Bu çalışma NIH hibe R01 CA107469, R01 CA125577 ve CG Kleer, Michigan Kanser Merkezi Destek Üniversitesi U01CA154224 tarafından desteklenmiştir.

1.. Malzemelerin hazırlanması ve Kültür Medya <ol><li> 4 ° CO / N. de (GFH) Matrigel azaltılmış Çözülme büyüme faktörü </li><li> 37 ° C&#39;de bir hücre hattı için gereken ortam tam Isınma MCF10A-ATCC ortamı kullanın; HME-Ham&#39;ın F-12 ortamı,% 5 fetal inek serumu, 1 ug / ml hidrokortizon, 5 ug / ml insülin, 10 ng / ml EGF ve 100 ng / ml, kolera toksini ile takviye edilmiş; % 5 FBS, 2 ug / ml hidrokortizon ve 5 ug / ml insülin ile takviye SUM149-Ham&#39;ın F-12 ortamı; ve MDA-MB-231-10% FBS DMEM- </li><li> Buz üzerinde bir 8-iyi odasının slayt önceden soğutmak. </li><li> Doku kültürü kaputu ve malzemeleri hazırlayın. </li></ol> 8-iyi Odası Slide 2. Üç Boyutlu Kültür <ol><li> Coat her GFR Matrigel 40 ul 8 oyuklu slayt de. Slayt merkezinde Matrigel ekleyin ve sonra bir P200 pipet kullanarak yayıldı. Kabarcıklar kaçınarak ve yol açabilir overspreading, mümkün olduğunca eşit yaymak için çalışınmenisküs oluşumu. </li><li> % 5 CO2 altında 37 ° C &#39;de kuluçkaya bırakın. Matrigel katılaşan iken, hücreleri trypsinize toplamak ve 4 dakika boyunca doku kültürü santrifüj içinde 150 x dönerler. </li><li> Hücre sayımı ve ilgili hücre hattının komple ortamı içinde 12,500 hücre / ml olacak şekilde seyreltin. % 2 GFR Matrigel ekleme ve Matrigel önceden kaplanmış slaytı her çukuruna 400 ul ekle. </li><li> CO2 inkübatör slaytlar inkübe edin. 15 gün kadar her 4 th gün taze eksiksiz bir medya değişiklikleri ver. </li><li> GFR Matrigel üzerinde büyüyen hücrelerin önleyici çalışmalar sırasında her üç günde bir taze inhibitörleri ile takviye edilmiş ortam değişiklikleri takip kaplama zamanda tam ortam için küçük molekül inhibitörleri eklemek için: farmakolojik inhibitörleri ile tedavi. </li><li> Saflaştırılmış proteini ile tedavi: <ol><li> Hücreleri plaka aşağıdaki 2,1-2,3 adımları. Kültürler, serum starvati, ardından 4 gün boyunca büyümeye izin16 saat on. </li><li> 5. günde, FBS serum açlık hücrelere ortam ilave% 0.1 &#39;in saflaştırılmış proteinin uygun bir konsantrasyonu ile muamele hücreleri. 2 gün sonra, saflaştırılmış protein ile taze ortam değişikliği verin. </li><li> 10. günde tam HME medya ile klimalı ortamı değiştirin. Kültürler, başka bir 5 gün için büyümeye izin verin. </li></ol></li><li> Matrigel yetiştirilen asiner yapılardan İmmünofloresan boyama: <ol><li> % 2 paraformaldehit,% 0.5 Triton X-100 ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde 100 mM glisin hazırlayın. % 0.1 sığır serum albümini,% 0.2 triton X-100,% 0.05 Tween-20 ihtiva eden 1x PBS ihtiva immünofloresan tamponu (tampon IF) hazırlayın. </li><li> Dikkatli klimalı medya aspire P200 pipet kullanın. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT),% 2 taze hazırlanmış paraformaldehit ile asinar yapıları tamir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile hücrelerin permeabilize </li><li> Kültür yıkayıns üç adet 100 mM glisin, her bir yıkama için 10-15 dk kez. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için birinci blok adı IF tamponu içinde% 10 keçi serumu, ile hücrelerin bloke eder. </li><li> 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab &#39;), 30 dakika boyunca birinci blok tamponu içinde 2 fragmanı olan kültürleri inkübe edin. Bu adım, Matrigel &#39;de immünoreaktif fare IgG türler engellemek için önemlidir. </li><li> İkinci bloke çözeltisi içinde birincil antikor ile inkübe 4 ° C &#39;de (Birincil blok 20 ug / ml keçi anti-fare F (ab&#39;) 2 fragmanı) O / N </li><li> 10-15 dakika hafifçe çalkalanarak her biri için IF tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> 45 dakika boyunca IF tampon maddesi içinde floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca yıkama 3x hafifçe çalkalanarak IF tampon maddesi ile her biri. </li><li> Çekirdekleri görselleştirmek için DAPI içeren anti-solmaya reaktif ile slaytlar monte edin. </li><li> Slaytlar, oda sıcaklığında O / N kurumasını bekleyin. </li><li> Görüntü elde etme: koloni mi konfokal görüntüler eldeMatrigel üzerinde yetiştirilen hücreler dsection. Daha fazla bilgi için Z istifleme ile asinar yapının tüm uzunluğu boyunca optik bölümleri bir dizi kazanır. </li></ol></li></ol> 3. İmmunoblotting 2-iyi Odası Slaytlar Üç Boyutlu Kültür <ol><li> Buz üzerinde 2-iyi odasının slayt önceden soğutmak. Adımları 2,1-2,4 Matrigel 160 ul 2-çukurlu oda slayt örneğin kat için reaktifler arttırmak ve hücre / 1.6 ml Matrigel 2 oyuklu sürgünün her oyuğuna ilave edin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ticari olarak temin edilebilen 3 boyutlu kültürü hücre hasat etme kiti kullanılarak Matrigel gelen asinar yapıları hasat. </li><li> 1x ve 4 ° C&#39;ye önceden soğutmak için yıkama, hücre ve hücre hasat tamponlar seyreltin Matrigel Yıkama ve yıkıldığında buz üzerinde yürütülmelidir. </li><li> Hücre yıkama tamponu kullanılarak 3x asiner yapılar yıkayın. </li><li> Hücre hasat met kullanılarak 15 ml santrifüj tüplerine asinüsü toplayınffer 4 ° C&#39;de bir sallama düzeneği üzerinde 30 dakika kuluçkalandı ve ardından 1 ml pipet ile iyice süspansiyon karıştırın. Bu küçük parçalar halinde Matrigel kırmak ve hücre hasat tamponu içerisinde hücrelerin en yayınlayacak. </li><li> Bir kültür santrifüj içinde 200 xg&#39;de hücreleri Pelet. Bir P200 pipet ucu ile hücreleri topak haline hidrojelin yüzen katmanı kaldırın. </li><li> Kit ile birlikte verilen, SDS numune tamponu içerisinde yeniden süspanse lizatları. RIPA liziz tamponu da kullanılabilir. </li></ol> Malign vs Benign Meme Fenotipinin 4. Kantitasyonu <ol><li> 2,1-2,4 aşağıdaki adımları, her bir tedavi grubu için üç kopya halinde hücreleri büyütün. </li><li> 5X veya bir slayt değiştiren ve bir bilgisayara bağlı bir faz kontrast mikroskop kullanılarak 10X çözünürlükte her kuyudan asiner yapılardan faz kontrast görüntüleri çekmek. Başka bir çerçeveden slayt hareket eden ve bu nedenle sürgünün odacıklı tüm kuyu kaplayarak görüntüleri al. </li><li> Asiner yapılardan toplam sayısını,Tek bir yuvarlak yassı asinüs ve multiacinar yapıların veya organizasyon yoksun gelişigüzel büyüyen yapıların sayısı ve ondan çıkan dallanma süreçleri ile sayısı. </li><li> Tek yuvarlak yassı asiner yapılardan vs malign yapıların yüzdesi ve sütun grafiği olarak arsa hesaplayın. Student t-testi ile önemini hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li><li>Rosen, P. P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Burada bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde göğüs epitel hücrelerinin üç boyutlu kültür ve habis genel iyi huylu göğüs fenotip arasında ayrım yapmak için, bu sistemin yararını tanımlamışlardır. Bu sistem aynı zamanda, diğer glandular dokulardan kültür farklı hücre tipleri için kullanılabilir ve başarılı bir kaç 12-14 isim, kültür prostat epitel, bronşiyal epitel ve epitel hücrelerine tiroid kullanılmıştır bildirilmiştir. 3D kültür önemi, fizyolojik olar...

Yeniden oluşturulmuş bazal zar üzerinde göğüs epitel hücrelerinin kültür üç boyutlu (3D) karmaşık fenotip ve normal meme ve meme kanseri 2,3 bağlantılı sinyal incelemek için önemli bir model sistem. Memenin fonksiyonel birim içine asinüs hangi dal küçük bir kanal oluşur terminal lobular kanal ünitesi (TDLU) &#39;dir. Acininin bir bazal membran 5 tarafından çevrelenmiş olan iki hücre tabakası, epitelyal ve myoepitelyal hücreler, oluşan yüksek derecede organize yapılar bulunmaktadır. Normal asinüs en ayırt edici özellikleri hücresel kutuplaşma, altta yatan bazal membran bağlanma ve özel hücre-hücre temas vardır. Bu karmaşık örgüt invaziv tümörlerde bozulur. Hücre mono tabakaları olarak yetiştirilen yaygın olarak kullanılan 2 boyutlu kültürler, asinüs oluşumu için izin yoktur. Bu nedenle, tek tabakalı bir kültür epitel hücreleri arasındaki karmaşık ilişkiyi yakalamak için bir sistem temin yoksundurnormal göğüs ve göğüs kanserinde kendi düzensizleşmesine. Meme hücrelerinin fonksiyonel tek tip epitel kültürleri çeşitli laboratuarlar 2,3 geliştirilmiştir. 3D kültür Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinden türetilen bir çözünebilir ekstresi ve ticari olarak mevcuttur, Matrigel üzerinde göğüs hücrelerinin büyümesini kapsar. Kolajen gibi diğer 3D katmanlarından Ben de kullanılmaktadır. Meme hücreleri hücreleri, Matrigel 2 gömülü kültürlenir 3D gömülü deneyi ile 3D kültürlenebilir. Alternatif olarak, hücreler de bu Matrigelin az bir hacim gerektirir, ve faz kontrast görüntüleme ile koloni oluşumunun zaman atlamalı izlenmesini kolaylaştırır ve in situ görüntüleme 2 için ideal olduğu gibi maliyetli 3D bindirme deneyi olarak adlandırılan, üst deneyine 3D kültür edilebilir -3. En iyi tahlil üzerinde 3D ​​asinar fenotip ve gen ekspresyon profili 7 arasındaki ilişkiyi tanımlamak için kullanılmıştır. 3D kültür effectiv edilebilirely invaziv karsinom normal ve iyi huylu hücreleri ayırt etmek için kullanılır. Normal ve iyi huylu meme hücrelerinin invaziv karsinom hücreleri lümen hiçbir temizlenmesi ile üretken ve gelişigüzel büyümeye ise büyüme Matrigel merkezinde iyi tanımlanmış lümen polarize yapılar tutuklandı oluştururlar. E6/E7 insan meme epitelyum hücreleri ve fibrokistik değişiklikleri ile bir 36 yaşındaki hastadan izole edilmiş bir kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş hücre hattı, başarılı bir 3D 3,8 olarak iyi huylu göğüs fenotipi geri almak için kullanılmış olan ve yapmış olduğu MCF10A hücre hattı, ölümsüzleştirilmiş Birkaç moleküllerin 8,9 onkojenik ve tümör baskılayıcı fonksiyonunu incelemek için bir model sistem. Bu iyi huylu hücre lentivirüs / retrovirüs tanıtımı ile, ilgilenilen gen (ler) işlemek için tasarlanmış olabilir. Ilgi konusu gen (ler), bir tümör bastırıcı ise ilgi konusu genin benign hücrelerde onkogen aşın ise, shRNA aracılık ettiği portatif ise kötü huylu bir dönüşüme yol açacaktırhabis bir fenotipe göstermelidir. Her iki durumda da 3 boyutlu olarak oluşturulmuş akinar yapılar habis dönüşüm yakalayabilir. 3D kaplama huylu tek hücreler küresel yapılar çoğalırlar ve yuvarlak oluşturmaya başlar. Gün 5-8 hücreleri, bu küresel toplam Matrigel ile temas halinde olan hücre çevreleyen bir polarize tabakası ve Matrigel ile temas eksikliği az polarize hücre, bir iç bir kitle halinde ayırt edecektir. Önümüzdeki 10-15 gün içinde iç hücreler apoptosis açık bir lümen oluşturarak ölmeye başlayacak. Malign hücreler gelişigüzel polaritelerini kaybetme büyüyecek. Son derece habis hücreler genellikle yapıları dallanma oluştururlar. Fenotip bu farklılıklar, zaman atlamalı faz kontrast görüntüleme ve yerinde ilgili moleküler belirteçlerin ile immünboyama tarafından yakalanabilir. En sık kullanılan işaretleyiciler çoğalma işaretleyici fosfo histon 3 ile apoptot ile kombinasyon halinde, alfa 6-integrin, bir taban kutup işaretleridiric işaretleyici kaspaz-3 ayrılır. İkincisi asinüs merkezinde, normal ve iyi huylu meme hücrelerinin bir özellik olarak lümen oluşumu olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Diğer polarizasyon ve hücre-hücre temas belirteçleri GM130, laminin, şey, E-kadherin içerir. Seçenek olarak, göğüs kanseri hücre çizgileri, ilgi konusu geni işlemek için tasarlanmış olabilir. Tutuklandı daha büyümeye Bu durumda, eski haline dönme olarak iyi huylu fenotip olarak kullanılabilecek bir kanser fenotipi ayırt etmek okunur. 3D kültürü de dikkatle habis dönüşüm 10-11 katılan sinyalleme yolunu tanımlamak için kullanılabilir. Kullanılarak yukarıda salt çıkışları, farmakolojik inhibitörleri, bloke edici antikorlar veya rekombinant proteinleri söz habis dönüşüme neden olan moleküler sinyali de kesin olarak belirlemek olabilir kullanılabilir. Çeşitli laboratuvarların sürekli çabaları sayesinde RNA izole etmek ve aynı zamanda immunoblotlama ve immünohistokimyası için lizatlarını hazırlamak için 3 boyutlu hücreleri çıkarmak mümkündürnoprecipitation. Bu stratejiler, protokolde bir adım adım ve ayrıntılı bir şekilde tarif edilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

Invaziv meme karsinom metastaz komşu doku ve eğilimi işgali ile karakterize malign epitelyal tümörlerin bir grubuz. Kanser hücreleri ve bunların mikro arasındaki sinyallerin etkileşimi meme kanseri büyüme ve biyolojik davranışı 1 üzerinde güçlü bir etkiye sahip. Ancak, hücre dışı matrisin bu sinyallerin çoğu kaybolur ya da hücreler, bir tek tabaka iki boyutlu kültürü (2B) yetiştirilen onların İlgiye understudied edilir. Son yıllarda, bir tekrar oluşturulmuş temel membran üç boyutlu (3D) bir kültür iyi huylu ve habis meme hücrelerinin doku mimarisi özetlemek için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. 3D yetiştirilen hücreler, hücre dışı matris arasındaki önemli ipuçları korumak ve fizyolojik olarak uygun ex vivo sistem 2,3 sağlar. Notun, 2D 4 kıyasla 3D yetiştirilen hücreler, farklı davranabilir düşündüren kanıtlar artmaktadır. 3D kültüretkin bir şekilde 3 dahil iyi huylu göğüs fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için bir araç olarak ve hücresel ve moleküler sinyal destekleyen için kullanılabilir. Iyi huylu epitelyal hücrelerin ayırt edici özelliklerinden biri, apikal sitoplazma lümenine doğru ve bazal sitoplazma bazal membran üzerinde durmaktadır, böylece de polarize edilmiş olmasıdır. Bu apico-bazal polarite hücresel örgütsüzlük ve gelişigüzel çevreleyen dokudan infiltrasyonlar tübüllerini anastomoz ve dallanma oluşumu ile karakterize edilir invaziv meme kanserleri, kaybolur. Benign bezi ve invaziv karsinoma arasındaki bu histopatolojik farklılıklar 3D 6,7 çoğaltılabilir. Diğer moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri, 3D Kültür ile birlikte hücre çoğalması, polarite ve apoptoz valide moleküler belirteçlerin ifade diferansiyel, tek yuvarlak asiner yapılardan niceliğinin gibi uygun okuma-çıkışları ya da kullanmae daha malign dönüşüm sırasında ve sorumlu sinyalizasyon tasvir için hücresel değişiklikleri anlamak için önemli bir araç sağlayabilir.

3D kültür etkili iyi huylu meme insan meme epitel hücre malin fenotipi ayırt etmek için kullanılabilir. Matrigel kaplı tek huylu hücreleri kolayca faz kontrast görüntüleme kullanarak bir düzlemde tek yuvarlak yassı asinüs olarak görüntülü olabilir organize küresel yapılar olarak büyür. Matrigel kaplı bir habis hücrelerin, gelişigüzel büyümesi çok yüksek bir kırılma indeksi göstermektedir ve bir düzlemde görüntüsü zordur. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, yüksek...

Watch this Scientific Journal Video about Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells at JoVE.com

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K Görüntüleme.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir. 

Video: Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Tıp

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Derin Beyin Uyarım ile Saccadometry kullanarak normal ve patolojik beyin fonksiyonlarını incelemek için

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based three-chamber bags (3CBs) and soybean-oil-based compounded bags (CoBs) in hospitalized adult patients. We designed a multicenter, randomized, prospective, open-label, noninferiority protocol to compare the efficacy, safety, and distribution of olive-oil-based 3CBs and soybean-oil-based CoB formulations in adult Chinese patients requiring PN during surgical intervention. Subjects were randomized to receive either one of the study treatments using an interactive voice or web-based recognition system in accordance with the randomization code. Randomization was further stratified based on the study site and surgical category. Both treatment groups received similar amounts of calories and protein. In addition, the two study treatments contained a similar composition of the amino-acid component. The only difference between the two PN formulations was the lipid constitution. The duration of administration of study treatments was a minimum of 5 days up to a maximum of 14 days after the surgical procedure. The primary efficacy endpoint was serum prealbumin levels on day 5 of the study. Noninferiority was proved if the anti-log of the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the treatment difference was at least 0.80. Other efficacy measures included treatment preparation time; duration to achieve tolerability of oral nutrition; associated infectious complications; length of hospitalization; and laboratory assessment of markers of nutrition, inflammation, metabolism, and oxidative stress. A total of 458 patients were enrolled in the study. The results showed that olive-oil-based 3CBs were non-inferior to soybean-based CoBs, besides being well tolerated. The infection rate was found to be significantly lower in the olive-oil-based 3CB group. Thus, this study may be used as a reference for future research on lipid emulsion and 3CBs.

Here, we present a protocol for a study comparing the efficacy, safety, and delivery of olive-oil-based 3CB and soybean-oil-based CoB formulations in adults requiring parenteral nutrition. The results revealed that olive-oil-based 3CBs is non-inferior and well tolerated compared to soybean formulations.