המחברים מודים קרן המחקר פלנדריה (FWO פלנדריה, בלגיה, G.0601.11) וKU Leuven קרן מחקר GOA/11/002. IB, TJ וה-LT נהנה ממלגה מFWO פלנדריה.

שימו לב: יש לבצע את כל הפעולות שבו תאים מעורבים בסביבת סטרילית על ידי עבודה בזרימה למינרית. 1. תחזוקה של הקו הסלולרי HEK293T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את תאי HEK293T בבקבוק T-75 על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים כאשר מגיעים לנקודת מפגש של 80%. הערה: זה בדרך כלל לוקח 3 עד 4 ימים. תאים בתרבית רציפה יאפשר 20-25 מעברים שמישים להקרנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מלוח של Dulbecco פוספט (PBS) ללא סידן כלורי ומגנזיום כלורי, PBS-טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (500 מיליליטר PBS בתוספת 10 מיליליטר פתרון טריפסין-EDTA ו4.5 מיליליטר 4% EDTA) ומדיום גידול (500 מיליליטר המדיום של הנשר שונה Dulbecco - גלוקוז גבוהה [DMEM] בתוספת 10% בסרום שור עוברי [FBS] ומ&quot;מ 1 [נ.ב.] פניצילין, סטרפטומיצין) בטמפרטורת חדר כחצי שעה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסירמדיום גידול הישן מהתאים. לשטוף את התאים מתים עם 3 מיליליטר PBS ולהסיר את PBS שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר PBS-טריפסין-EDTA, דגירה 1 דקות בטמפרטורת חדר ולהסיר את הערה הפתרון: המורפולוגיה של התאים תשתנה לספירה בצורת בצורת כוכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים מהחלק התחתון של הבקבוק על ידי הקשה עדינה ולאסוף את התאים על ידי שטיפה מספר פעמים התחתונה עם 10 מיליליטר של מדיום גידול טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 1 מיליליטר של תרבית התאים לT-75 בקבוק חדש המכיל 14 מיליליטר מדיום גידול טרי, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol></li></ol> 2. Transfection חולף של תאי HEK293T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את תאי HEK293T בבקבוק T-75 3 ימים לפני assay גיוס סידן בפועל מתרחש. הקפד להשתמש בשלוש T-75 צלוחיות, אחת לtransfection עם מבנה הקולטן, אחד עבור transfection עם וקטור ריק ביטוי, שליטה שלילית, וoנה לשליטת transfection. הערה: passaging של התאים מתבצע כמתואר בשלב 1.2. כאשר צלחות 96 היטב מרובות צריכה להיות מוקרנים, ניתן להשתמש בם T-150 צלוחיות כדי לקבל תשואה גבוהה יותר של תאים (כדי לעשות את זה, כפול כל כמות הרשומה בצעדים 1.2.5, 2.3, 3.1.3 ו3.1.4) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified ל20-24 שעה עד שתרביות התאים להתקרב מפגש 50-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוכלוסייה אחת שיתוף transfect תאים עם וקטור ביטוי קידוד GPCR של ריבית ומבנה Gα 16, את הבקבוק השני עם הווקטור הריק ולבנות Gα 16, ושלישי עם שליטת transfection ומבנה Gα 16. הערה: בפרוטוקול זה, קולט דרוזופילה sNPF שובט בוקטור ביטוי יונקים pcDNA3.1 13. JetPRIME שימש לביצוע transfection, אך ניתן להשתמש ריאגנטים transfection אחרים גם כן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בסך כל של 7.8 מיקרוגרם DNA (3.9 מבנה מיקרוגרם קולט או וקטור ריק, ו3.9 מיקרוגרם מבנה ביטוי 16 Gα) לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף 500 μl של חיץ JetPRIME. מערבבים היטב על ידי vortexing הצינור, ספין למטה תוך זמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 37.5 μl של מגיב JetPRIME, המערבולת וספין למטה 1 דקות ב14,000 X גרם. דגירה transfection תמהיל 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובת transfection dropwise למדיום תרבית תאים ולוודא פיפטה ישירות לתוך מדיום הימנעות ממגע עם הקירות של בקבוק התרבות. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified ל20-24 שעה. </li></ol></li></ol> 3. Assay גיוס הסיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תאי transfected וזרעם בצלחות שחורות חומה, ברורות תחתון 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את PBS, PBS-טריפסין-EDTA ובינוני העברת DMEM (500 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS dialyzedו1% PS) בטמפרטורת חדר כחצי שעה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 96 גם צלחות, שחור קירות, ברורות תחתית עם 60 μl של PBS עם פיברונקטין (0.0025%) בכל טוב (5.85 מיליליטר PBS ו150 μl פיברונקטין [0.1%] לכל צלחת). דגירה הצלחות בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 במכסה. הסר את הפתרון מהבארות ודגירת הצלחות שוב במשך שעה 1 ללא המכסה על בטמפרטורת חדר. לחלופין, אפשר להשתמש בצלחות מראש מצופים לקובץ מצורף תא מוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את מדיום גידול הישן מהתאים ולשטוף תאים מתים מעל עם 3 מיליליטר PBS ולהסיר את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר PBS-טריפסין-EDTA, דגירה במשך 1 דקות, ולאחר מכן להסיר את הפתרון. הערה: המורפולוגיה של התאים משתנה מצורת כוכב לכדור בצורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים מהחלק התחתון של הבקבוק על ידי הקשה עדינה ולאסוף אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם 10 מיליליטר של מדיום DMEM העברה. להעביר את התאים לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזןמספר התאים למ&quot;ל (הופיע עם NucleoCounter כאן, אבל התא של &#39;שודד גופות מקובל). הוספה של תרבית התאים 100 μl בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוספת 100 מאגר תמוגה μl ומערבבים על ידי הקשה על הצינור. הוספת 100 חיץ μl ייצוב ומערבבים על ידי הקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא NucleoCassette עם ההשעיה התא ולספור את התאים עם הדלפק. להכפיל את מספר התאים על ידי שלוש, כפי שהתאים היו מדוללים בפקטור של שלוש בעת הוספת תמוגה וייצוב חיץ בשלב 3.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים לריכוז סופי של 600,000 תאים / מיליליטר וזרעים 150 μl של התאים לכל גם בצלחות מצופים כדי להשיג צפיפות תאים של כ 90,000 תאים לכל / כן. למנוע בועות אוויר ולנצל את הצלחת על מנת להפיץ את התאים באופן שווה על מנת לקבל שכבת תאים רציפה. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified ל16-24 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התאים עם פלורסנט לצבוע ולהכין את שיתוףצלחת mpound. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / אלבומין בסרום שור (BSA) חיץ: להוסיף 165 פתרון מניות μl CaCl 2 (1 M CaCl 2 במים מזוקקים [DH 2 O] - לאחסן בטמפרטורת חדר), פתרון מניות 500 HEPES μl (1 M HEPES ב DH 2 O, pH 7.4 - לאחסן בטמפרטורת חדר), ו0.05 BSA גרם ל50 מיליליטר HBSS. שים לב שBSA החופשי של חומצות שומן המשמש למבחנים בסידן, כמו חומצות שומן יכולות להפעיל קולטנים ספציפיים, פוגם באות סידן של הקולטן של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פרובנציד (100x, 250 מ&quot;מ): להמס פרובנציד 0.71 גרם ב 5 מיליליטר NaOH (1 M) ולהוסיף 50 HEPES μl פתרון מניות ו5 מיליליטר של / HEPES / Ca 2 + / החיץ BSA HBSS - תמיד להכין תמיסה טריות. הערה: פרובנציד מעכב מובילי אניון אורגניים שיכול לעקור Fluo-4 מציטופלסמה, ובכך להפחית את אות הניאון. מומלץ לבצע את טעינת הצבע בהנוכחות והיעדר פרובנציד כדי לקבוע אם מובילי אניון אורגניים מהווים בעיה פוטנציאלית בשורות תאים מסוימות תחת חקירה, כפרובנציד אולי אפילו להקטין את האות בתיווך אגוניסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חיץ: להוסיף 500 μl פתרון פרובנציד 50 מיליליטר HBSS / HEPES / Ca 2 + / חיץ BSA, התאם את ה-pH 7.4 ותסנין פתרון החיץ. תמיד להכין חיץ טרי, ו50 מיליליטר חיץ לנדרשת צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% תמיסת חומצת pluronic: חומצת pluronic לערבב 50 μl (20% w / v בדימתיל-sulfoxide [DMSO]) עם 50 DMSO μl - אם התגבשות מתרחשת, חום ל37 מעלות צלזיוס, תמיד להכין תמיסה טריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון Fluo-4 בבוקר (1 מ&quot;מ): להוסיף 44 פתרון μl 10% חומצה pluronic לבקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם Fluo-4 בבוקר ומערבולת עד שהוא נמס לגמרי. הימנע מחשיפה לאור כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ טעינה: להוסיף 8.8 מיליליטר DMEM supplementeד עם 10 HEPES מ&quot;מ ו2.5 פרובנציד מ&quot;מ (pH 7.4) לפתרון Fluo-4 בבוקר (44 μl) ו המערבולת. השתמש תמיד חיץ טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל בינוני מהתאים, לשטוף את התאים עם 200 μl PBS לכל טוב, ולהסיר את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 55 חיץ טעינת μl לכל טוב ודגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. עטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה של הצלחת להדליק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לייבש את התרכובות לפני שהמסך אם הם מומסים בממסים שמשפיעים לרעה (למשל, אצטוניטריל) למערכת הביטוי התאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize פפטידים בחיץ לשטוף בצינורות 1.5 microcentrifuge מיליליטר siliconized. להכין סדרת דילול לבצע ניתוח ריכוז תגובה וכדי לקבוע את ערך EC 50 של ליגנד. הוספת 70 μl של ליגנד במקביל גם של הצלחת המורכבת (צלחות 96, גם בצורת V) וכולל בקרות חיוביות (אגוניסט אנדוגני) ושליליות (חיץ לשטוף) על כל צלחת. לא<html> דואר: אם תרכובת אינה מסיסה בחיץ לשטוף, אפשר לנסות ממסים אחרים שאינם מזיקים לתאים תחת חקירה, כגון מים או פתרונות שemulsify וsolubilize שמנים וחומרים אחרים לא מסיסים במים (לדוגמא, Kolliphor EL) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את כל הדגימות בשלושת עותקים. זכור כי 50 μl של ליגנד מצלחת המתחם יועבר להיטב עם 100 לשטוף חיץ μl של צלחת התא במהלך assay, אז להכין את התרכובות ב3x הריכוז הסופי הרצוי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את חיץ הטעינה מצלחת התא ולהוסיף למאגר לשטוף 100 μl היטב כל אחד. דגירה דקות צלחת 15 בטמפרטורת חדר ולמנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את החיץ לשטוף מצלחת התא ולהוסיף 100 לשטוף חיץ חדש μl היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת התא, צלחת המתחם, ומתלת קצה (96 היטב, טיפים פיפטה מכשיר תחנה) ל15 דקות ב 37 ° C. </li></ol></li></ol>הכותרת &quot;&gt; 4. Assay על ההתקנים התחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור ולטעון את קובץ הפרוטוקול הרצוי עם התוכנה ולהפעיל את יחידת בקרת הטמפרטורה לחדר הקריאה. כאן, למדוד תגובות סידן ב37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות שורה אחת בכל פעם עם 1.52 מרווח שניות בין קריאות רצופות (מדידת צלחת 96 היטב מלאה לוקחת כ 25 דקות) ב525 ננומטר. הגדר את העירור של Fluo-4-488 ננומטר ולהעביר נפח כולל של 50 μl של מתחם לצלחת התא, 18 שניות לאחר תחילת הקריאה, עם המהירות לוותר נקבעה על 26 μl / sec וגובה פיפטה של ​​135 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המתחם וצלחת תא, ואת מדף הקצה במגירות המתאימות של מכשיר התחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אחת קריאה של צלחת התא באותו אורך גל העירור ופליטה במצב נקודת הסיום, לפני שמתחיל את המסך בפועל במצב FLEX. הערה: מדידה זו נותנת יחידת הקרינה יחסי ערכים (RFU) ומאפשרת איתור שונות בינינוLLS של הצלחת. ערכים שבין 20,000 ו -40,000 נחשבים כמקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל assay ולנתח את הנתונים עם התוכנה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success.">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+a+historical+perspective.">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li><li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms.">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li><li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+physiology+in+insects.">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li><li>Van Hiel, M. . B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents.">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li><li>Tang, X. . L., Wang, Y., Li, D. . L., Luo, J., Liu, M. . Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+deorphanizations.">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li><li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors.">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li><li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling.">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li><li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay.">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li><li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li><li>Lu, H. -. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling.">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li><li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling.">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li><li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5&#8217;-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs).">An analysis of 5&#8217;-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq&#945;+and+Gs&#945;+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation.">Carboxyl-terminal mutations of Gq&#945; and Gs&#945; that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li><li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+G&#945;16+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors.">Is G&#945;16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li><li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays.">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li><li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., G&#228;de, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+(AKH)+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors.">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li><li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes.">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת יושם בהצלחה על מנת לאשר את האפיון הפונקציונלי של מערכת איתות peptidergic דרוזופילה sNPF, שכבר בוצעה על ידי מרטנס et al. עם assay פליטת אור ועל ידי פנג et al. עם 13,15 assay אלקטרו. EC 50 הערכים שהושגו עם assay הקרינה בתאי HEK293T הם על פי 10 פחות מאלה שהושגו עם assay פליטת אור שבוצע בתאי CHO (Drome-sNPF-1: fluo = 2.04 ננומטר, לומים = 51 ננומטר; Drome-sNPF- 2: fluo = 5.89 ננומטר, לומים = 42 ננומטר; Drome-sNPF-3: fluo = 5.55 ננומטר, לומים = 31 בננומטר; Drome-sNPF-4: fluo = 0.50 ננומטר, לומים = 75 ננומטר). ניתן להסביר וריאציות אלה על ידי מספר גורמים, לרבות העובדה כי אחת ממערכות הביטוי בשימוש עשוי להיות מתאים יותר לביטוי תפקודי של הקולטן נתון, או הקיפול של כמה קולטנים יכול להיות פחות יעיל בגסוגי תאי ertain. EC 50 הערכים של כל ארבעת פפטידים Drome-sNPF הם בטווח nanomolar כאשר נבדקו על הקולטן שלהם עם שתי הקרינה וassay פליטת אור, בדרך כלל תמיכה רלוונטית הפיזיולוגית של האינטראקציה פפטיד קולטם in vivo. שים לב שאין שליטת transfection עם הקולטן ליגנד שמפעיל ידוע נכללה במסך שהוצג כאן, כי מערכת איתות דרוזופילה sNPF היא בדרך כלל שליטת transfection במערכי ניסוי. הבקרה החיובית עם יגנד אנדוגני של תאי HEK293T (PAR 1) ובקרה השלילית (לשטוף חיץ) נכללו במסך. התוצאות של PAR 1 הראו כי התאים היו במצב טוב. הבקרה השלילית (לשטוף חיץ) לא לעורר אות ניאון, אשר מצביעה על כך שהמדיום שבו הם מומסים פפטידים היה נקי מכל מזהמים שיכולים INFluence התוצאות. מערכת איתות דרוזופילה sNPF אפיין בעבר שימשה כאן כדי להסביר את assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה. לצורך כך, סדרת ריכוז של ליגנד ההפעלה נבדקו באופן מיידי. עם זאת, כאשר קולטן יתום הוא הביא לביטוי היתר בassay הקרנה לבחון ספרייה המכילה מאות תרכובות, מומלץ למסך הראשון עם ריכוזים סופיים גבוהים יחסית של ליגנד (למשל., 10 או 1 מיקרומטר). בעקבות זיהוי של מתחם הפעלה, סדרת דילול של מתחם שיכולה להיות מוקרנת כדי להלחין עקומת ריכוז בתגובה ועל מנת לקבוע את ערך EC 50. ברגע יגנד ההפעלה של קולטן נקבע, מסלול האיתות תאית יכול להיחקר יותר על ידי התאמת הפרוטוקול. Assay יכול להתבצע כפי שתואר לעיל, אך ללא שיתוף transfecting G ^5; 16 למקטע. כאשר תגובת סידן נמדדה, זה אומר שזוגות קולט עם מקטע q אנדוגני Gα של מערכת הביטוי התאי. כאשר אין אות ניאון הוא ציין, יכול להיות מיושמים על פרוטוקולים כדי למדוד שינויים בריכוזים של שליחים משניים נוספים (למשל., CAMP). יכולים גם להתבצע מחקרי קשר בין מבנה לפעילות (SAR) להגדיר רצף הליבה של פפטיד הנדרש להפעלת קולט. ראשית, רצפים קטועים מוערכים להגדיר את רצף חומצות אמינו המינימלי של פפטיד זה הוא עדיין מסוגל להפעיל את קולט. בשלב הבא, ניתן לבדוק פפטידים שבו באופן שיטתי בכל חומצת אמינו הוחלפה לשאריות אלאנין. בדיקת סדרת אלנין-החלפה סינתטית על קולט מאפשרת לקבוע את החשיבות של כל אחת מחומצות אמינו להפעלת קולט 24,25. למרות השימוש התכוף שלה ואפים מוכחיםcacy, יש בו כדי להדגיש כי assay המתואר כאן עשוי צריך קצת התאמות כדי לקבל תוצאות אופטימליות לקולטנים ספציפיים של עניין. יש למקטע Gα 16 היתרון כי הוא נקשר ביותר GPCRs, אלא גם עשוי להיות השפעה דומיננטית שלילית על קולטנים שאופן אנדוגני זוג באמצעות q Gα 22. במקרה זה, זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק שילובים שונים של חלבוני G באופטימיזציה של assay סיד רומן ולהשוות את התוצאות לקולטנים מצמידים q Gα בהעדר או הנוכחות של Gα 16. מבחני אלטרנטיביים שאינם תלויים חלבון G האינטראקציה לזהות הפעלת קולטן יכולים גם להתבצע, כגון טרנסלוקציה של arrestin-GFP שכותרתו, או זיהוי של שינויים בפוטנציאל הממברנה (למשל., על ידי ערכת Assay פוטנציאל FLIPR ממברנה). חוץ מAM Fluo-4 המשמש כאן, מגוון רחב של fluorophores סידן רגיש האחר, כל אחד עם רפאים משלו וchemicמאפייני אל, הוא זמינים. Fluorophore המתאים ביותר ניתן לבחור על בסיס GPCR, סוג התא וקורא הצלחת זמין, אבל אימות ניסיוני היא הכרחית. הכמויות של ה-DNA transfected וצורך היחס מגיב DNA / transfection שייקבע עבור כל שילוב שורה מגיב תאי קולטן transfection. לבסוף, יש לזכור כי תאים בתרבית רציפה לאפשר רק 20-25 מעברים שמישים כדי לבצע את מבחני המיון.

קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווה אחת המשפחות הגדולות והמגוונת ביותר בין כל החלבונים בתא השטח. הנוכחות שלהם בבעלי חוליות, חסרי חוליות, צמחים, שמרים, ועובש רפש, כמו גם בפרוטוזואה וdiploblastic המוקדם צורות החיים מצביעים על כך שGPCRs הן בין המולקולות הוותיקות מקושרות עם העברת אותות 1. ligands ההפעלה הטבעי שלהם מהווה מגוון רחב של גירויים חיצוניים כולל פפטידים, אמינים ביוגני, ניחוחי, גליקופרוטאינים, ופוטונים 2. ככזה, מערכות איתות הקולטן ליגנד האלה מעורבים במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים. הספקטרום הפונקציונלי הרחב הופך אותם מתאים באופן אידיאלי לפיתוח תרופות טיפוליות המכסות מגוון רחב של מחלות בבני אדם. כ 50-60% ממטרות התרופה הנוכחיות מיוצגים על ידי GPCRs 3,4. מלבד החשיבות הגדולה שלהם בתעשיית התרופות, GPCRs גם הן באור הזרקורים לפיתוחדור חדש של חומרי הדברה מינים ספציפיים 5,6 וחומרי הדברה באופן כללי. בגלל ligands הטבעי של GPCRs רבות עדיין לא מזוהה, הם מסווגים כGPCRs יתומה. Deorphanization של קולטנים אלה ישפר את ההבנה של התפקידים הפיסיולוגיים שלהם באורגניזמים ועלול לחשוף את מטרות המשוערת עבור יישומי תרופה חדשים 7. מאז העידן הגנומי, אסטרטגית פרמקולוגיה הפוכה מיושמת באופן נרחב לdeorphanization של GPCRs 8. הגישה מרמזת כי קולטן יתום משמש כ &#39;וו&#39; ל &#39;דג מחוץ&#39; ליגנד ההפעלה שלה מתמצית ביולוגית או מספרייה של תרכובות סינתטיות. GPCR של עניין הוא משובט לכן וtransfected לאחר מכן במערכת ביטוי תאית. בשיטות הנפוצות ביותר, הפעלת קולטן נקבעת על ידי מדידת שינויים בריכוז של מולקולות שליח השניה 9 </sup&gt;. מבחני מיון קולט העיקריים מסתמכים על חלבוני bioluminescent סידן רגיש (למשל, aequorin) 10 או אינדיקטורים סיד ניאון (למשל, Fluo-4) 11. מבחני הקרינה מבוססת, שבו תאי קולטן להביע נטענים עם מחוון סיד ניאון לפני הקרנת יגנד, יש את היתרון שהם מאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה בשל קלות שימוש שלהם, זמן קריאה קצר, ואת הגמישות של הקרנה קולטנים יתום מרובים על צלחת אחת 12. הנה, assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה מתואר באופן יסודי ומאויר על ידי תהליך deorphanization של F נוירופפטידים הקצר melanogaster דרוזופילה קולט (sNPF). מערכת איתות neuropeptidergic זו התאפיינה במקור על ידי מרטנס et al. ב2002 13 עם assay פליטת אור סידן שבוצע בשחלת אוגר הסינית תאים (CHO)14 ועל ידי פנג et al. ב2003 עם assay אלקטרו באמצעות Xenopus ביציות 15. הנוכחות של מערכת איתות sNPF נראית מוגבלת מהערכה של Arthropoda, שבו הוא מעורב במגוון רחב של תהליכים, כולל הרגולציה של האכלה, צמיחה, תגובות לחץ, תנועה, ומקצבי היממה 16. מחקר על מערכות איתות neuropeptidergic בחרקים לא יכול להוביל רק למטרות חדשות לפיתוח של חומרי הדברה, אך הידע של התפקוד שלהם יכול גם להסיק כלפי אורגניזמים אחרים מערכות איתות רבות, בדרך כלל כבר נשמרים היטב לאורך האבולוציה 17. בעשור האחרון, התקדמות רבה נעשתה בתהליך deorphanization של GPCRs נוירופפטידים חרקים. למרות מאמצים אלה, רק מספר קטן של קולטנים שכבר מתאימים ליגנד מאותו המקור שלהם, והמון מידע רצףGPCRs היתום החדשה הפכה זמינה בשל הרועם של גנומיקה 18. הזמינות של מדיום / גישות הקרנת תפוקה גבוהה, כמו assay גיוס הקרינה מבוססת סידן שהוכיח את עצמו בטכניקה מיושמת באופן נרחב 9,18, לכן לא יסולא בפז. Assay גיוס הקרינה מבוססת סידן כפי שמתוארים כאן מתבצע ב293T הכליה העוברי האנושי שורת תאים (HEK293T) ומשתמש בבדיקת ניאון כדי לקבוע שינויים בריכוז סידן תוך תאי על הפעלת קולט. כדי להבטיח ביטוי גבוה ורמות תרגום של הקולטן, רצף קונסנסוס קוזאק 19 מתווסף לסוף &#39;5 של רצף קידוד קולטן, שהוא משובט לאחר מכן בוקטור ביטוי (למשל, סדרת וקטור pcDNA לשורות תאי יונקים). כמו שקשה לחזות את החלבון-G הצימוד אנדוגני של GPCR יתום המבוססים על מידע רצףלבד, המולקולות השניה השליח (לדוגמא, סידן או cAMP) כי הם מווסתים לאחר הפעלת קולטן לעתים קרובות אינן ידועות מראש לזיהוי ליגנד. כדי לעקוף בעיה זו, חלבוני G מופקרים של משפחת G q (למשל, עכברי 15 Gα או Gα אדם 16 [משמש כאן]) או חלבוני chimeric G (למשל, qi5 Gα) כי אינטראקציה עם רוב GPCRs ולגרום לשחרורו של סידן יכול להיות שותף הביע 20,21,22. על הכריכה של ליגנד לקולטן שלו, GPCR עובר שינוי קונפורמציה שגורם להפעלה של מסלולים תאיים מסוימים. מולקולת דיפוספט guanosine (תמ&quot;ג), מחויבת בתנאי מנוחה למקטע Gα 16, תוחלף על ידי אדנוזין guanosine מולקולה (GTP). זה מעורר את הניתוק של חלבון G heterotrimeric במקטע Gα 16 וGβγ. מקטע Gα 16 מפעיל פוספוליפאז C &amp;946 #; (PLCβ), אשר בתורו hydrolyzes bisphosphate הקרום הנכנס phosphatidylinositol (PIP 2) וכתוצאה מכך diacylglycerol (DAG) וtrisphosphate אינוסיטול (IP 3). IP 3 יתפשט בציטופלסמה ומפעיל IP ערוצי סידן 3 תלויים בהווה בקרום של reticulum endoplasmic, אשר גורם לשחרור של סידן לתוך הציטופלסמה. שחרור סידן על הפעלת קולטן מתרחש תוך שניות ויכול להיות מזוהה על ידי טעינת תאים לפני assay ההקרנה עם צבע סידן רגיש, כמו Fluo-4 acetoxymethyl (AM) 11. קבוצת אסתר AM מאפשרת fluorophore לחצות את קרום התא, והוא הבקיע את ידי esterases cytoplasmic פעם אחת בתוך התא. כתוצאה מכך, המטענים השליליים של צבע הניאון הם חשפו, ומונעים ממנו לשדר אל מחוץ לתא ומאפשר לו אינטראקציה עם יוני סידן. O אות הניאוןו Fluo-4 הוא זניחים בתאים בתנאי מנוחה המכילים רק ריכוזי סידן בטווח nanomolar. עם זאת, כאשר סידן משתחרר עם הפעלת קולטן, האות יכול להגדיל את ריכוז dependently ליותר מ פי 100, מה שמבטיח יחס אות לרעש גדול בזאת. Fluo-4 גם מפגין טווח דינמי גדול לדיווח [סיד] סביב ד K (סידן) של 345 ננומטר, מה שהופך אותו מתאים למדידה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לשינויים בסידן במגוון רחב של תאים. העירור של Fluo-4 מתרחש ב488 ננומטר וקרינת הפליטה נמדדת ב525 11 ננומטר. Fluorimeters כמו קורא צלחת דימות פלואורסצנטי (FLIPR) 23, NOVOstar, או FlexStation (מכשיר תחנה) 12 הן מערכות בינוניות / תפוקה גבוהה המאפשרות בנוסף מתחם בו זמנית וזיהוי של אות Fluo-4 על הפעלת קולטן לכל גם בצלחת assay. Assay גיוס הסיד המתואר כאן מסתמך על התחנהמערכת microplate 96, גם מכשיר. Pro תוכנת SoftMax (תוכנה) משמשת כדי להפעיל את המכשיר לתחנה, כמו גם לניתוח נתונים. התכנית מציגה באופן מיידי את התוצאות כגרפים בפורמט 96 היטב. ניתן לבחור בארות מרובות בו זמנית כדי להשוות את התוצאה של הבארות הללו על אותו הגרף. ערכי יחידת הניאון יחסית (RFU) בארות בכל עמודה נמדדים בו זמנית, לתקופה של שתי דקות, שמתחילים לפני התוספת של תרכובות לבארות והמתמשכות לאחר המדידה של אות הניאון הבא הפעלת קולט. בדרך כלל, את המגמה של עקומת אגוניסט מתיישר עם קו הבסיס ועד מתחם הפעלה מתווסף לתאים, וכתוצאה מכך עלייה מהירה של אות הניאון. גובה השיא מתואם עם ריכוז אגוניסט הסופי בבאר. אחרי השיא, אות הניאון יורדת באיטיות לכיוון רמת הבסיס. מדידות RFU caלהיות n מומר לעקומות ריכוז בתגובה לקביעת ערך EC 50 (ריכוז יעיל חצי מקסימאלי) של ליגנד. באופן כללי, לפחות שלושה מסכי עצמאיים, שכל אחד מהם שלושה העתקים של סדרת ריכוז, יש לבצעו להלחין עקומת ריכוז בתגובה אמינה. מומלץ לכלול כמה בקרות חיוביות ושליליות בעיצוב ניסיוני. קודם כל, שליטת transfection, כלומר היישום של קולט עם יגנד ידוע, צריכה להיבדק. זה מאפשר אימות אם סוכן transfection היה מבצעי. התאגדות של ניסוי שליטה עם אגוניסט לרצפטור אנדוגני של הקו הסלולרי ובקרה שלילית (למשל, לשטוף חיץ) מומלצות גם לעקוב אחר בריאותם ויכולת הקיום של התאים וכדי לשלול את האפשרות כי לשטוף החיץ היה מזוהם עם גורם שעלול לעורר-fluore אוטומטיתגובת ריח. אגוניסטים משמשים לעתים קרובות הם פפטיד הנגזר ממופעל פרוטאז קולט-1 (PAR 1), אשר משמש כאגוניסט PAR 1 סלקטיבית, או carbachol, אשר מפעיל את קולטן האצטילכולין. תאי transfected עם וקטור ביטוי ריק גם צריכים להיבדק כדי לשלול כי חומרים פעילים באינטראקציה עם קולטנים אנדוגני של התא. אופטימיזציה של מספר פרמטרים שתוארו בפרוטוקול שלהלן עשויה להידרש למערכות איתות שונות. דמות סכמטית של assay התגייסות מלא הקרינה מבוססת סידן מתואר באיור 1. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> מדידות איור 1. תכנית כוללת של assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה. אוטומטי טיפול נוזלי וקרינה בו זמנית מבוצעות עם התחנהmicroplate מכשיר קורא, מונע על ידי התוכנה. מכשיר התחנה מכיל שלוש מגירות: אחת לצלחת התא, צלחת מתחם ומתל קצה. העברות pipettor הצטברות בתרכובות מטור אחד של צלחת המתחם לעמודה המתאימה של צלחת התא (שלב 1). היטב בכל צלחת התא מכיל monolayer של תאי HEK293T כי כבר שיתוף transfected עם GPCR של עניין ומקטע Gα 16 המופקר. כאשר מתחם מפעיל את הקולטן, תמ&quot;ג Gα 16 הנכנס הוא הוחלף על ידי GTP. מקטע Gα 16 dissociates לאחר מכן מGβγ המורכב ומפעיל פוספוליפאז Cβ (PLCβ), אשר בתורו hydrolyzes bisphosphate phosphatidylinositol (PIP 2) וכתוצאה מכך diacylglycerol (DAG) וtrisphosphate אינוסיטול (IP 3). IP 3 מפעיל IP ערוצי סידן 3 תלוי בהווה בקרום של reticulum endoplasmic, וישכנע את שחרורו של int סידןo ציטופלסמה. האינטראקציה של סידן עם Fluo-4 (שבה התאים נטענים לפני המתחם בנוסף) תוצאות באות ניאון (שלב 2). התוכנה מציגה את התוצאות כיחידת ניאון יחסי ערכים (RFU) בפונקציה של זמן, וגבהים שיא לתאם עם הריכוז ליגנד באופן תלוי ריכוז. לאחר מכן ניתן להמיר נתונים אלה לעקומת ריכוז בתגובה לקביעת ערך EC 50 של זוג (שלב 3) ליגנד לקלוט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

במשך יותר משנים 20, פרמקולוגיה ההפוכה הייתה האסטרטגיה הדגולה לגלות ligands ההפעלה של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs). תחילתה של assay פרמקולוגיה ההפך היא השיבוט וtransfection הבא של GPCR של עניין במערכת ביטוי תאית. קולט Heterologous הביע אז תיגר עם ספרייה מורכבת של ligands המועמד לזהות יגנד הפעלת קולטן (ים). הפעלת קולטן יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת שינויים בריכוז של מולקולות כתב השליח השניה, כמו סידן או במחנה. Assay גיוס הקרינה מבוססת סידן שתואר כאן הוא מדיום תפוקה משמשת לעתים קרובות להפוך assay פרמקולוגיה. GPCR היתום מתבטא transiently ב293T כליה העוברית האנושי לתאים (HEK293T) ומבנה Gα 16 מופקר הוא שיתוף transfected. בעקבות יגנד מחייב, הפעלה של מקטע Gα 16 גורמת לשחרור של f סידןrom reticulum endoplasmic. לפני הקרנת יגנד, תאי קולטן להביע נטענים עם מחוון סיד ניאון, Fluo-4 acetoxymethyl. אות הניאון של Fluo-4 היא זניחה בתאים בתנאי מנוחה, אבל יכולה להיות מוגבר יותר מ פי 100 על האינטראקציה עם יוני סידן שפורסמו לאחר הפעלת קולט. הטכניקה המתוארת אינה דורשת הקמתה של שורות תאי transfected ביציבות שבו החומר הגנטי transfected משולב לתוך הגנום התא המארח זמן רב. במקום זאת, transfection חולף, שהניבו ביטוי זמני של גן היעד, מספיק כדי לבצע את assay ההקרנה. ההתקנה מאפשרת הקרנה בינונית תפוקה של מאות תרכובות. Co-transfection של 16 Gα המופקר, שהזוגות ביותר GPCRs, מאפשר מסלול האיתות תאית כדי להיות מנותב לכיוון שחרורו של סידן, ללא קשר למסלול איתות היליד בגד &#39;אנדוגניטים. תאי HEK293T קלים לטפל והוכיחו את יעילותם לאורך השנים במבחני deorphanization הקולטן. עם זאת, אופטימיזציה של assay לקולטנים ספציפיים עשויה להישאר צורך.

סדרת ריכוז הנעה בין 50 מיקרומטר ל0.001 ננומטר נבדקו עבור כל ארבעת פפטידים דרוזופילה sNPF (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) על תאי HEK293T שtransiently לבטא את קולט דרוזופילה sNPF ומקטע Gα 16 המופקר. GPCR הופעל על ידי כל ארבעת פפטידים בריכוזים סופיים עד 0.1 ננומטר, והפעלת קולטן הייתה תלוי ריכוז. איור 2 מתאר את הגרפים המתאימים לאחד משלושה העתקים של סדרת הריכוז Drome-sNPF-1. הבקרה השלילית (לשטוף חיץ) לא לגרום לאות ניאון, תוך הבקרה החיובית (1 PAR - 1 מיקרומטר) שהושרו על הפעלה חזקה של אנדוגני קולט-1, מה שמוביל לאות גבוהה ניאון (± 30,000 RFU) מופעל פרוטאז. יצוין, כי סטייה שלהעקומה האופיינית עשויה להצביע על ליקויים. לדוגמא, עלייה מתמשכת של העקומה מבלי לחזור לנקודת ההתחלה עשויה להיות קשורה לאותות שאינם קולטן בתיווך, כגון הנוכחות של יונופורים סידן, או bilayer שומנים שיבש דליפות סידן. התוכנה מאפשרת הזנת נוסחאות כדי לקבוע את אחוז ההפעלה או שגיאות התקן של ריכוזים השונים בין יתר. הנתונים המתקבלים משמשים להלחין עקומות ריכוז בתגובה ראשוניות כדי לאמוד את EC 50 ערכים, כפי שמוצגים לארבעה פפטידים Drome-sNPF באיור 3. העקומות של איור 3 כוללות גם את הנתונים לביקורת השלילית שבו הריכוז של הסדרה פפטידים Drome-sNPF נבדקו על תאי HEK293T transfected עם וקטור pcDNA3.1 ריק. התוצאות מצביעות על כך שהתוספת של פפטידים לתאים אלה אין להם השפעה על קולטני אנדוגני, אבל אכן Activאכלתי את הקולטן של עניין. Assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה לאחר מכן חזר שלוש פעמים באופן עצמאי. בהתבסס על עקומות ריכוז בתגובה הראשוניות של המסך הראשוני, הריכוזים שנבדקו היו מותאמים כדי לכסות את הטווח הדינמי של העקומה (איור 4). ערכי EC50 של Drome-sNPF-1 (2.04 ± 1.48 ננומטר [95%]), Drome-sNPF-2 (5.89 ± 3.74 ננומטר), Drome-sNPF-3 (5.55 ± 3.95 ננומטר) וDrome-sNPF- 4 (0.50 ± 1.01 ננומטר) הם דומים, מה שמעידים שהם חזקים באותה מידה על מנת להפעיל את קולט. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> פלט איור 2. גרפי של התוכנה לתגובת הקרינה קולטן בתיווך של סדרת ריכוז. עשרה ריכוזים סופיים (החל 50 מיקרומטר ל0.001 ננומטר) oו פפטיד Drome-sNPF-1 נבדק על קולט Drome-sNPF. ההפעלה באה לידי ביטוי ביחידת ניאון יחסי ערכים (RFU). הגרף העליון נותן את התוצאות של ששת הריכוזים הגבוהים ביותר וגרף התחתון של ששת הריכוזים הנמוכים ביותר. הביקורת החיובית (+) היא PAR 1 (1 מיקרומטר) והבקרה השלילית (-) הוא לשטוף חיץ. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> איור 3. עקומות ריכוז בתגובה ראשוניות של פפטידים דרוזופילה sNPF נקבעים על ידי assay התגייסות חד הקרינה מבוססת סידן. עקומות ריכוז-התגובה של הקולטן דרוזופילה sNPF הביע transiently בתאי HEK293T לארבעה פפטידים דרוזופילה sNPF מוצגות בכחול. לבקרות השליליות (מסומנות באדום), פפטידים נבדקו על HEK293Tתאי transfected עם וקטור pcDNA3.1 ריק. תגובות הניאון מוצגות כיחסי (%) לערך הגבוה ביותר (הפעלת 100%). העקומות הן התוצאה של ניסוי אחד שבו כל אחת מסדרות ריכוז נמדדו בשלושה עותקים. הקווים האנכיים מייצגים סטיות התקן של הממוצע (SEM), שלפעמים הם קטנים יותר מאשר הסמלים המשמשים (במקרה זה, רק סימנים מתוארים). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> איור 4. עקומות ריכוז בתגובה ומתאימה EC 50 ערכים של פפטידים דרוזופילה sNPF נקבעים על ידי שלושה מבחני גיוס סידן המבוסס על הקרינה עצמאי. עקומות תגובת הריכוז של הקולטן Drosopihla sNPF הביעו transiently בתאי HEK293T לארבעה פפטידים דרוזופילה sNPF הן התוצאה מהשלוש עצמאייםasurements כל בוצע בשלושה עותקים (n ≥ 9). תגובות הניאון מוצגות כיחסי (%) לערך הגבוה ביותר (הפעלת 100%). כוכביות מצביעות על ריכוזים שלn ≤ 9. ברים שגיאה מצביעים SEM, שלפעמים הם קטנים יותר מאשר הסמלים המשמשים (במקרה זה, רק סימנים מתוארים). EC 50 ערכים מוצגים עם מרווחי הביטחון של 95% שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay at JoVE.com

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

characterization-g-protein-coupled-receptors-fluorescence-based

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

39.4K Views.  KU Leuven.  Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs). 

Video: Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...