uygulayarak sütun uyenin. Resenin asidik bir ortamda uzun süre bırakılmadığından emin olun. Elüsyon floresan görünmelidir.
Genellikle en yüksek floresan ikinci elution görülür, ancak çıkarma çıkarma değişebilir. Depolama için, reçin 10 mililitre ile yıkayın 20% etanol ve PBS ve yarıya drenaj sağlar. Üst, sonra sütunun alt recap ve dört derece C.280 nanometre de emiciölçme bir fotoğraf spektrometresi kullanarak antikor konsantrasyonu belirleyin dik tutun.
Daha fazla analiz için ayrı bir tüp için negatif 80 santigrat derece ve aliquot her fraksiyonun 50 mikrolitre de eluates saklayın. Genellikle protein süreleri önemli verimlilik kaybı olmadan 10 kata kadar yeniden kullanılabilir. 280 nanometrede emiciliği ölçerek bir spektrofotometre kullanarak antikor konsantrasyonu belirlemek için üreticinin yönergelerine bakın.
Daha fazla analiz için ayrı bir tüp içine eksi 80 santigrat derece ve aliquot her fraksiyonun 50 mikrolitre eluates saklayın. Zs sayfası ile saflaştırılmış protein analizi standart protokoller izleyerek yapılabilir. GFP içeren bir yapının klonlama, sızma ve ekspresyonu başarısını gösteren bir sonuç olarak gözlenen floresan.
Birkaç gün boyunca, floresan lar dördüncü ve beşinci günlerde yüksek floresan ile kademeli olarak artmalıdır. Protein G kullanıldığında floresan protein bağlanması ve kolondan sonraki elüsiyon kararlı bir GFP olarak içeren bir IgG füzyon saflaştırma gösterir. Ve UV maruz jel, merdivensadece 25KDa ve 75KDa bantları görebilirsiniz.
Ayrıca, azaltılmış olmayan elution 2 örnek görebilirsiniz. Azaltılmış olmayan elüs, kararlı GFP füzyonu olarak bozulmamış bir IgG'den beklenilen göreceli boyut olarak floresansını korur. Coomassie leke jelinde hem azaltılmış hem de indirgenmeyen numuneler görselleştirilir.
Tüm merdiven bileşenleri görünür, yerli proteinler ve IgG füzyonlar toplam ekstre supernatant görülebilir ve örnekler aracılığıyla akış. Yıkama IgG füzyon küçük bir miktar içerir. Elüsyon bir ve dört çoğu protein genellikle ikinci ve üçüncü elüsyon adımlarından kurtulmuş olduğu gibi beklendiği gibi daha az konsantre protein içeriyordu.
Elution 2 non reducing de birden fazla bantları tüm azaltma elüsyasyon örnekleri var görülebilir. 75KDa, GFP'ye ağır zincir sigortasını gösterir. 50KDa tek başına ağır bir zincir gösterir, 25KDa tek başına bir hafif zincir gösterir, ve 10 KDA büyük olasılıkla proteaz inhibitörleri eklenmesi ile önlenebilir bozulma gösterir.
Bu protokol, istenilen hedef proteine kaynaşmış herhangi bir antikorun saflaştırılması için kullanılabilir. Bu süreç çeşitli miktarda yaprak materyalini barındıracak şekilde düzenlenebilir ve aynı zamanda protein çıkarma ve saflaştırma işlemlerinin tamamlanmasından önce, sırasında ve sonrasında protein varlığının görsel olarak belirlenmesini sağlar. Bu yöntemler kontrol olarak yararlı olabilir ve teknikleri öğretmek için bir amaç olabilir.
