Yazarlar Araştırma Vakfı Flanders (FWO-Vlaanderen, Belçika, G.0601.11) ve KU Leuven Araştırma Vakfı GOA/11/002 kabul. FWO-Vlaanderen bir burs IB, TJ ve LT yarar.

Not: hücreler de dahil olduğu tüm işlemler, bir laminar akış içinde çalışarak, steril bir ortamda yapılmalıdır. HEK293T Hücre Hattı 1. Bakım <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de bir T-75 balonuna HEK293T hücreleri büyütün. </li><li> Geçiş% 80 bir birleşme elde edilir hücreler. Not: Bu, normal olarak 3-4 gün sürer. Sürekli kültür içinde hücreler, tarama için 20-25 kullanılabilir pasajlar sağlar. <ol><li> Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür, PBS-tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) olmaksızın Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) koyun ve büyüme ortamında (500 ml (500 ml PBS, 10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ve 4.5 ml% 4 EDTA ile takviye edilmiş) Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta - yüksek glukoz [DMEM] önceden oda sıcaklığında,% 10 cenin sığır serumu [FBS] ve 1 mM penisilin-streptomisin [PS]) yarım saat ile takviye edilmiştir. </li><li> Kaldırmakhücrelerden eski büyüme ortamı. 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve tekrar PBS kaldırmak. </li><li> , 3 ml PBS-tripsin-EDTA ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edilir ve çözelti Not çıkarın: Hücrelerin morfolojisi değişecektir yıldız şeklinde küre-şekilli. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetin ve taze büyüme ortamına 10 ml alt birkaç kez durulama ile hücreleri toplamak. </li><li> 14 ml yeni büyüme ortamı içeren, ve bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe yeni bir T-75 balon içine Aktarım hücre kültürünün 1 mi. </li></ol></li></ol> HEK293T Hücreler 2. Geçici transfeksiyonu <ol><li> 3 gün gerçek kalsiyum mobilizasyon analizden önce bir T-75 balonuna HEK293T hücreler büyümek gerçekleşir. Emin, üç T-75 balonları, reseptör yapısı, boş bir ifade vektörü, negatif kontrol ve o ile transfeksiyonu için bir ile transfeksiyonu için kullanmak için emin oluntransfeksiyon kontrolü için ne. Not: Aşama 1.2 &#39;de tarif edildiği gibi hücre pasajı gerçekleştirilir. Birden 96-kuyu plakalar elenecek varsa, T-150 matara (adımlarla 1.2.5, 2.3, 3.1.3 ve 3.1.4 bunu yapmak, çift listelenen tüm miktarlarda) hücrelerin daha yüksek bir verim elde etmek için kullanılabilir . </li><li> Hücre kültürleri 50-70% izdiham varana kadar 20-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de şişeler inkübe edin. </li><li> Ilgi ve Gα 16 yapının GPCR, boş vektör ile Gα 16 yapısı ile ikinci balon ve transfeksiyon kontrol ve Gα 16 yapısı ile üçüncü kodlayan ekspresyon vektörü ile hücrelerinin Co-transfect bir popülasyon. Not: Bu protokol, Drosophila SNPF reseptörünün bir pcDNA3.1 memeli sentezleme vektöründe 13 klonlandı. Jetprime transfeksiyon gerçekleştirmek için kullanıldı, ancak diğer transfeksiyon reaktifler de kullanılabilir. <ol><li> At ekle7.8 ug DNA (3.9 ug reseptör yapısı, ya da boş bir vektör, ve 3.9 ug Gα ekspresyon yapısı, 16), bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve Jetprime tampon 500 ul ekleyin oplam. Tüp vorteks ile iyice karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Jetprime reaktif, girdap 37.5 ul ekleyin ve 14,000 x g&#39;de 1 dakika aşağı doğru döndürün. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımı 10 dakika inkübe edin. </li><li> Hücre kültür ortamına transfeksiyon karışımı damla damla ilave edin ve kültür şişenin duvarları ile temas kaçınarak ortam haline doğrudan pipetle emin olun. 20-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de şişeler inkübe edin. </li></ol></li></ol> 3.. Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi <ol><li> Transfekte edilmiş hücreleri toplamak ve 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf dipli plakalar içerisinde bunları tohum. <ol><li> PBS, PBS-tripsin-EDTA ile DMEM transfer sıvısının,% 10 diyaliz edilmiş FBS ile takviye edilmiş (500 ml DMEM yerleştirinve önceden% 1 PS), oda sıcaklığında yarım saat. </li><li> Coat 96 oyuklu (plaka başına 5.85 ml PBS ve 150 ul fibronektin [% 0.1]) oyuk başına fibronektin (0.0025%) içeren PBS içinde 60 ul, siyah duvarlı, şeffaf tabanlı plakalar. Üzerinde kapak ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuyulardan çözüm çıkarın ve oda sıcaklığında kapağındaki olmadan, 1 saat boyunca tekrar inkübe edin. Alternatif olarak, bu daha iyi bir hücre eklenmesi için önceden kaplanmış plakalar kullanmak mümkündür. </li><li> Hücrelerden eski büyüme ortamı çıkarmak ve 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve PBS kaldırmak. </li><li> , 3 ml PBS-Tripsin-EDTA ekleyin, 1 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra solüsyon çıkarın. Not: Bu küre şeklindeki ikinci yıldız şeklinde hücreler değişikliklerin morfolojisi. </li><li> Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetip DMEM transfer ortamının 10 ml ile bir kaç kez durulanarak toplarlar. Bir 50 ml Falcon tüpü içine hücreleri aktarın. </li><li> Sayısıml başına hücre sayısı (burada NucleoCounter ile yapılan, ancak bir Bürker en odası kabul edilebilir). Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre kültürünün 100 ul ekleyin. 100 ul lizis tamponu ekleyin ve tüp dokunarak karıştırın. 100 ul stabilize tamponunu ekleyin ve dokunarak karıştırın. </li><li> Hücre süspansiyonu ile bir NucleoCassette doldurun ve sayaç ile hücreleri sayın. Liziz ekleme ve aşama 3.1.6 tamponu stabilize zaman hücreler, üç faktör ile seyreltilmiş olarak üçe hücre sayısını çarpın. </li><li> 600.000 hücre / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar hücrelere seyreltin ve / oyuk başına 90,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek üzere kaplanmış levhaları üzerinde göz başına 150 ul hücre tohum. Hava kabarcıklarını önlemek ve bir bitişik hücre katmanı elde etmek için eşit hücreleri yaymak için plaka dokunun. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Floresan boya ile hücreleri yükleyin ve co hazırlamakmpound plakası. <ol><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) Hazırlama / HEPES / Ca 2 + / sığır serum albümini (BSA) tampon maddesi (damıtılmış su içinde 1 M CaCI2 [dH 2 O] - oda sıcaklığında saklayın) 165 ul CaCl2 stok solüsyonu ekleyin 500 ul HEPES stok çözeltisi (1 M HEPES dH 2 O, pH 7.4 &#39;de - oda sıcaklığında saklayın) ve 50 ml HBSS 0.05 g BSA. Yağ asitleri, ilgi konusu reseptörün kalsiyum sinyal bozucu, reseptörleri aktive gibi bu yağ asitsiz BSA, kalsiyum tahlilleri için kullanılır edin. </li><li> Probenesid çözeltisi (100 x, 250 mM) hazırlanması: 5 ml NaOH (1 M) içerisinde 0.71 g probenesit çözülür ve 50 ul HEPES stok çözeltisi ve HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA tampon içinde 5 ml - her zaman taze solüsyon hazırlanır. Not: Probenesid dolayısıyla floresan sinyalini azaltır sitoplazmadan Fluo-4 bağdaki inorganik anyon taşıyıcılarını inhibe eder. Bu boya yükleme gerçekleştirmek için tavsiye edilirprobenesid varlığı ve yokluğu probenesid da agonist aracılı sinyal azaltabilir gibi inorganik anyon taşıyıcıları, inceleme altındaki belirli hücre hatlarında potansiyel bir sorun mevcut olup olmadığını belirlemek için. </li><li> Yıkama tamponu hazırlayın: 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA tampon 500 ul probenesid çözeltisi eklemek pH&#39;ı 7.4 &#39;e ayarlayın ve tampon çözeltisi süzün. Her zaman taze tamponu hazırlamak ve plaka gereklidir başına 50 ml tampon. </li><li> % 10 pluronik asit çözeltisi hazırlayın: 50 ul DMSO ile 50 ul karıştırın pluronik asit (dimetil-sülfoksit içinde 20% w / v [DMSO]) - kristalizasyon oluşursa, ısı 37 ° C&#39;ye kadar ve her zaman taze solüsyon hazırlanır. </li><li> Fluo-04:00 çözeltisi (1 mM) hazırlayın: tamamen eriyene kadar 50 ug Fluo-4:00 ve vorteks içeren bir şişeye, 44 ul% 10 pluronik asit solüsyonu ekleyin. Floroforun beyazlatma önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Yükleme tamponu hazırlayın: add 8.8 ml DMEM katkılanan10 mM HEPES ve Fluo-04:00 çözeltisi (44 ul) ve vorteks 2.5 mM probenesid (pH 7.4) ile d. Her zaman taze tampon kullanın. </li><li> Hücrelerden ortam atılır, oyuk başına 200 ul PBS ile hücrelerin yıkayın ve PBS çıkarın. </li><li> Oyuk başına 55 ul yükleme tamponu ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Işığa plakanın maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile plaka sarın. </li><li> Bu hücre sentezleme sistemi için zararlı (örn., asetonitril) çözücü maddeler içinde çözülür ise, ekranın önce bileşiklerin kuru olduğundan emin olun. </li><li> Silikon 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, yıkama tamponu içinde peptidleri çözünürleştirilir. Bir konsantrasyon-tepki analizi gerçekleştirmek için bir ligandın EC50 değerini belirlemek için bir seyreltme serisi hazırlanır. Bileşik levhanın (V-şekilli 96 oyuklu plakalar) çok iyi karşılık gelen ligandın 70 ul eklenir ve her plaka üzerine pozitif (endojen agonisti) ve negatif kontroller (yıkama tamponu) içerir. Değil<html> e: bir bileşik, yıkama tamponu içinde çözünebilir değilse, bu tür bir su veya yağ ve diğer suda çözülmeyen maddelerin (örneğin, Kolliphor EL) emülsiyon ve çözeltiler gibi çözündürülmesi, araştırma altındaki hücreler için zararlı olmayan diğer çözücüler, deneyin . </li><li> Bütün numuneler üç kopya halinde ölçün. Bileşik plakasından bir ligandın 50 ul deney süresince, hücre levhasının 100 ul yıkama tamponu ile bir kuyuya aktarılır göz önünde bulundurun, yani arzu edilen nihai konsantrasyon 3 kat da bileşikleri hazırlamak. </li><li> Hücre plakasından yükleme tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yıkama tamponu ilave edin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın plaka ve ışığa maruz kalmasını engeller. </li><li> Hücre plakasından yıkama tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yeni yıkama tamponu ilave edin. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca hücre plakası, bileşik plaka ve bir uç raf (96-çukurlu, istasyon cihazı pipet uçları) inkübe </li></ol></li></ol>İstasyon Cihaz üzerinde başlığı &quot;&gt; 4. Deneyi <ol><li> Oluşturun ve yazılım ile istenilen protokol dosyasını yüklemek ve okuma odası için sıcaklık kontrol ünitesi etkinleştirin. Burada, 525 nm&#39;de (tam bir 96 oyuklu plaka yaklaşık olarak 25 dakika sürer ölçüm) ardı ardına arasında 1.52 saniyelik bir aralık ile her seferinde bir satır 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de kalsiyum tepkileri ölçer. 488 nm Fluo-4 uyarılmasını ayarlamak ve 26 ul / sn belirlenen dağıtım hızı ve 135 ul bir pipet yüksekliği ile, hücre plakası, okuma başladıktan sonra 18 saniye için bileşik 50 ul bir toplam hacim aktarın. </li><li> Istasyon cihazın uygun çekmeceleri olan bir bileşiğin ve hücre plakası ve uç raf yerleştirin. </li><li> FLEX modunda gerçek ekran başlamadan önce, son nokta modunda aynı eksitasyon ve emisyon dalga boyunda, hücre levhasının tek bir okuma gerçekleştirin. Not: Bu ölçüm nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri verir ve biz arasındaki değişkenliği tespit edilmesine olanakLevhanın LLS. 20,000 ile 40,000 arasında değerler olarak kabul edilebilir olarak kabul edilmektedir. </li><li> Tahlil başlatın ve yazılımı ile verileri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success.">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+a+historical+perspective.">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li><li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms.">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li><li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+physiology+in+insects.">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li><li>Van Hiel, M. . B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents.">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li><li>Tang, X. . L., Wang, Y., Li, D. . L., Luo, J., Liu, M. . Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+deorphanizations.">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li><li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors.">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li><li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling.">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li><li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay.">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li><li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li><li>Lu, H. -. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling.">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li><li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling.">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li><li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5&#8217;-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs).">An analysis of 5&#8217;-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq&#945;+and+Gs&#945;+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation.">Carboxyl-terminal mutations of Gq&#945; and Gs&#945; that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li><li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+G&#945;16+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors.">Is G&#945;16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li><li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays.">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li><li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., G&#228;de, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+(AKH)+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors.">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li><li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes.">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil daha önce başarılı bir şekilde Mertens ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir Drosophila SNPF peptiderjik sinyalizasyon sistemi, fonksiyonel karakterizasyonu teyit etmek için uygulanmıştır. bir biyoışıldama tahlili ve Feng et al. Elektrofizyolojik deney 13,15 ile. Drome-SNPF-; fluo = 2.04 nM, Lumi = 51 nM: HEK293T hücrelerinde floresan deneyi ile elde edilen EC50 değerleri, yaklaşık CHO hücreleri (Drome-SNPF-1 içerisinde gerçekleştirilen biyoışıldama tahlili ile elde edilenden daha az bir 10-kat 2: fluo = 5.89 nM, Lumi = 42 nM; Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, Lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0.50 nM, Lumi = 75 nM). Bu varyasyonlar, kullanılan sentezleme sistemlerinden biri, belirli bir reseptörünün fonksiyonel ifadesi için daha uygun olabilir, ya da reseptörlerinin katlama c daha az verimli olduğu gerçeği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere açıklanabilirertain hücre türleri. Genel olarak in vivo peptid-reseptör etkileşimi fizyolojik önemi destek, floresans ve biyoışıldama tahlili ile her iki reseptörü üzerinde test edildiği zaman, dört Drome-SNPF peptidlerin EC50 değerleri, nanomolar aralıkta bulunmaktadır. Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi normal deney düzeneğinde en transfeksiyon kontrolü için aktive ligand bilindiği için bir reseptör ile bir transfeksiyon kontrol olarak, burada sunulan ekranına dahil dikkat etmek gerekir. HEK293T hücreleri (PAR 1) ve negatif kontrol (yıkama tamponu) içinde bir endojen ligandı olan pozitif kontrol ekranında dahil edilmiştir. PAR 1&#39;in sonuçları hücreler, iyi durumda olduğunu göstermiştir. Negatif kontrol (yıkama tamponu) olan peptidler çözündürülür hangi orta inf olabilecek herhangi bir yabancı maddelerden arındırılmış olduğunu gösterir, bir flüoresan sinyal neden olmamıştırsonuçlarını luence. Karakterize edici özelliği, daha önce Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlilini açıklamak için kullanılmıştır. Bu amaç için, aktive edici ligandların konsantrasyonu hemen dizi test edilmiştir. Yetim reseptör bileşiklerinin yüzlerce içeren bir kütüphane test etmek için bir tarama tahlilinde aşırı ekspresyonuna getirilir, ancak, bu ligandlar (örn.., 10 ya da 1 uM) nispeten yüksek nihai konsantrasyonları ile, birinci ekranına karşılık tavsiye edilir. Bir aktive bileşiğin tespiti sonra, bu bileşiğin bir seyreltme serisi bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için ve EC50 değerini belirlemek için taranabilir. Bir reseptörün aktive ligand belirlendikten sonra, hücre içi sinyal yolu ayrıca protokol uyarlanması ile araştırılabilir. Deney, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak G eş zamanlı olarak transfekte olmayan ^ alınabilir5, 16 alt-birimi. Bir kalsiyum tepki ölçülür, bu demektir ki, alıcı hücre sentezleme sistemi bir endojen Gα q alt-birimi ile çiftler. Herhangi bir flüoresan sinyal bakıldığında, diğer ikinci haberciler (örn.., CAMP) konsantrasyonlarda değişiklikleri ölçmek için protokoller uygulanabilir. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları da reseptör aktivasyonu için gerekli olan peptidin çekirdek dizisini tanımlamak için gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kesik sekanslar, yine de reseptörünü de aktive edebilmektedir peptidin en az bir amino asit dizisini belirlemek için değerlendirilir. Daha sonra, peptidler, sistematik olarak, her bir amino asit bir alanin kalıntısı ile ikame edilmiş olan test edilebilir. Reseptörü üzerinde sentetik alanin-ikame dizi test reseptör aktivasyonu 24,25 için amino asitlerin her birinin önemini belirlemek için izin verir. Sık kullanımının ve kanıtlanmış zorunlu kılmakta rağmenCacy, burada açıklanan tahlil ilgi belirli reseptörleri için en iyi sonuçları elde etmek için bazı uyarlamalar gerekebilir vurgulanmalıdır. Gα 16 alt-birimi çoğu GPCRs bağlanan bir avantajı vardır, ama aynı zamanda reseptörleri üzerinde dominant-negatif bir etkiye sahip olabileceğini endojen Gα q 22 ile bir çift. Bu durumda, bu yeni kalsiyum tahlilinde en iyi duruma getirilmesi sırasında G proteinlerinin farklı kombinasyonları test etmek ve Gα 16 yokluğunda veya varlığında, Gα q-bağlanmış reseptörler için sonuçları karşılaştırmak için yararlı olabilir. Reseptör aktivasyonunu tespit etmek için etkileşim G protein bağımsız alternatif tahliller, aynı zamanda, GFP-etiketli arrestin olan translokasyon, veya zar potansiyeli (örneğin,., FLIPR zar potansiyeli Assay Kit) değişimlerin tespiti gibi, gerçekleştirilebilir. Fluo-4:00, burada diğer kalsiyum duyarlı fluorophores geniş bir dizi, kendi spektral ve Chemic her yanında;al özellikleri mevcuttur. En uygun florofor GPCR, hücre tipine ve mevcut plaka okuyucusu göre seçilebilir, ancak deneysel doğrulama gereklidir. Transfekte edilmiş DNA ve her reseptör-transfeksiyon reaktifi-hücre hattı kombinasyonu için belirlenecek DNA / transfeksiyon ayıracı oranı ihtiyacı miktarları. Son olarak, sürekli bir kültür içinde hücreleri sadece 20-25 kullanılabilir geçitleri tarama tahlilleri yapmak için izin akılda tutulmalıdır.

G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) bütün hücre yüzeyi proteinleri arasında en büyük ve en çeşitli ailelerin birini oluşturmaktadır. Omurgalılarda Bunların varlığı, omurgasızlar, bitkiler, mayalar, ve balçık kalıp yanı sıra, Protozoa ve erken diploblastic in Hayvanların GPCR&#39;ler sinyal transdüksiyonu 1 ile bağlantılı en eski moleküller arasında olduğunu gösterir. Onların doğal aktifleştiren ligandlar peptidler, biyojenik aminler, koku maddeleri, glikoproteinler ve fotonlar 2 dahil olmak üzere dış uyaranların geniş bir çeşitlilik içermektedir. Bu nedenle, bu reseptör-ligand sinyalleşme sistemlerinin fizyolojik süreçlerin bir çok çeşitli katılmaktadırlar. Geniş spektrumlu fonksiyonel insan hastalıklarının geniş bir kapak terapötik ilaçların geliştirilmesi için onları ideal uygun hale getirir. Mevcut ilaç hedefleri yaklaşık% 50-60 GPCRs 3,4 ile temsil edilmektedir. Farmasötik endüstrisinde büyük önem taşımaktadır Bunun yanı sıra, bir GPCR&#39;ler geliştirilmesi için spot da vardırGenel olarak türe özgü insektisit 5,6 ve pestisitlerin yeni nesil. Birçok GPCRs doğal ligandları hala belirsiz olduğu için, yetim GPCRs olarak sınıflandırılır. Bu reseptörlerin deorphanization organizmalar kendi fizyolojik rollerinin anlaşılmasını sağlayacak ve yeni ilaç uygulamaları 7 için varsayılan hedefler ortaya çıkarmak olabilir. Genomik döneminden itibaren, ters farmakoloji strateji geniş GPCRs 8&#39;in deorphanization için uygulanır. Bu yaklaşım, bir yetim reseptör &quot;balık out &#39;için bir&#39; kanca &#39;, bir biyolojik ekstrakt ya da sentetik bileşikler bir kütüphane ile aktive ligand olarak kullanıldığı anlamına gelir. İlgilenilen GPCR nedenle klonlandı ve daha sonra, bir hücre sentezleme sistemi içinde transfekte edilir. En yaygın olarak kullanılan yöntemlerde, reseptör aktivasyonu ikinci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek belirlenir 9 </sup&gt;. Ana reseptör tarama tahlilleri (örneğin, aequorin) 10 ya da floresan kalsiyum göstergeler (örneğin, Fluo-4) 11 kalsiyum duyarlı biyolojik olarak ışık veren proteinler dayanır. Reseptör-eksprese eden hücreler önce ligand tarama için bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile yüklenmiş olduğu floresan bazlı deneyler, bunlar nedeniyle kullanım, kısa zaman okuma kolaylığı için, yüksek ölçüde nüfus ayırımına imkan olanaklar ve tarama esnekliğe sahip tek bir plaka üzerinde birden fazla 12 olan öksüz reseptörlerdir. Burada, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil iyice açıklanmıştır ve Drosophila melanogaster kısa nöropeptid F (SNPF) reseptörünün deorphanization işlemi ile görüntülenmiştir. Bu neuropeptidergic sinyalizasyon sistemi, ilk Mertens ve arkadaşları tarafından karakterize edildi. 2002 Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri içinde gerçekleştirilen bir kalsiyum biyoışıldama tahlili ile 1314 ve Feng et al. 2003 kullanarak bir elektrofizyolojik deneyde ile Xenopus oositlerde 15. SNPF sinyalizasyon sisteminin varlığı, besleme, büyüme, stres reaksiyonları, hareket ve sirkadyan ritim 16 düzenlenmesi işlemleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı böcek olarak, bir filum ile sınırlı görünmektedir. Böceklerde neuropeptidergic sinyalizasyon sistemleri üzerinde araştırma, ancak insektisit gelişimi için yeni hedeflere yol olmayabilir, ama bunların işleyişi bilgisi aynı zamanda birçok sinyal sistemleri genellikle iyi evrim 17 boyunca muhafaza edilmiştir diğer organizmalar karşı çıkarım olabilir. Son on yılda büyük ilerleme böcek nöropeptid GPCRs deorphanization sürecinde yapılmıştır. Bu çabalara rağmen, reseptörlerin sadece küçük sayıda komşu bir ligand eşleştirilir ve sekans bilgileri yükler için olanYeni öksüz GPCR&#39;ler nedeniyle genomik 18 patlama için kullanılabilir hale gelmiştir. Yaygın olarak uygulanan bir tekniktir 9,18 olduğu kanıtlanmıştır floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle gibi orta / yüksek verimli tarama yaklaşımların kullanılabilirliği, bu nedenle ölçülemez. Burada tarif edildiği gibi floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil, insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücre hattı içinde yapılır ve reseptör aktivasyonu üzerine hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri belirlemek için bir flüoresan probun kullanır. Yüksek ifade ve reseptörün için düzeyde olmasını sağlamak için bir Kozak konsensüs sekansı, 19, daha sonra bir sentezleme vektörüne (memeli hücre çizgileri için, örneğin, pcDNA vektör serileri) klonlanır reseptör-kodlama dizisinin, 5 &#39;ucuna eklenir. Bu sekans bilgileri göre yetim GPCR endojen G-protein bağlanmasını tahmin etmek zor olduğutek başına, reseptör aktivasyonundan sonra modüle edilir, ikinci haberci molekülleri (örn., kalsiyum veya cAMP) genellikle önce ligand tanımlama bilinmemektedir. Bu sorunu aşmak için, çoğu GPCRs ile etkileşim ve G q ailesi (örneğin, kemirgen Gα 15 veya [Burada kullanılan] insan Gα 16) veya flimerik G proteinleri (örneğin, Gα qi5) arasında gelenle G proteinleri kalsiyum salgılanmasını can 20,21,22 birlikte ifade edilebilir. Kendi reseptörüne ligand bağlanması üzerine, GPCR özel hücre içi yolların aktivasyonuna yol açan yapısal bir değişiklik olur. Gα 16 alt ünitesine istirahat durumunda bağlı guanosin difosfat (GDP) molekül, bir guanosin trifosfat (GTP) molekülü ile değiştirilecektir. Bu, 16 ve Gα Gβγ alt birim içinde heterotrimeric G proteinin ayrışma kışkırtır. Gα 16 alt-birimi, fosfolipaz C ve aktive# 946; Da zara bağlı diaçilgliserol sonuçlanan fosfatidilinositol bifosfat (PIP 2) (DAG) ile inositol trifosfat (IP 3) hidroliz (PLCβ). IP 3 sitoplazma boyunca yayılmış ve sitoplazma içine kalsiyum salınmasını uyarmaktadır endoplazmik retikulum zarında mevcut IP 3 bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edecektir. Reseptör aktivasyonu üzerine kalsiyum salma saniye içinde oluşur ve Fluo-4 asetoksimetil (AM) 11 gibi, kalsiyuma duyarlı boya ile tarama deneyinde önce hücrelerin yüklenmesi ile tespit edilebilir. AM ester grubu, hücre zarı geçmeye flüorofor sağlayan ve bir kez hücre içi sitoplazmik esterazlar tarafından kesilir. Sonuç olarak, floresan boya eden eksi yükler tarafından hücre dışında difüzyon ve kalsiyum iyonları ile etkileşime izin engelleyen, maskesiz edilir. Flüoresan sinyal of Fluo-4 sadece nanomolar aralığında kalsiyum konsantrasyonlarını ihtiva eden bir dinlenme koşulları altında hücrelerde ihmal edilebilir düzeydedir. Kalsiyum reseptörü aktivasyon üzerine bırakıldığında, ancak, sinyal burada geniş bir sinyal-gürültü oranı sağlanması, daha bir 100-kat konsantrasyon-bağımlı artırabilir. Fluo-4, aynı zamanda geniş bir hücre aralığı içinde fizyolojik olarak ilgili kalsiyum değişiklikleri ölçmek için uygundur, 345 nM&#39;lik bir Kd (kalsiyum) yaklaşık [kalsiyum] raporlama için geniş bir dinamik aralığı sergiler. Fluo-4 uyarılma 488 nm&#39;de meydana gelmektedir ve floresan emisyon 525 nm, 11 ölçülür. Flüoresan görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) 23, NovoStar veya FlexStation (istasyon cihazı) 12 gibi Fluorimeters her iyi eş zamanlı bileşik ilave edilmesini ve reseptör aktivasyonu üzerine Fluo-4 sinyalin algılanmasına izin orta / yüksek verimli sistemlerdir bir deney plakasında. Burada anlatılan kalsiyum mobilizasyon deney istasyonunda dayanırCihaz, 96 oyuklu mikro-plaka sistemi. SoftMax Pro yazılımı (software) veri analizi için hem de istasyon cihazı çalıştırmak için kullanılır. Program hemen 96 kuyulu formatta grafik olarak sonuçları görüntüler. Çoklu kuyular aynı grafik üzerinde bu kuyuların sonucunu karşılaştırmak için aynı anda seçilebilir. Her sütunda kuyu nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri aynı anda kuyulara bileşiklerinin ilave edilmesinden önce başlayan ve reseptör aktivasyonu sonra flüoresan sinyal ölçümü sonra devam eden, iki dakikalık bir süre boyunca ölçülür. Bir aktive bileşik floresan sinyalinin hızlı bir artış ile sonuçlanan, hücrelere ilave kadar Tipik olarak bir agonist eğrinin eğilim taban aynı hizadadır. Tepe yükseklik çukurdaki nihai agonist konsantrasyonu ile ilişkilidir. Tepe sonra flüoresan sinyal yavaşça taban seviyesine doğru düşer. BFÜ ölçümler can ligandın EC50 değeri (yarı maksimal etkin konsantrasyonu) belirlemek için konsantrasyon-yanıt eğrileri dönüştürülebilir. Genel olarak, en az üç bağımsız ekranlar, bir dizi konsantrasyon üç kopyaları da dahil olmak üzere her biri, güvenilir bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için gerçekleştirilmelidir. Bu deney tasarımında çok sayıda pozitif ve negatif kontroller için tavsiye edilir. Her şeyden önce, bir transfeksiyon kontrolü, bilinen bir ligand ile bir reseptör uygulanmasında, yani test edilmelidir. Bu transfeksiyon ajanı işlevsel olup olmadığını doğrulamak sağlar. Hücre hattı ve bir negatif kontrol (örn., yıkama tamponu) içinde bir reseptör için endojen bir agonisti ile bir kontrol deneyi de dahil edilmesi, hücrelerin sağlık ve yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek için ve yıkama tamponu ile kirlenmiş ihtimalini dışlamak için tavsiye edilir Bir oto-fluore ortaya bir faktörkoku yanıt. Sık kullanılan agonistler asetilkolin reseptörünü aktive eden bir PAR 1 selektif agonisti ya da karbakol gibi davranır, proteaz tarafından aktive edilen reseptör-1 (PAR 1) &#39;den elde edilen bir peptid bulunmaktadır. Boş bir sentezleme vektörü ile transfekte edilmiş hücreler, aktif bileşikler, hücrenin endojen reseptörleri ile etkileştikleri dışlamak için test edilmelidir. Aşağıdaki protokolde tarif edilen çeşitli parametrelerin optimizasyonu, farklı sinyal verme sistemleri için gerekli olabilir. Tam flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyinin şematik bir şekil Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle Şekil 1.. Genel şeması. Otomatik sıvı taşıma ve eşzamanlı floresan ölçümler istasyonu ile yapılıryazılım tarafından yönlendirilen cihaz mikroplaka okuyucu. Hücre plaka için bir, levha bileşik ve ucu raf: istasyon cihaz üç çekmece içerir. Yap-pipet transfer bileşik plakanın bir sütundan, hücre levhasının (aşama 1) karşılık gelen sütun bileşikler yer alır. , Hücre levhasının her biri de, ilgi konusu GPCR ve karışık Gα 16 alt-birimi ile birlikte-transfekte edilmiş hücrelerde HEK293T bir tek tabaka içerir. Bir bileşik reseptörünü aktive olduğunda, Gα 16 GDP-bağlı GTP ile değiştirilir. Gα 16 alt-birimi, daha sonra Gβγ karmaşık ayrışmaktadır ve sırayla fosfatidilinositol bifosfat (PIP 2) diaçilgliserol (DAG) ile inositol trifosfat (IP 3) sonuçlanan hidrolize fosfolipaz Cö (PLCβ) aktive eder. IP 3 kalsiyum int salınımını başlatma, endoplazmik retikulum zarında mevcut IP 3 bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edersitoplazma o. Fluo-4 (hücreler ek bileşik önce yüklenir hangi) ile kalsiyum etkileşimi bir flüoresan sinyal (aşama 2) ile sonuçlanır. Yazılım nispi floresan ünitesi, zamanın bir fonksiyonu olarak (RFU) değerleri olarak sonuçlarını göstermektedir, ve pik yükseklikleri konsantrasyona bağlı bir şekilde ligand konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu veriler daha sonra, bir ligand-reseptör çifti (aşama 3) ve EC50 değerini belirlemek için bir konsantrasyon-tepki eğrisi dönüştürülebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

20 yılı aşkın için, ters farmakoloji yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) &#39;in aktive ligandlarını bulmak için, önde gelen bir strateji olmuştur. Bir ters farmakoloji tahlilin başlangıcı bir hücre sentezleme sistemi içinde ilgi konusu bir GPCR klonlanması ve sonraki transfeksiyonudur. Heterolog ifade alıcısı daha sonra, reseptör-ligand aktive edici (ler) tanımlamak için aday ligand bileşiği kütüphanesi ile meydan. Reseptör aktivasyonu, cAMP gibi bir kalsiyum ya da ikinci haberci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek değerlendirilebilir. Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyonu tahlil sıklıkla kullanılan bir orta throughput farmakoloji tahlili tersidir. Yetim GPCR geçici olarak insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri olarak ifade edilmiştir ve bir karışık Gα 16 konstrukt ile birlikte transfekte edilmiş olmasıdır. Ligand bağlama sonra, 16 alt-biriminin Gα aktivasyonu kalsiyum f salınmasını uyarmaktadırendoplazmik retikulum rom. Önceki ligand tarama için, reseptör-eksprese eden hücreler, bir fluoresan kalsiyum göstergesi, Fluo-4 asetoksimetil ile yüklenir. Fluo-4 ve flüoresan sinyal istirahat durumunda hücrelerinde ihmal edilebilir, ancak reseptör aktivasyonuna sonra serbest kalsiyum iyonları ile etkileşimi üzerine bir 100-kat daha güçlendirilmiş olabilir. Tarif edilen teknik, genetik malzeme ile transfekte konakçı hücre genomuna entegre edildiği stabil olarak transfekte edilmiş hücre çizgilerinin zaman alıcı kuruluş gerektirmez. Bunun yerine, geçici transfeksiyon, hedef genin ekspresyonunu geçici olarak üreten, tarama tahlili gerçekleştirmek için yeterlidir. Kurulum bileşiklerin yüzlerce orta veri akışı taramasını sağlar. En GPCRs çiftler ne olursa olsun, endojen Sett nativ sinyal yolunun, hücre içi sinyal yolu kalsiyumun serbest yönlendirildiği sağlar karışık Gα 16, ko-transfeksiyonrinde. HEK293T hücrelerin kullanımı kolay olan ve reseptör deorphanization deneylerde yıllar boyunca etkinliğini kanıtlamıştır. Bununla birlikte, özel reseptör tahlilinin optimizasyonu gerekli kalabilir.

50 uM 0.001 nM arasında değişen konsantrasyon serisi dört Drosophila SNPF peptidler (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide Drome-SNPF-1) için test edilmiştir geçici Drosophila SNPF reseptörü ve karışık Gα 16 altünitesini ifade HEK293T hücreleri üzerinde. GPCR 0.1 nM kadar son konsantrasyonlarda dört peptidler tarafından etkin hale getirilemez ve reseptör aktivasyonu konsantrasyona bağlı oldu. Şekil 2, bu Drome-SNPF-1 konsantrasyon serisi üç kopyaları birine karşılık gelen grafikler tasvir etmektedir. (- 1 uM PAR 1) güçlü bir aktivasyonu ortaya endojen proteaz tarafından aktive edilen (± 30,000 RFU), yüksek floresan sinyaline yol açan, reseptörü-1, negatif kontrol (yıkama tamponu) pozitif kontrol ederken, bir flüoresan sinyal uyarmadı. Not edilmelidir ki bir sapmaTipik eğri anormallikler gösterebilir. Örneğin, taban çizgisine geri dönmeden eğri sürekli bir artış, örneğin kalsiyum ionofor varlığında, ya da kalsiyum sızıntı neden olan bir kesintiye lipid çift katmanı gibi reseptör olmayan aracılı sinyalleri ile ilişkili olabilir. Yazılım aktivasyon yüzdesi veya diğerleri arasında farklı konsantrasyonları standart hataları belirlemek için formüller giren sağlar. Şekil 3&#39;te dört Drome-SNPF peptidleri için gösterildiği gibi, elde edilen verileri, EC 50 değerlerini tahmin etmek için ön konsantrasyon-tepki eğrileri oluşturmak için kullanılır. Şekil 3&#39;ün Eğimler aynı zamanda, negatif kontrol konsantrasyon serisi için verileri içerir Drome-SNPF peptidler boş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilmiş HEK293T hücreler üzerinde test edilmiştir. Sonuçlar, bu hücrelere peptitlerin ilavesinin endojen reseptör üzerinde bir etkiye sahip olduğuna, ancak gerçekten activSöz konusu alıcıyı yedi. Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deney daha sonra üç kere, bağımsız bir şekilde tekrar edildi. Başlangıç ​​ekranının ön konsantrasyon-yanıt eğrileri göre, test edilen konsantrasyon eğrisinin dinamik aralık (Şekil 4) kapsayacak şekilde adapte edilmiştir. Drome-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [% 95 güven aralığı]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 nM) ve Drome-SNPF-of EC50 değerleri, 4 (0.50 ± 1.01 nM) da reseptörünü aktive etmek için aynı derecede etkili olduğunu gösteren, benzer. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Bir dizi konsantrasyon (50 uM 0.001 nM arasında). On iki son konsantrasyonları o bir reseptör aracılı floresan tepkisi için yazılım Şekil 2. Grafiksel çıktıf Drome-SNPF-1 peptit Drome-SNPF reseptörü üzerinde test edildi. Aktivasyon nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri olarak ifade edilir. Üst grafik altı yüksek konsantrasyonlarının sonuçları ve altı düşük konsantrasyonları alt grafiğini vermektedir. (-) Yıkama tamponu olan pozitif kontrol (+) PAR 1 (1 uM) ve negatif kontrolüdür. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Şekil 3,. Tek flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon analizi ile belirlenen Drosophila SNPF peptidlerin ön konsantrasyon-tepki eğrileri. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosophila SNPF reseptörünün konsantrasyon-yanıt eğrileri mavi gösterilmiştir. (Kırmızı ile gösterilen) negatif kontroller için, peptidler HEK293T üzerinde test edilmiştirboş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilen hücreler. Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Eğriler, her konsantrasyon serisi üç kez ölçülmüş olup, ki içinde, bir deneyin sonucudur. Dikey çubuklar (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) bazen kullanılan sembollerin daha küçük ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Şekil 4,. Konsantrasyon-yanıt eğrileri ve üç bağımsız flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyleri ile tespit Drosophila SNPF peptidlerin EC 50 değerlerine tekabül etmektedir. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosopihla SNPF reseptörünün konsantrasyon-tepki eğrileri, bir sonucudur üç bağımsız bendenasurements her bir üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir (n ≥ 9). Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Yıldız n ≤ 9. Hata çubukları, bazen de (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) kullanılan sembollerin daha küçüktür SEM, işaret etmektedir için konsantrasyonlarını gösterir. EC 50 değerleri% 95 güven aralıkları ile gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay at JoVE.com

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

characterization-g-protein-coupled-receptors-fluorescence-based

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

39.9K Görüntüleme.  KU Leuven.  Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir. 

Video: Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Biyoloji

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...