والكتاب يعترف فلاندرز بحوث مؤسسة (FWO-VLAANDEREN، بلجيكا، G.0601.11) وجامعة لوفين الكاثوليكية البحوث في مؤسسة GOA/11/002. IB، TJ وLT الاستفادة من زمالة من FWO-VLAANDEREN.

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات التي تشارك فيها الخلايا في بيئة معقمة من خلال العمل في تدفق الصفحي. 1. صيانة الخط HEK293T الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا HEK293T في T-75 قارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور الخلايا عندما يتم التوصل إلى التقاء 80٪. ملاحظة: هذه عادة ما تستغرق 3-4 أيام. الخلايا في الثقافة مستمرة تسمح 20-25 المقاطع التي يمكن استخدامها لفرزها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفوسفات مخزنة المالحة في Dulbecco و(PBS) بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم، PBS-التربسين ethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) (500 مل PBS تستكمل مع 10 مل التربسين-EDTA الحل و 4.5 مل 4٪ EDTA) والنمو المتوسطة (500 مل متوسطة النسر Dulbecco لتعديل و- ارتفاع نسبة الجلوكوز [DMEM] تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 1 ملي البنسلين الستربتوميسين [PS]) في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة في وقت مبكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نزعمتوسطة النمو القديمة من الخلايا. شطف الخلايا الميتة مع 3 مل PBS وإزالة PBS مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل PBS-التربسين EDTA-، واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الحل ملاحظة: سوف مورفولوجيا الخلايا من تغيير لشكل المجال، على شكل نجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف الخلايا من الجزء السفلي من القارورة التي كتبها طيف التنصت وجمع الخلايا وذلك بدهن أسفل عدة مرات مع 10 مل من المتوسط ​​نمو جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من خلية ثقافة جديدة إلى T-75 قارورة تحتوي على 14 مل متوسطة النمو الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. </li></ol></li></ol> 2. ترنسفكأيشن عابر من خلايا HEK293T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا HEK293T في T-75 قارورة قبل 3 أيام مقايسة تعبئة الكالسيوم الفعلي تأخذ مكان. تأكد من استخدام ثلاثة T-75 قوارير، واحدة للترنسفكأيشن مع بناء مستقبل، واحدة للترنسفكأيشن مع ناقلات فارغة التعبير، ومراقبة سلبية، وسشمال شرق لمراقبة ترنسفكأيشن. ملاحظة: يتم تنفيذ الركض الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2. عندما يكون لديك عدة لوحات 96 جيدا ليتم عرضه، T-150 القوارير يمكن استخدامها للحصول على عائدات أعلى من الخلايا (للقيام بذلك، انقر نقرا جميع الكميات المذكورة في خطوات 1.2.5، 2.3، 3.1.3 و3.1.4) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان القوارير في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل20-24 ساعة حتى مزارع الخلايا الاقتراب 50-70٪ التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك بالنقل السكان واحدة من الخلايا مع ناقلات التعبير ترميز النوع من الاختزال من الفائدة وبناء Gα 16، القارورة الثانية مع ناقلات الفارغة وبناء Gα 16، والثالثة مع السيطرة ترنسفكأيشن وبناء Gα 16. ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استنساخ مستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF في pcDNA3.1 الثدييات التعبير ناقلات 13. وقد استخدم JetPRIME لأداء ترنسفكأيشن، ولكن الكواشف ترنسفكأيشن أخرى يمكن استخدامها كذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلىOTAL من 7.8 ميكروغرام الحمض النووي (3.9 ميكروغرام مستقبلات بناء أو ناقلات الفارغة، و 3.9 ميكروغرام Gα 16 بناء التعبير) إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة JetPRIME. مزيج جيد من قبل vortexing الأنبوب، وتدور باستمرار قريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37.5 ميكرولتر من كاشف JetPRIME، دوامة وتدور باستمرار لمدة 1 دقيقة في 14،000 ز س. احتضان دقيقة ترنسفكأيشن مزيج 10 في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة قطرة مزيج ترنسفكأيشن إلى مستنبت الخلايا والتأكد من ماصة مباشرة في المتوسطة وتجنب الاتصال مع جدران القارورة الثقافة. احتضان القوارير في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل20-24 ساعة. </li></ol></li></ol> 3. تعبئة الكالسيوم الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والبذور لهم في، لوحات 96 جيدا الأسود الجدران واضحة من الأسفل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع برنامج تلفزيوني، PBS-التربسين EDTA-ونقل المتوسطة DMEM (500 مل DMEM تستكمل مع FBS 10٪ مدالو1٪ PS) في درجة حرارة الغرفة نصف ساعة مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف ال 96 جيدا السوداء الجدران، لوحات القاع واضحة مع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع فبرونيكتين (0.0025٪) لكل بئر (5.85 مل PBS و 150 ميكرولتر فبرونيكتين [0.1٪] في لوحة). احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع غطاء على. إزالة الحل من الآبار واحتضان لوحات مرة أخرى لمدة 1 ساعة بدون غطاء على درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، فإنه من الممكن استخدام لوحات ما قبل المغلفة لتعزيز مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع المتوسطة النمو القديم من الخلايا وشطف الخلايا الميتة قبالة مع 3 مل PBS وإزالة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل PBS-التربسين EDTA-، واحتضان لمدة 1 دقيقة، ثم إزالة الحل. ملاحظة: مورفولوجيا الخلايا من التغييرات على شكل نجمة على شكل المجال ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف الخلايا من الجزء السفلي من القارورة التي كتبها طيف التنصت وجمع لهم من قبل الشطف عدة مرات مع 10 مل من DMEM نقل متوسطة. نقل الخلايا في أنبوب فالكون 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدعدد الخلايا لكل مل (يؤديها مع NucleoCounter هنا، ولكن الغرفة لBurker هو مقبول). إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر العازلة تحلل والمزيج من خلال الاستفادة من أنبوب. إضافة 100 ميكرولتر العازلة واستقرار مزيج من قبل التنصت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء NucleoCassette مع تعليق خلية وعدد الخلايا مع العداد. مضاعفة عدد الخلايا على ثلاثة، حيث كانت مخففة الخلايا بمعامل ثلاثة عند إضافة تحلل واستقرار عازلة في الخطوة 3.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا إلى تركيز النهائي من 600،000 خلية / مل والبذور 150 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحات المغلفة للحصول على كثافة خلية من خلايا حوالي 90،000 في / جيد. تجنب فقاعات الهواء والاستفادة من لوحة لنشر الخلايا بالتساوي من أجل الحصول على طبقة الخلايا متجاورة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل16-24 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا مع صبغة الفلورسنت وإعداد المشتركلوحة mpound. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) / HEPES / كا 2 + / ألبومين المصل البقري (BSA) المخزن المؤقت: إضافة 165 ميكرولتر و CaCl 2 محلول المخزون (1 M و CaCl 2 في الماء المقطر [DH 2 O] - تخزينها في درجة حرارة الغرفة)، محلول المخزون 500 HEPES ميكرولتر (1 M HEPES في DH 2 O، ودرجة الحموضة 7.4 - تخزينها في درجة حرارة الغرفة)، و 0.05 غرام BSA إلى 50 مل HBSS. ملاحظة يتم استخدام الأحماض الدهنية الحرة BSA لفحوصات الكالسيوم، كما يمكن أن الأحماض الدهنية تنشيط مستقبلات محددة، عرقلة إشارة الكالسيوم من مستقبلات المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل البروبينسيد (100X، 250 ملم): حل ز 0.71 البروبينسيد في 5 مل هيدروكسيد الصوديوم (1 M) وإضافة 50 ميكرولتر HEPES محلول المخزون و 5 مل من HBSS / HEPES / كا 2 + / BSA العازلة - دائما إعداد حل الطازجة. ملاحظة: يمنع نقل أنيون بالبروبنيسيد غير العضوية التي يمكن طرد فلوو-4 من السيتوبلازم، مما يقلل من إشارة الفلورسنت. فمن المستحسن لإجراء التحميل الصبغة فيوجود وعدم وجود البروبينسيد لتحديد ما إذا كان نقل أنيون غير العضوية يمثل مشكلة محتملة في خطوط خلية معينة قيد التحقيق، كما البروبينسيد بل قد تقلل من إشارة بوساطة ناهض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غسل العازلة: إضافة 500 ميكرولتر حل البروبينسيد إلى 50 مل HBSS / HEPES / كا 2 + / BSA العازلة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والترشيح حل العازلة. إعداد دائما العازلة الطازجة، و 50 مل العازلة لكل مطلوب لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10٪ من محلول حمض بلورونيك: مزيج 50 ميكرولتر حمض بلورونيك (20٪ ث / ت في ثنائي ميثيل-سلفوكسيد [دمس]]) مع 50 ميكرولتر DMSO - في حالة حدوث التبلور، والحرارة إلى 37 درجة مئوية، وتعد دائما حل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد فلوو-04:00 الحل (1MM): إضافة 44 ميكرولتر حل 10٪ حمض بلورونيك إلى قارورة تحتوي على 50 ميكروغرام فلوو-4 صباحا ودوامة حتى يذوب تماما. تجنب التعرض للضوء لمنع تبييض من fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة التحميل: إضافة 8.8 مل DMEM supplementeد مع 10 ملي HEPES و 2.5 ملي البروبينسيد (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى فلوو-04:00 حل (44 ميكرولتر) ودوامة. دائما استخدام عازلة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل المتوسطة من الخلايا، وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر PBS لكل بئر، وإزالة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 55 ميكرولتر العازلة التحميل لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد لتجف قبل المركبات الشاشة إذا تم حلها في المذيبات التي تضر (على سبيل المثال، أسيتونتريل) لنظام التعبير الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الببتيدات في غسل العازلة في siliconized أنابيب microcentrifuge 1.5 مل. إعداد سلسلة التخفيف لإجراء تحليل تركيز الاستجابة وتحديد قيمة EC 50 ليجند. إضافة 70 ميكرولتر من يجند في المقابلة بئر من لوحة مجمع (لوحات 96 جيدا على شكل حرف V) وتشمل إيجابية (ناهض الذاتية) والسلبية الضوابط (غسل العازلة) على كل لوحة. ليس<html> ه: إذا مركب لا يذوب في غسل العازلة، يمكن للمرء أن محاولة المذيبات الأخرى التي ليست مؤذية للخلايا قيد التحقيق، مثل الماء أو الحلول التي يستحلب وذوبان الزيوت والمواد غير القابلة للذوبان في الماء الأخرى (على سبيل المثال، Kolliphor EL) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس جميع العينات في ثلاث نسخ. نضع في اعتبارنا أن 50 ميكرولتر من يجند من لوحة المجمع سيتم نقلها إلى بئر مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة لوحة الخلية أثناء الفحص، لذلك تحضير مركبات في 3x أخرى تركيز النهائي المنشود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل العازلة تحميل من لوحة الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر غسل العازلة إلى كل بئر. احتضان لوحة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومنع التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل غسل العازلة من لوحة الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر غسل العازلة جديدة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لوحة، لوحة المركبة، ورف غيض (96 جيدا، نصائح ماصة جهاز المحطة) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li></ol>عنوان &quot;&gt; 4. الفحص على محطة الأجهزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وتحميل الملف المطلوب بروتوكول مع البرنامج وتفعيل وحدة التحكم في درجة الحرارة لغرفة القراءة. هنا، وقياس ردود الكالسيوم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة صف واحد في وقت واحد مع 1.52 ثانية الفاصل الزمني بين القراءات المتتالية (قياس كاملة لوحة 96 جيدا يستغرق حوالي 25 دقيقة) في 525 نانومتر. تعيين الإثارة من فلوو-4-488 نانومتر، ونقل وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر من مركب إلى لوحة خلية، 18 ثانية بعد بدء القراءة، مع سرعة الاستغناء الغروب في 26 ميكرولتر / ثانية وعلى ارتفاع 135 ميكرولتر ماصة لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المركبة والخلية، ورف طرف في الأدراج المناسبة للجهاز المحطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء قراءة واحدة من لوحة الخلية في نفس الإثارة وانبعاث الطول الموجي في وضع نقطة النهاية قبل البدء في الشاشة الفعلية في وضع FLEX. ملاحظة: هذا القياس يعطي حدة مضان النسبي (RFU) القيم ويتيح الكشف عن التباين بين نحنLLS من لوحة. تعتبر القيم بين 20،000 و 40،000 أمرا مقبولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء فحص وتحليل البيانات مع البرنامج. </li></ol>

<ol>
	<li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success.">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+a+historical+perspective.">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li><li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms.">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li><li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+physiology+in+insects.">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li><li>Van Hiel, M. . B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents.">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li><li>Tang, X. . L., Wang, Y., Li, D. . L., Luo, J., Liu, M. . Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+deorphanizations.">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li><li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors.">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li><li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling.">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li><li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay.">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li><li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li><li>Lu, H. -. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling.">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li><li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling.">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li><li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5&#8217;-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs).">An analysis of 5&#8217;-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq&#945;+and+Gs&#945;+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation.">Carboxyl-terminal mutations of Gq&#945; and Gs&#945; that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li><li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+G&#945;16+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors.">Is G&#945;16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li><li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays.">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li><li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., G&#228;de, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+(AKH)+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors.">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li><li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes.">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تم تطبيق فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان بنجاح لتأكيد توصيف وظيفي للنظام ببتيدي المفعول إشارات ذبابة الفاكهة SNPF، التي كان يؤديها بالفعل ميرتنز وآخرون. مع فحص تلألؤ بيولوجي وفنغ وآخرون. مع مقايسة 13،15 الكهربية. قيم EC 50 تم الحصول عليها مع مقايسة مضان في الخلايا HEK293T حوالي 10 أضعاف أقل من تلك التي حصلنا عليها مع مقايسة تلألؤ بيولوجي يؤديها في الخلايا CHO (دروم-SNPF-1: FLUO = 2.04 نانومتر، ومي = 51 نانومتر؛ دروم-SNPF- 2: FLUO = 5.89 نانومتر، ومي = 42 نانومتر؛ دروم-SNPF-3: FLUO = 5.55 نانومتر، ومي = 31 نانومتر؛ دروم-SNPF-4: FLUO = 0.50 نانومتر، ومي = 75 نانومتر). هذه الاختلافات يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل، بما في ذلك حقيقة أن واحدا من أنظمة التعبير المستخدم قد يكون أكثر ملاءمة للتعبير الوظيفية للمستقبلات معينة، أو قابلة للطي من بعض المستقبلات يمكن أن تكون أقل كفاءة في جأنواع الخلايا ertain. قيم EC 50 من كل أربعة الببتيدات دروم-SNPF هي في حدود nanomolar عند اختباره على مستقبلات مع كل من مضان وفحص تلألؤ بيولوجي، ودعم عموما أهمية الفسيولوجية التي تفاعل مستقبلات الببتيد في الجسم الحي. لاحظ عدم وجود رقابة ترنسفكأيشن مع مستقبلات لوالذي يعرف يجند تفعيل أدرج في الشاشة المعروضة هنا، وذلك لأن نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF عادة السيطرة ترنسفكأيشن في الاجهزة التجريبية. أدرجت سيطرة إيجابية مع يجند الذاتية للخلايا HEK293T (PAR 1) والسيطرة السلبية (غسل العازلة) في الشاشة. أظهرت نتائج PAR 1 أن الخلايا كانت في حالة جيدة. فإن السيطرة السلبية (غسل العازلة) لا تثير إشارة الفلورسنت، مما يدل على أن الوسط الذي تذوب الببتيدات كانت خالية من أي من الملوثات التي يمكن أن الوقود النووي المشعluence النتائج. تم استخدام نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF تتميز سابقا هنا لشرح فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. لهذا الغرض، تم اختبار سلسلة تركيز بروابط تفعيل على الفور. ومع ذلك، عندما يتم إحضارها على مستقبلات اليتيم إلى من overexpression في فحص فحص لاختبار مكتبة تحتوي على مئات من المركبات، فمن المستحسن أن الشاشة الأولى مع تركيزات عالية نسبيا النهائي للبروابط (على سبيل المثال، 10 أو 1 ميكرومتر). بعد الكشف عن مركب تفعيل، سلسلة التخفيف من هذا المركب يمكن فرزهم من أجل أن يؤلف منحنى التركيز والاستجابة وتحديد قيمة EC 50. مرة واحدة يتم تحديد يجند تفعيل لمستقبلات، يمكن التحقيق إشارات مسار الخلايا مزيدا من التكيف مع البروتوكول. لا يمكن أن يؤديها الفحص كما هو موضح أعلاه، ولكن من دون التعاون transfecting مجموعة ^5 و 16 الوحيدات. عندما يتم قياس استجابة الكالسيوم، فهذا يعني أن الأزواج مع مستقبلات الذاتية Gα ف الوحيدات من نظام التعبير الخلوية. عندما لوحظ عدم وجود إشارة الفلورسنت، ويمكن تطبيق بروتوكولات لقياس التغيرات في تركيزات رسل ثانوية أخرى (على سبيل المثال، المخيم). ويمكن أيضا أن تتم العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد تسلسل الأساسية الببتيد هو مطلوب لتنشيط مستقبلات. أولا، يتم تقييمها لتحديد تسلسل اقتطاع الحد الأدنى من تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد التي لا تزال قادرة على تنشيط مستقبلات. المقبل، ويمكن اختبار الببتيدات التي منهجي تم استبداله كل الأحماض الأمينية للحصول على بقايا ألانين. اختبار الاصطناعية سلسلة ألانين بدائل على مستقبلات يسمح لتحديد أهمية كل من الأحماض الأمينية لتنشيط مستقبلات 24،25. على الرغم من استخدامه المتكرر وايفي ثبتcacy، فإنه لابد من التأكيد على أن مقايسة الموصوفة هنا قد تحتاج الى بعض التعديلات للحصول على نتائج أفضل لمستقبلات محددة من الفائدة. الوحيدات Gα 16 لديه ميزة أنه يربط معظم GPCRs، ولكن قد يكون لها أيضا تأثير سلبي على المهيمنة على المستقبلات التي التطور الطبيعي الزوجين عبر Gα ف 22. في هذه الحالة، قد يكون من المفيد لاختبار مجموعات مختلفة من البروتينات G خلال تعظيم الاستفادة من مقايسة الكالسيوم الرواية ومقارنة النتائج للGα مستقبلات مقترنة ف في غياب أو وجود Gα 16. ويمكن أيضا فحوصات البديلة التي تكون مستقلة من البروتين G التفاعل للكشف عن تنشيط مستقبلات أن يؤديها، مثل إزفاء من GFP المسمى arrestin، أو الكشف عن التغيرات في غشاء المحتملة (على سبيل المثال، من قبل FLIPR غشاء الفحص كيت المحتملة). إلى جانب فلوو-04:00 المستخدمة هنا، مجموعة واسعة من fluorophores الكالسيوم الحساسة الأخرى، مع كل الأطياف الخاصة وكيميائيخصائص القاعدة ومتاح. يمكن تحديد fluorophore الأنسب على أساس النوع من الاختزال، نوع من الخلايا وقارئ لوحة المتاحة، ولكن التحقق التجريبي هو ضروري. كميات من الحمض النووي transfected والحمض النووي / ترنسفكأيشن حاجة كاشف نسبة يتم تحديدها لكل مستقبلات ترنسفكأيشن تركيبة خط خلية كاشف. أخيرا، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن الخلايا في الثقافة مستمرة تسمح فقط 20-25 المقاطع التي يمكن استخدامها لإجراء فحوصات الفرز.

G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) تشكل واحدة من أكبر والأكثر تنوعا بين جميع الأسر بروتينات سطح الخلية. وجودهم في الفقاريات واللافقاريات والنباتات، والخميرة، وسال لعابه العفن، وكذلك في البروتوزوا وأقرب مزدوج الطبقات المنتشة Metazoa يشير إلى أن GPCRs هي من بين أقدم الجزيئات مرتبطة مع نقل الإشارة 1. تشمل بروابط بهم تفعيل الطبيعية مجموعة متنوعة واسعة من المحفزات الخارجية بما في ذلك الببتيدات والأمينات الاحيائية، عطر، بروتينات سكرية، والفوتونات 2. على هذا النحو، وتشارك هذه الأنظمة إشارات مستقبلات يجند في مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الفيزيولوجية. وظيفية واسعة الطيف يجعلها مناسبة بشكل مثالي لتطوير العقاقير العلاجية التي تغطي مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان. وتمثل نحو 50-60٪ من المخدرات الأهداف الحالية GPCRs 3،4. إلى جانب أهميتها الكبرى في صناعة الأدوية، GPCRs أيضا في دائرة الضوء لتطويرجيل جديد من المبيدات الحشرية أنواع محددة 5،6 والمبيدات بشكل عام. لأن بروابط الطبيعية لكثير من GPCRs لا تزال مجهولة، وتصنف على أنها GPCRs اليتيم. سوف deorphanization هذه المستقبلات تحسين فهم الأدوار الفسيولوجية في الكائنات الحية، ويمكن الكشف عن الأهداف المفترضة للتطبيقات دواء جديد 7. منذ عهد الجيني، يتم تطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية الصيدلة العكسي لdeorphanization من GPCRs 8. يعني النهج أن مستقبلات اليتيم يستخدم ك &quot;هوك&quot; إلى &quot;سمكة خارج&quot; يجند تفعيل لها من استخراج البيولوجية أو من مكتبة من المركبات الاصطناعية. ولذلك استنساخ النوع من الاختزال المصالح وtransfected في وقت لاحق في نظام التعبير الخلوية. في الأساليب الأكثر شيوعا، يتم تحديد تنشيط مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني رسول 9 </suع&gt;. الرئيسية المقايسات فحص مستقبلات تعتمد على البروتينات الحساسة للإضاءة الحيوية الكالسيوم (على سبيل المثال، aequorin) 10 أو مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت (على سبيل المثال، فلوو-4) 11. المقايسات القائم على مضان، والتي يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت قبل الفحص يجند، لديها ميزة أنها تسمح الفرز الفائق الإنتاجية بسبب سهولة استخدامها، والوقت قصير القراءة، ومرونة الفرز مستقبلات اليتيم متعددة على لوحة واحدة 12. هنا، يوصف بدقة فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان ويتضح من عملية deorphanization من ذبابة الفاكهة السوداء البطن قصيرة نيوروبيبتيدي F (SNPF) مستقبلات. وقد تميزت هذه neuropeptidergic نظام الإشارات في الأصل من قبل ميرتنز وآخرون. في عام 2002 13 مع تلألؤ بيولوجي مقايسة الكالسيوم أجريت في الهامستر الصينية المبيض (شو) الخلايا14 وفنغ وآخرون في عام 2003 مع مقايسة الكهربية باستخدام البويضات القيطم 15. يبدو وجود أنظمة الإنذار SNPF ان تقتصر على الأسرة في اللغات من المفصليات، حيث تورط في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك تنظيم التغذية، والنمو، ردود فعل الإجهاد، وتحرك، وايقاعات كل يوم 16. البحث على أنظمة إشارات neuropeptidergic في الحشرات قد لا يؤدي إلا إلى أهداف جديدة لتطوير المبيدات الحشرية، ولكن معرفة أدائها ويمكن أيضا استقراء نحو الكائنات الحية الأخرى تم العديد من أنظمة الإشارات عموما حفظا جيدا في جميع أنحاء تطور 17. في العقد الأخير، أحرز تقدم كبير في عملية deorphanization من GPCRs نيوروبيبتيدي الحشرات. على الرغم من هذه الجهود، تم يقابل عددا صغيرا فقط من المستقبلات ليجند بها وما شابه ذلك، والكثير من المعلومات عن تسلسلأصبح GPCRs اليتيم الجديدة المتاحة نتيجة لازدهار الجينوميات 18. توافر متوسطة / عالية الإنتاجية النهج الفرز، مثل الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان أن ثبت أن تقنية تطبيقها على نطاق واسع 9،18، وبالتالي لا تقدر بثمن. يتم تنفيذ فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان كما هو موضح هنا في الإنسان الجنينية و293T الكلى (HEK293T) خط الخلية ويستخدم المسبار الفلورسنت لتحديد التغييرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا على تنشيط مستقبلات. لضمان التعبير عالية ومستويات ترجمة للمستقبلات، يتم إضافة تسلسل إجماع كوزاك 19 إلى 5 &#39;نهاية تسلسل الترميز مستقبلات، والتي يتم استنساخ لاحقا في ناقلات التعبير (على سبيل المثال، pcDNA سلسلة ناقلات لخطوط خلايا الثدييات). كما أنه من الصعب التنبؤ الذاتية G البروتين من اقتران النوع من الاختزال اليتيم على أساس تسلسل المعلوماتوحدها، وجزيئات رسول الثانية (على سبيل المثال، الكالسيوم أو المخيم) التي يتم التضمين بعد تنشيط مستقبلات في كثير من الأحيان لا تزال مجهولة قبل تحديد يجند. للتحايل على هذه المشكلة، والبروتينات G منحل من عائلة G ف (على سبيل المثال، الفئران Gα 15 أو الإنسان Gα 16 [المستخدمة هنا]) أو البروتينات G خيالية (على سبيل المثال، Gα qi5) التي تتفاعل مع معظم GPCRs وتحفز اطلاق سراح الكالسيوم يمكن يشترك-أعرب 20،21،22. على الملزم ليجند لمستقبله، وتخضع لعملية تغيير النوع من الاختزال بتكوين الذي يؤدي إلى تفعيل مسارات محددة داخل الخلايا. وغوانوزين ثنائي فسفات (GDP) جزيء، ملزمة في ظل ظروف يستريح إلى الوحيدات Gα 16، وسوف تحل محلها ثلاثي الفوسفات غوانوزين (GTP) جزيء. هذا يثير التفكك من البروتين G heterotrimeric في Gα 16 و Gβγ الوحيدات. الوحيدات Gα 16 ينشط فسفوليباز C &amp;# 946؛ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes في غشاء محدد فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). سوف IP 3 منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم وينشط IP قنوات الكالسيوم التي تعتمد على 3 الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الذي يحث على الإفراج عن الكالسيوم في السيتوبلازم. الافراج الكالسيوم على تنشيط مستقبلات يحدث في غضون ثوان، ويمكن أن يتم الكشف عن طريق تحميل الخلايا قبل الفحص الفحص مع صبغة الكالسيوم الحساسة، مثل فلوو-4 acetoxymethyl (ص) 11. وAM استر المجموعة تمكن fluorophore لعبور غشاء الخلية والمشقوق قبالة عن طريق الاسترات حشوية مرة واحدة داخل الخلية. وبالتالي، يتم الكشف عنهم التهم السلبية للصبغة الفلورسنت، ومنعه من نشرها خارج الخلية والسماح لها أن تتفاعل مع أيونات الكالسيوم. إشارة فلوري سو فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة التي تحتوي على تركيزات الكالسيوم فقط في نطاق nanomolar. ومع ذلك، عندما يتم تحريرها على تنشيط مستقبلات الكالسيوم، ويمكن الإشارة زيادة تركيز تابع لأكثر من 100 أضعاف، وضمان بموجبه نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء. FLUO-4 المعروضات أيضا مجموعة ديناميكية كبيرة للإبلاغ [الكالسيوم] حول K د (الكالسيوم) من 345 نانومتر، مما يجعلها مناسبة لقياس التغيرات الفسيولوجية ذات الصلة الكالسيوم في مجموعة واسعة من الخلايا. إثارة فلوو-4 يحدث في 488 نانومتر، ويتم قياس الانبعاثات مضان في 525 نانومتر 11. Fluorimeters مثل قارئ لوحة التصوير مضان (FLIPR) 23، وNOVOstar، أو FlexStation (جهاز المحطة) هي 12 / نظم عالية الإنتاجية المتوسطة التي تسمح في وقت واحد بالإضافة إلى ذلك المجمع وكشف عن إشارة فلوو-4 على تنشيط مستقبلات لكل جيدا في لوحة الفحص. مقايسة تعبئة الكالسيوم وصفها هنا تعتمد على المحطة96 جهاز جيدا نظام صفيحة ميكروسكوبية. يتم استخدام SoftMax برو البرمجيات (البرمجيات) لتشغيل جهاز المحطة وكذلك لتحليل البيانات. البرنامج يعرض على الفور النتائج على النحو الرسوم البيانية في شكل 96 جيدا. يمكن اختيار آبار متعددة في وقت واحد لمقارنة نتائج هذه الآبار على نفس الرسم البياني. يتم قياس وحدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم الآبار في كل عمود في وقت واحد لمدة دقيقتين، تبدأ قبل إضافة مركبات للآبار واستمرار بعد قياس إشارة الفلورسنت التالية تنشيط مستقبلات. عادة، اتجاه منحنى ناهض ينسجم مع خط الأساس حتى يتم إضافة مركب تفعيل إلى الخلايا، مما أدى إلى زيادة سريعة للإشارة الفلورسنت. ويرتبط ارتفاع الذروة مع تركيز ناهض النهائي في البئر. بعد الذروة، إشارة الفلورسنت يسقط ببطء نحو مستوى خط الأساس. القياسات RFU كاليفورنيان تحويلها إلى منحنيات التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 (التركيز الفعال نصف القصوى) ليجند. بشكل عام، لا يقل عن ثلاث شاشات مستقلة، كل منها ثلاث نسخ طبق الأصل من سلسلة التركيز، ويجب أن يتم تنفيذ لإنشاء منحنى التركيز على الاستجابة موثوق بها. فمن المستحسن لتشمل العديد من الضوابط الإيجابية والسلبية في التصميم التجريبي. أولا، عنصر تحكم ترنسفكأيشن، أي تنفيذ مستقبلات مع يجند المعروف، وينبغي اختبار. وهذا يسمح التحقق ما إذا كان وكيل ترنسفكأيشن التشغيلية. ينصح إدماج تجربة التحكم مع ناهض لمستقبلات الذاتية من خط الخلية والسيطرة السلبية (على سبيل المثال، غسل العازلة) أيضا لمراقبة صحة وسلامة الخلايا واستبعاد احتمال أن غسل العازلة كانت ملوثة أحد العوامل التي يمكن أن تثير لصناعة السيارات في fluoreاستجابة رائحة. منبهات استخداما هي الببتيد المستمدة من تنشيط مستقبلات الأنزيم البروتيني-1 (PAR 1)، الذي يعمل بمثابة PAR 1 ناهض انتقائية، أو كرباكول، والذي ينشط مستقبلات أستيل. وينبغي أيضا أن يتم اختبار الخلايا transfected مع متجه التعبير فارغة إلى استبعاد أن المركبات النشطة تتفاعل مع مستقبلات الخلية الذاتية. تعظيم الاستفادة من العديد من المعلمات موضح في البروتوكول أدناه قد تكون هناك حاجة لأنظمة إشارات مختلفة. ويصور شخصية التخطيطي القائم على مضان كاملة الكالسيوم مقايسة تعبئة في الشكل 1. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> يتم إجراء قياسات الشكل 1. مخطط الشامل لفحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. الآلي التعامل مع السائل ومضان في وقت واحد مع محطةقارئ صفيحة ميكروسكوبية الجهاز، مدفوعا البرمجيات. يحتوي الجهاز محطة ثلاثة أدراج: واحد للخلية لوحة، لوحة المركبة وطرف الرف. التحويلات pipettor في بناء المركبات من عمود واحد من لوحة مركب إلى العمود المقابلة من لوحة الخلية (الخطوة 1). كل بئر من لوحة الخلية تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا HEK293T التي تم التعاون مع transfected-النوع من الاختزال من الفائدة ومنحل Gα 16 الوحيدات. عندما ينشط مستقبلات مركب، يتم استبدال الناتج المحلي الإجمالي Gα 16 ملزمة من قبل GTP. الوحيدات Gα 16 تنأى في وقت لاحق من مجمع Gβγ وينشط فسفوليباز Cβ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). IP 3 ينشط IP التي تعتمد على قنوات 3 الكالسيوم الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الأمر الذي أدى إلى الإفراج عن كثافة الكالسيومس السيتوبلازم. تفاعل الكالسيوم مع فلوو-4 (التي يتم تحميلها على الخلايا قبل تفاقم إضافة) النتائج في إشارة الفلورسنت (الخطوة 2). البرنامج يعرض النتائج على النحو حدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم في وظيفة من الزمن، ومرتفعات الذروة ترتبط مع تركيز يجند بطريقة تعتمد على التركيز. ويمكن بعد ذلك تحويل هذه البيانات إلى منحنى التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 من زوج يجند مستقبلات (الخطوة 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

لأكثر من 20 عاما، وقد تم الصيدلة عكس استراتيجية بارزة لاكتشاف بروابط تفعيل اليتيم G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs). بداية من فحص الصيدلة العكس هو استنساخ وترنسفكأيشن اللاحقة من النوع من الاختزال من الفائدة في نظام التعبير الخلوية. ثم يتم الطعن في مغاير أعرب مستقبلات مع مكتبة مجمع بروابط مرشح لتحديد يجند تفعيل مستقبلات (ق). يمكن تقييم تفعيل مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني مراسل رسول، مثل الكالسيوم أو المخيم. الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان الموصوفة هنا هو استخداما المتوسطة الإنتاجية عكس الصيدلة الفحص. وأعرب النوع من الاختزال يتيم عابر في الإنسان الجنينية 293T الكلى (HEK293T) خلايا ومنحل Gα 16 بناء يشارك transfected. التالية يجند ملزمة، وتفعيل الوحيدات Gα 16 الحث على الافراج عن و الكالسيومROM الشبكة الإندوبلازمية. قبل الفحص يجند، يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت، فلوو-4 acetoxymethyl. إشارة الفلورسنت من فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة، ولكن يمكن تضخيمها أكثر من 100 أضعاف على التفاعل مع أيونات الكالسيوم التي تم إصدارها بعد تنشيط مستقبلات. لا تتطلب هذه التقنية وصف إنشاء تستغرق وقتا طويلا من خطوط الخلايا ستابلي والتي تتكامل في المادة الوراثية transfected في جينوم الخلية المضيفة. بدلا من ذلك، ترنسفكأيشن عابرة، مؤقتة توليد التعبير عن الجينات المستهدفة، غير كافية لتنفيذ الفحص الفحص. الإعداد يسمح المتوسطة الإنتاجية فحص مئات من المركبات. شارك في ترنسفكأيشن من منحل Gα 16، والتي لمعظم الأزواج GPCRs، بما يسمح للإشارات بين الخلايا مسار إعادة توجيهك نحو إطلاق سراح الكالسيوم، بغض النظر عن مسار الإشارات المحلية في ضبط الذاتيةبالجلسات. الخلايا HEK293T من السهل التعامل معها وأثبتت فعاليتها على مر السنين في مستقبلات المقايسات deorphanization. ومع ذلك، والتحسين للمقايسة لمستقبلات معينة قد تبقى ضرورية.

تم اختبار سلسلة تركيز تتراوح ما بين 50 ميكرومتر إلى 0.001 نانومتر لكل أربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF (دروم-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide، دروم-SNPF-2: SPSLRLRFamide، دروم-SNPF-3: PQRLRWamide، دروم-SNPF-4: PMRLRWamide) على الخلايا التي تعبر عن HEK293T عابر مستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF ومنحل Gα 16 الوحيدات. تم تفعيل GPCR جميع الببتيدات أربعة في تركيزات النهائي حتى 0.1 نانومتر، وكان تنشيط مستقبلات تعتمد على التركيز. يصور الشكل 2 الرسوم البيانية المقابلة إلى واحدة من ثلاث نسخ طبق الأصل من سلسلة تركيز دروم-SNPF-1. فإن السيطرة السلبية (غسل العازلة) لا تحفز على إشارة الفلورسنت، في حين أن السيطرة الايجابية (PAR 1 - 1 ميكرومتر) أثارت التنشيط القوي للمستقبلات الذاتية-1، مما أدى إلى إشارة الفلورسنت عالية (± 30،000 RFU) تنشيط الأنزيم البروتيني. تجدر الإشارة إلى أن انحراف منقد يشير منحنى نموذجي شذوذ. على سبيل المثال، الارتفاع المستمر للمنحنى دون العودة إلى خط الأساس قد تكون ذات صلة إلى إشارات بوساطة غير مستقبلات، مثل وجود ionophores الكالسيوم، أو طبقة ثنائية الدهن تعطلت مما تسبب تسرب الكالسيوم. البرنامج يسمح بإدخال الصيغ لتحديد النسبة المئوية للتفعيل أو أخطاء القياسي من تركيزات مختلفة من بين آخرين. وتستخدم البيانات الناتجة لإنشاء منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية لتقدير قيم EC 50، كما هو موضح لأربعة الببتيدات دروم-SNPF في الشكل 3. تتضمن منحنيات الشكل (3) أيضا بيانات لمراقبة سلبية حيث سلسلة تركيز تم اختبار الببتيدات دروم-SNPF على الخلايا HEK293T transfected مع لpcDNA3.1 ناقلات الفارغة. وتشير النتائج إلى أن إضافة الببتيدات لهذه الخلايا ليس لها أي تأثير على مستقبلات الذاتية، ولكن في الواقع أكتيفأكلت مستقبلات المصالح. ثم كرر فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان ثلاث مرات بشكل مستقل. على أساس منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية من الشاشة الأولي، تم تكييفها على تركيزات اختبار لتغطية مجموعة ديناميكية من منحنى (الشكل 4). القيم EC50 من دروم-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 نانومتر [فاصل الثقة 95٪])، دروم-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 نانومتر)، دروم-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 نانومتر) ودروم-SNPF- 4 (0.50 ± 1.01 نانومتر) متشابهة، مما يشير إلى أنها قوية على قدم المساواة لتنشيط مستقبلات. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> الشكل 2. الرسومية الناتج من البرنامج استجابة مضان بوساطة مستقبلات من سلسلة التركيز. اثنا عشر تركيزات النهائي (تتراوح من 50 ميكرومتر إلى 0.001 نانومتر) سو تم اختبار الببتيد دروم-SNPF-1 على مستقبلات دروم-SNPF. وأعرب عن التنشيط في وحدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم. الرسم البياني العلوي يعطي نتائج أعلى التركيزات ستة والرسم البياني السفلي من أدنى ستة تجمعات. السيطرة الموجب (+) هو PAR 1 (1 ميكرومتر) والتحكم السالب (-) هو غسل العازلة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> الرقم 3. منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية من الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF يحدده القائم على مضان واحد الكالسيوم فحص التعبئة. وتظهر منحنيات التركيز على الاستجابة لمستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF أعرب عابر في الخلايا HEK293T لأربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF باللون الأزرق. لضوابط السلبية (كما هو موضح باللون الأحمر)، تم اختبار الببتيدات على HEK293Tخلايا transfected مع لpcDNA3.1 ناقلات الفارغة. وتظهر الاستجابات الفلورسنت كما النسبي (٪) إلى أعلى قيمة (تفعيل 100٪). المنحنيات هي نتيجة تجربة واحدة التي تم قياس تركيز كل سلسلة من ثلاث نسخ. الأشرطة العمودية تمثل الأخطاء المعياري للمتوسط ​​(SEM)، والتي هي في بعض الأحيان أصغر من الرموز المستخدمة (في هذه الحالة، وصفت إلا رموز). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> الشكل 4. منحنيات التركيز والاستجابة وEC 50 قيم الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF تحددها ثلاثة فحوصات تعبئة الكالسيوم القائم على مضان مستقلة المقابلة. منحنيات استجابة تركيز مستقبلات Drosopihla SNPF أعرب عابر في الخلايا HEK293T لأربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF هي نتيجة ثلاثة لي المستقلةasurements تنفيذ كل في ثلاث نسخ (ن ≥ 9). وتظهر الاستجابات الفلورسنت كما النسبي (٪) إلى أعلى قيمة (تفعيل 100٪). العلامات النجمية تشير تركيزات التي ن ≤ 9. أشرطة الخطأ تشير وزارة شؤون المرأة، والتي هي في بعض الأحيان أصغر من الرموز المستخدمة (في هذه الحالة، وصفت إلا رموز). يتم عرض القيم EC 50 مع فواصل ثقة 95٪.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay at JoVE.com

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

القائم على مضان الكالسيوم مقايسة تعبئة هنا وصف هو عكس الصيدلة نظام الفرز المتوسطة الإنتاجية للتعرف على تفعيل وظيفيا يجند (ق) من الأيتام G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs).

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

characterization-g-protein-coupled-receptors-fluorescence-based

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

39.4K Views.  KU Leuven.  القائم على مضان الكالسيوم مقايسة تعبئة هنا وصف هو عكس الصيدلة نظام الفرز المتوسطة الإنتاجية للتعرف على تفعيل وظيفيا يجند (ق) من الأيتام G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs). 

Video: Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...