Bu çalışma Sağlık Bakanlığı, Ulusal Kanser Enstitüsü (1R21CA141039), BD Biosciences Araştırma Bursu Ödülü, Kanser için Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53), Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi Araştırma ve Sağlık Araştırma ve Alberta Kanser Araştırma Kurulu Girişimleri Programı Kanada Enstitüleri. MP Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Önleme Staj Programı tarafından desteklenmiştir (R25CA128770; PI: D. Teegarden) Onkolojik Bilimler Merkezi ve Purdue Üniversitesi Discovery Öğrenme Araştırma Merkezi tarafından yönetilmektedir.

1.. Advance Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de steril serolojik pipet ve pipet uçları tutun Sorun Giderme: oda sıcaklığında (RT) Matrigel jeller, soğuk pipet ve ipuçlarını kullanarak kültür kurulumu sırasında jelleşmesini Matrigel önleyecektir. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de Matrigel bir şişe çözülme. </li></ol> 2. Reaktifler hazırlanması <ol><li> Fibronektin stok çözeltisinin hazırlanması: damıtılmış su, 100 ml 100 mg insan fibronektin eritilerek fibronektinin bir 1 mg / ml stok çözeltisi olun. En fazla 6 ay boyunca 4 ° C &#39;de fibronektin çözündükten sonra steril filtre, kısım ve mağaza. Sorun: fibronektin hızlı bir şekilde çözülür, 37 ° C&#39;de bir su banyosu kümesindeki bir kaç dakika için bir çözüm inkübe etmezse </li><li> 10x PBS hazırlanması: 80 g sodyum klorid NaCl, 14.4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCI ve 2.4 g KH 2 PO çözündürülür <sub&gt; damıtılmış su, 1 L 4. 7.4 steril filtre pH ayarlama, ve en fazla 6 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Nötralizasyon tampon 20 preparasyonu: 1 M HEPES ve 10x PBS solüsyonları kullanılarak 2 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 100 mM HEPES içeren bir solüsyon yapın. 7.0 çözeltinin pH ayarlayın. 2-3 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Fare kuyruk kolajeni tip 2 mg / ml eriyiğinin hazırlanması I: nötralizasyon tamponu (adım 2.3) de bir 2 mg / ml kolajen I çözüm olun. Düşük hızda çözüm vorteks ve aşağı yukarı pipetleme ve hafifçe karıştırın. Bu kollajen çok viskoz gibi, pipetleme sırasında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek. Bu her zaman yeni kolajen I çözelti hazırlamak için tavsiye edilir. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun çözeltisi. </li><li> Endosteal kaplama (parçalamak) hazırlanması: 1x &amp; in, 2 mg / ml kolajen I stok (2.1 ve 2.4 &#39;e adımları) 77 ug / ml&#39; lik bir nihai konsantrasyona kadar ve 29 ug / ml ile 1 mg / ml stok, sırasıyla fibronektin karıştırın# 160; steril PBS. Mix ve 1 aya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yeniden kemik matrisi (RBM) hazırlanması: <ol><li> Buz üzerinde ön soğutma 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri. Her zaman buz üzerinde bütün matris çözümleri tutun. </li><li> 4 parça Matrigel (Matrigel konsantrasyon çok partiye değişiklik gösterir, ancak önemsiz varyasyonlar olduğu bulunmuştur), 1 mg / ml fibronektin 2.5 parça ve ilk pipetleme Matrigel ile buz üzerinde 2 mg / ml kolajen I halinde 1 parça karıştırın Tüp soğuk pipet uçları kullanılarak ve daha sonra Matrigel 4 ° C üzerinde sıcaklıklarda katılaşan başlar, bu Matrigel pipetleme ise hızlı bir şekilde çalışacak fibronektin ve kollajen I. ekleyin. Kabarcıkları tanıtan önlemek, aşağı yukarı pipetleme ve çok yavaşça matrisi karıştırın. RBM karıştırma sırasında buz üzerinde tüpler tutun. </li></ol></li><li> Kemik iliği büyüme ortamı (BMGM) hazırlanması: 6.2 x 10 -4 M CaCl2, 10 -6 M sodyum süksinat, 10 -6 M hidrokortizon,% 20 insan plazması içeren (BMGM 500 ml olunRPMI-1640), normal ve sağlıklı vericilerden veya hastalardan toplanan habis ve% 1 penisilin / streptomisin. CaCl2, sodyum süksinat, hidrokortizon ve ek 1000 x stok çözeltiler olarak&gt; 6 ay boyunca -80 ° C&#39;de saklanabilir. Hücre hatları büyüme olduğunda, fetal sığır serumu (FBS), insan plazma için ikame edilebilir. </li><li> % 10 luk nötral tamponlu formalin (NBF) hazırlanması:% 10 v / v de PBS 1x% 37 formaldehit stok solüsyonu ekleyin İyice karıştırın ve ışıksız bir ortamda 2-3 hafta boyunca oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlanması: BSA uygun miktarda tartılır ve 1 x PBS içinde çözülür. 4 ° C&#39;de saklayın ve 1 hafta içinde kullanın. BSA çözüm daha uzun süreler için buzdolabında muhafaza edilmesi durumunda kontamine almak eğilimindedir. Seçenek olarak ise, BSA çözeltisi, uzun süreli depolama için parçalara ayrılmış ve -20 ° C de dondurulabilir. Donma-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> Hücre elde çözeltisi (CRS) hazırlanması: 5 mM EDTA, 1 mM sodyum vanadat (Na &lt;Yap1x PBS sub&gt; 3 VO 4) ve 1.5 mM sodyum flüorür (NaF) çözeltisi. 6 aya kadar 4 ° C&#39;de steril filtre ve mağaza. </li></ol> 3. Malign olmayan ve Malign İnsan BM Hücreleri Gömülü 3-D Kültürü <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre Ficoll-Plaque gradyan santrifüj ile primer mononükleer hücreleri BM arındırın. İsteğe bağlı adım: hücreler kültür süresi boyunca hücre çoğalmasını takip etmek, üretici talimatlarına göre 0,25 uM carboxyfluorescein diasetat süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenebilir. Sorun Giderme: hücreler CFSE boyama sonra ölürsem, konsantrasyon hücre türüne bağlıdır olarak CFSE miktarını titre; 0.25 mikron birincil BM mononükleer hücreler için iyi çalışır. </li><li> 48-çukurlu bir doku kültür plakasının her tedavi oyuğuna parçalamak çözeltisinin 65 ul ekle. Kuyunun tüm yüzeyini kapsayacak şekilde eşit olarak yayıldı ve çözelti&gt; 30 kuluçkalayınoda sıcaklığında min. </li><li> Bir 48-yuvalı plaka içinde çukur başına 1 x PBS içinde 10 ul 0.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu hazırlayın. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, göz başına RBM matris 100 ul hücre süspansiyonu karıştırılır. Hafifçe aşağı yukarı pipetleme hücreleri ve RBM matris karıştırın; kabarcıkları tanıtan kaçının. Matrisin jelleşmesini önlemek için buz üzerinde hücre / matris karışımı tutun. Not: RBM sistemi tam olarak ölçeklenebilir, kullanılan plakanın yüzey alanına dayalı tüm reaktifleri (matrisler ve orta) miktarlarını ayarlamak olmayan bir 48-çukurlu formatta, sistemi kurmak için. Buna göre kaplama için hücre sayısını Scale. </li><li> Kalan parçalamak aspire ve bir kuyunun merkezi haline hücre / matris karışımı ekleyin. Hızlı, eşit kuyunun bütün yüzeyini kapsayacak şekilde hücre / matris karışımı yayıldı. 37 ° C de 30-60 dakika için plakayı,% 5 CO2 doku kültürü kuluçka makinesi matris katılaşmaya izin vermek. Sallamayın ya da dis etmeyinKuluçka sırasında plakayı TURB. Sorun Giderme: RBM hücrelerin eşitsiz dağılımını önlemek kaplama için de önce karıştırın. Her 5. de tüpün altına yerleşen hücreleri önlemek için kaplama sonrası karıştırın. Bir kez kaplama, hücreler, matris içinde yüzey gerilimi nedeniyle kuyunun dibine çöker yoktur. Sorun Giderme: RBM hücrelerin eşitsiz dağılımını önlemek kaplama için de önce karıştırın. Her 5. de tüpün altına yerleşen hücreleri önlemek için kaplama sonrası karıştırın. Bir kez kaplama, hücreler, matris içinde yüzey gerilimi nedeniyle kuyunun dibine çöker yoktur. </li><li> Bir su banyosu içinde ön ısıtılması BMGM 37 ° C olarak ayarlanmış </li><li> 30 dakika sonra, matris doğru ayarlanmış olduğunu kontrol edin, bu plaka hareket ettirildiğinde hareket etmiyor tabakası gibi yumuşak bir jel oluşturur. Sıcak BMGM 1 ml hücre / matris katmanı kaplar. Çok nazikçe matris pipet orta yırtılmasını önlemek için kullanıyor (drop-by-damla dağıtım)serolojik bir pipet. 37 ° C, istenilen süre boyunca% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe ve kültür içine monte RBM kültür yerleştirin. Not: Hücre canlılığı, orta değiştirmeden en az 30 gün boyunca muhafaza edilir; ortam değişim gerekli ise, sadece her zaman ortam% 50 değiştirin. Kritik adım: Soğuk sıcaklığı önceden ayarlanmış matris rahatsız olabilir gibi orta soğuk olmadığı önemlidir. Bu yumuşak matris katmanı bozabilir de matriks üstüne orta fışkırtma dikkat çekmek. Sorun: RBM sisteminde hücre canlılığı düşük ise, hücre yoğunluğu BM sıvıda primer mononükleer hücrelerde hem diğer hücrelerde ile çalışırken deneysel olarak tespit edilmesi gerekebilir. Hücre hatları ile birlikte çalışırken, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, primer hücrelerde daha hızlı prolifere olarak, hücre sayısı 10-kat azaltılır. </li></ol> 4. &#39;In-matris&#39; Görüntüleme <ol><li><strong&gt; Işık mikroskopisi <ol><li> Resim parlak alan kullanılarak doğrudan RBM olarak kültürlenmiş hücreler, diferansiyel-interferans-kontrast (DIC), konfokal veya matris yaklaşık olarak 1 mm kalınlığında olduğu gibi uzun mesafe görüntüleme izin veren herhangi bir diğer görüntüleme teknikleri. Yukarıdan aşağıya görüntüye tüm kültür mikroskoplar çok üzerinde mevcut Z-yığın özelliğini kullanın. </li></ol></li><li> İmmünofloresan boyama İpucu: Aşağıdaki immünoboyama protokol boyama / yıkama solüsyonları aspire önlemek için, yerine plakasını eğilme ve bir pipet kullanarak çözüm çıkarın. <ol><li> Bir pipet kullanarak BMGM çıkarın ve RT 1x PBS içinde 100 ul / yıkama / well ile 2-3 kez yıkayın. Yeterince PBS kuyunun tüm yüzeyini kapsayacak şekilde kullanıldığından emin olun. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 luk NBF (48-çukurlu bir plaka için) 100 ul / yuva eklenerek matris içinde, hücreler. NBF çıkarın ve RT 1x PBS 100 ul / yıkama / kuyu ile iki kez hücreleri yıkayın. Not: Bu matris sıvılaştırabilen soğuk NBF kullanmaktan kaçının. </li><li> , Gece boyunca PBS çıkarın antikorların spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de, 1 saat boyunca% 1 BSA ekleyin. </li><li> Gerekli seyreltme,% 1 BSA içinde primer antikor çözeltisi hazırlayın. Seyreltme üretici ile kontrol veya optimal bir antikor konsantrasyonunu belirlemek için titre, her bir antikor için değişecektir. Primer antikor solüsyonu, 100 ul / oyuk ilave edin ve üreticinin talimatlarına uygun olarak inkübe edin. Kritik adım: florofor ya da floresan boyalar konjüge edilmiş antikorları içeren tüm inkübasyonlar karanlıkta yapılmalıdır. </li><li> Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 5 dakika için 1 x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Dolaylı immünofloresans boyama için, oda sıcaklığında 1 saat için floresan prob konjüge edilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin. Üretici tarafından önerilen yoğunlukta% 1 BSA içinde antikorların seyreltin. </li><li> Ikincil a çıkarınntibody çözeltisi ve 5 dakika süre ile 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Sorun: yüksek bir arka plan önlemek için görüntüleme sırasında, floresan konjuge sekonder antikor titre ve yeterli sinyal sağlayan en düşük konsantrasyonu kullanın. Yüksek arka plan hala bir sorun varsa, yıkama adımların sayısını ve süresini artırmak veya doğrudan konjuge primer antikorlar kullanmak ve adımı 4.2.6 atlayın. </li><li> Çekirdekleri üretici tarafından önerilen dilüsyonda, &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer boyama çözeltisi 4 eklemek leke ve oda sıcaklığında 7-10 dakika boyunca inkübe etmek. </li><li> Nükleer boyama çözeltisini çıkarın ve 5 dakika süre ile 1x PBS ile 2x yıkayın. </li><li> Son yıkamadan gelen PBS çıkarın ve floresan korumak için numune üzerinde, montaj orta bir damla (normal set) ekleyin. Bir floresan veya konfokal mikroskop uygun uyarma / emisyon ayarları kullanarak görüntü. Not: Görüntüleme boyama 2 gün içinde yapılmalıdırmatris ve RBM bütünlüğü ve flüoresan sinyal kaybı kaybı bozulmasını önlemek için. Hemen görüntülenmiş Değilse, lekeli örnekleri görüntüleme kadar, ışıktan korunan, 4 ° C&#39;de tutulmalıdır. </li></ol></li></ol> 5. RBM ikinci Hücre İzolasyonu <ol><li> Matris katmanı bozmadan nazikçe orta çıkarın. Aspire etmeyin. </li><li> Yıkama hücreler steril 1 x PBS ile 2x. Aspire etmeyin. </li><li> Her bir oyuğa, buzla soğutulmuş CRS 0.5 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme ile, hücreleri ile birlikte tüm matris çıkartılmamalıdır. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri, matris ve CRS toplayın. Buz üzerine yerleştirin. </li><li> Aynı oyuğuna ilave bir 0.5 mi CRS ekleyin ve geri kalan malzeme toplamak. Aynı mikrosantrifüj tüpüne transfer edin. </li><li> Vortex hücreleri, matris ve CRS karışımı ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Vortex hücreleri her 15 dakika matrisinden salınmasını kolaylaştırmak için. </li><li> 1 saat, görünür bir kümeleri sonra karışımın kontrolmatrisin mevcut olması gerekmektedir. Sorun: matris kümeleri 1 saat sonra hala görünür ise, daha büyük bir boru transfer hücre / matris / CRS kanşımı, CRS ek 2-5 ml ekleyin ve ek bir 30-60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle 1000 rpm&#39;de CRS Santrifüj hücreleri Süpernatantı ve soğuk 1 x PBS içinde 1 ml hücre pelletini. </li><li> 5-10 dakika 1.000 rpm&#39;de santrifüj ve süpernatant kaldırmak. PBS yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. </li><li> İkinci PBS yıkama matris ve izole edilmiş hücrelerden hücreleri kurtarma sitometresi in vivo nakli, vb akış, DNA / RNA / protein izolasyonu gibi herhangi bir alt uygulamalar için kullanılabilir tamamlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism.">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber.">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li><li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li><li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium.">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li><li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane.">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li><li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+propagated+in+serum-free,+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model.">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion.">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li><li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma.">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li><li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition.">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li><li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEACAM1-4S,+a+cell-cell+adhesion+molecule,+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture.">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma.">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids.">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li><li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+drug+resistance:+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease.">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li><li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture.">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li><li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells.">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li><li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma.">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li><li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel.">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li><li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells.">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li><li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance.">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

RBM modeli BM hücresel kompozisyonu kadar 30 gün boyunca ex vivo korunur kapsamlı bir sistem sağlar. Onların fonksiyonu yakından in vivo bulunan BM mimarisini taklit göre RBM kendini katmanlaştırma yetişen BM hücreler. Ayrıca, bu çoklu miyelom klon 8 genişlemesi için izin veren ilk sistemdir. BM hücrelerinin güçlü büyüme ve kültür genel başarı sağlanması için en önemli adımlar şunlardır: 1)&gt;% 70 canlılığı ve kırmızı kan hücreleri daha çok serbest i...

Doku kültürü dokunulmamış organizmalar çeşitli işlemleri karşılaştırırken sistemik değişkenliği en aza indirmek için, bir kontrollü bir ortamda hücre davranışını incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilk olarak 1900&#39;lerin başında 1,2 kurulan ve doku eksplantlar bir cam tabak içinde ex vivo kültürlenmiş bir teknik anlamına gelir edildi. 1900&#39;lü yılların ortalarında sistem oldukça sağlam dokuların parçaları daha dağınık hücreleri büyümek için uyarlanmış ve terimleri &#39;doku kültürü&#39; ve &#39;hücre kültürü&#39; 3 eşanlamlı oldu. Bu tür geleneksel hücre kültürü sistemlerinde çeşitli hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş büyüme ortamı ile kaplanmış doku kültür plastiğin yüzeyi üzerinde yetiştirilir. Yapışık hücre kültürü, hücre eklemek ve hücrelerin süspansiyon içinde yayılır doku kültürü plastik ve yapışkan olmayan kültürleri, yayılmış: kültürler iki tip çeşitli hücre yapışma kapasitesine göre ortaya çıkmıştır. Hücrenin ilk günlerinden beriKültür, çok ölümsüz hücre çizgileri örneğin HeLa 4, ilk insan kanser hücre çizgisi olarak, yaratılmıştır. Bu hücre hatları, hücre kültürü içinde süresiz olarak çoğalma kapasitesine sahip ve en canlılığını korumak için özel bir muamele gerekmez. Orijinal hücre kültürü yöntemleri indirgemeci yaklaşım, hücre canlılığı ve çoğalmasını sürdürmek için gereken minimum bileşenleri içerecek şekilde mümkün olduğu kadar sistem basitleştirmek için tasarlanmıştır. Ancak, basitleştirilmiş hücre kültürü yaklaşımlar sonlu ömrü ile ex vivo en temel insan hücre tiplerini desteklemek için başarısız. Bu nedenle, yeni bir kültür sistemleri böylece hücre eksplantlan fizyolojik koşullar altında büyümeye izin, mümkün olduğunca yakından doku mikroçevreyi yaklaştığı dizayn edilmektedir. Geleneksel / indirgemeci yaklaşımlar hücre kültürü, 3 boyutlu (3-D) aksine kültür sistemleri şimdi çeşitli etkin bir kültür için tercih edilen bir yöntem haline gelmektedirinsan hücre hatları ve primer hücreler daha sonra destekleyici bir mikro-bağlamında, sağlık ve hastalık ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına. 3-B sistemleri genellikle ilgi hücre türlerini incelemek için doku mikroçevreyi özetlemek amacıyla, büyüme faktörleri ile takviye yeniden matrisler ve / veya orta kullanılarak ayarlanır. Bu 3-boyutlu (3-D) kültür modellerinin ilk meme bezi gelişimini incelemek için geliştirilmiştir. Meme epitelyal hücreleri, Matrigel gömülü olan yerel koşullar, kollajen IV ve hücre dışı matrisin (ECM) laminin-zengin bir kaynak ile hücre sağlamak ve büyüme ortamı ile kaplanmış için. Bu koşullar altında, meme epitelyum hücreleri meme asinüsü benzeyen kümeleri oluşturulmuş ve laktojenik hormonlar ile uyarılması üzerine, bu acininin acininin benzeri yapıların içi boş LUMENA ​​içine, kazein ve diğer süt proteinleri salgılanır. Kazein salgılama bile prolaktin 5 ilave edildikten sonra standart kültürlerde gözlenmedi, Ayrıca hücrelerin morfolojik ve fenotipik özelliklerini koruyarak mikroçevresinin rolünü vurgulayarak. Hücreler fizyolojik mikroçevresinin bağlam dışına alınır, normal hücresel fonksiyonunun kaybı başka gösteri destekleyici mikro olmaksızın, keratinositler tabakalı epidermis 6 oluşturmak için başarısız bir gösteri. Diğer 3-D modellerin bir dizi birincil hücrelerinin ex vivo yayılmasını 7,8 izin yaratılmıştır. Hücre davranış mikroçevresinin önemli rolü zarif ben matris zaman kollajen kültüre meme epitel hücreleri Matrigel&#39;de oluşmuştur doğru polarize asinüs göre, &quot;iç-dış&quot; asinüsü oluşan bir çalışmada gösterildi. Laminin üreten miyoepitelial hücreler kolajen I 9 kültürlere ilave edildi zaman uygun morfoloji bu kayıp dönülmüştür. Ayrıca, doğru bir mikro-ortam doğru için gereklidirgenotip tezahürüdür. Bir tabak içinde yetiştirilen, bir hücre-hücre yapışma molekülü ile transfekte CEACAM1 MCF7 meme kanseri hücrelerinin transfekte edilmemiş CEACAM negatif hücreleri ile tam olarak aynı şekilde davranır. Ancak, habis olmayan meme epitel 10 ile kurulmuştur gibi CEACAM1 ile transfekte MCF7 hücreleri, oyuk LUMENA ​​normal bir fenotip ve form asinüs dönmek ise ECM, vahşi tip bir şekilde MCF7 tümör benzeri yapılar ile temas halinde, Matrigel kültürlenmiştir. Benzer şekilde, β1-integrin meme kanseri hücrelerinde engelleme standart kültür koşulları altında davranışlarını değiştirmek, ancak 3-D kültürde gerçekleştirilen aynı deney β1-integrin bloke normal bir fenotip 11 malign hücrelerin döner göstermektedir etmez. Bu nedenle, yalnızca doku mikro çevre hücre canlılığını korumak için gerekli değildir, ancak, aynı zamanda, uygun hücre fonksiyonunu korumak için. Hücre davranış, fizyolojik koşullar altında incelenebilir bir sistem sağlamaya ek olaraks, 3-B kültürleri yeni terapötik 8,12,13 klinik öncesi testleri için olduğu gibi sağlam ve güvenilir orta çalışır. 3-B hücrelerinin kültürlenmesi hücre-hücre ve hücre-ECM yapışmasının katkı değerlendirilebilir çevre aracılığında ilaç direnci 14, koşullarında araştırma bileşiklerin tarama sağlar. Bundan başka, yeni bileşimlerin hedef dışı toksisite çeşitli dokuların birden fazla hücre bölmeleri dahil edilmesi ile tespit edilebilir. Bu tür taramalar daha hızlı gerçekleştirilir ve daha düşük maliyetli bir in vivo 8 karşılaştırılabilir çalışmalara göre girmektedir. Burada normal ve habis kemik iliği (BM) hücreleri yakından insan BM mikro taklit eden bir sistem içinde ex vivo çoğalan yeniden kemik iliği (RBM) bir 3-D modeli bir kurulum mevcut. BM stroma çeşitli bileşenleri ile 2-B kültürler, sıvı ya da yapışkan cocultures primer insan BM hücrelerinin büyüyen bir önceki girişimlerVeya 3-D, yarı katı agar kültürleri nedeniyle doku mikro 15-18 bileşenleri ile hücre kaynağı kendi yetersizlik sınırlı başarı ile bir araya geldi. Bu sistemlerde birincil BM hücreler kötü canlılığı vardı ve ex vivo çoğalırlar başarısız oldu. İnsan BM progenitör hücrelerin BM stromal hücreleri ile küremsi cocultures yetiştirilen bir başka sistem hematopoetik kök hücre canlılığı ve proliferasyonu, en az 96 saat 19 için sürekli bir 3-D sistemidir. Hematopoietik progenitör biyoloji anlaşılması için son derece faydalı olmasına rağmen, ancak, bu sistem sadık yararlılığını sınırlama, bu nedenle ECM bileşenlerinin bulunmaması nedeniyle DM&#39;nin mikro özetlemek değildir. Burada açıklanan model, insan RBM DM&#39;nin hem hücresel hem de hücre dışı bölme in vitro yeniden inşa edilir kapsamlı bir sistem sunar. Biz RBM kültürleri, normal insan BM hücrelerinin ex vivo büyümesini desteklemek olduğunu göstermektedir bizçeşitli hematolojik hastalıkları olan hastalardan izole edilen hücreler olarak Ll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

Doku kültürü, normal geliştirme hastalığı, hücre fonksiyonunda birçok yönlerini incelemek için paha biçilmez bir araç olmuştur. Geleneksel yöntemler, bir hücre kültürü, doku kültürü çanağı, bir katı alt döküm takmak ya da sıvı bir ortam içinde süspansiyon içinde büyümeye ya da hücrelerin kabiliyetine dayanır. Birden fazla ölümsüz hücre çizgileri birincil hücreler ex vivo büyümüş olması gerekir, ancak, bu yöntemler genellikle başarısız oluşturulur ve bu tür yaklaşımlar kullanılarak büyütülmüştür. Bu başarısızlık plastik doku kültürü, hücre büyümesi için bir yüzey olarak kullanılan standart sistemlerden doku mikro uygun hücre dışı matris bileşenlerinin yokluğunda atfedilmiştir. Hücre dışı matriks doku mikro ayrılmaz bir bileşeni olan ve bunun varlığı, hücre polarizasyon, hayatta kalma ve proliferasyon gibi fizyolojik fonksiyonların korunması için çok önemlidir. Burada bir 3 boyutlu doku kültürü yöntemi primer kemik iliği cel sunmakls, insan kemiği (RBM sistemi) mikro özetlemek için formüle hücre dışı matris içinde büyütülür. Hücre dışı matris içinde gömülü hücreler, böylece birincil dokusunun hücresel bileşimi korurken, hücre hayatta kalması ve çoğalması kadar 30 gün boyunca sürekli olabilir kapsamlı bir sistem sağlamaktadır, insan plazması ile desteklenmiş ortam boyunca besin ile temin edilmektedir. RBM sistemi kullanarak başarıyla normal donörlerin ve hastaların amiloidoz ile, ve çeşitli hematolojik maligniteler primer kemik iliği hücrelerini büyüdü. RBM sistemi yeni terapötiklerin klinik öncesi etki hücre davranış ve değerlendirme doğrudan, in-matris gerçek zamanlı görüntülenmesi için izin verir. Ayrıca, hücreler RBM izole edilir ve daha sonra in vivo nakli, hücre sıralama, akış sitometrisi, ve nükleik asit ve protein analizi için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, RBM yöntem primer kemik Marro büyümesi için güvenilir bir sistem sağlarfizyolojik koşullar altında w hücreleri.

Primer kemik iliği hücreleri standart doku kültürü koşulları altında çoğalırlar başarısız yana, RBM sistemi yakından kültürüne bir sistem sağlayarak, kemik mikroçevreyi taklit ve ex vivo BM hücreleri genişletmek için kuruldu. BM dışı matrisin, fibronektin, kolajen I, kolajen IV, laminin ve 21 ana bileşenleri, bu 3-D kültürüne yapısal iskele temin etmek üzere RBM matris içine dahil edilmiştir. Endosteum, kolajen I ve fibronektin zengin kemik ve BM arasında arayüz, b...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies at JoVE.com

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Görüntüleme.  Purdue University.  Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur. 

Video: A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Tıp

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...