The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

Xenopus Oositleri ve cRNA Mikroenjeksiyon 1. Izolasyonu <ol><li> Yetişkin dişi Xenopus laevis&#39;ten oosit elde. % 0.2 MS222 hayvanları uyuşturan, ve küçük bir kesiden karın yumurtalık lobları rezeksiyon. </li><li> Kalsiyumsuz OR2 çözeltisi (Tablo 1 &#39;de tarifi) içinde çözüldü Clostridium histolyticum&#39;dan tip 2 kolajenaz 600-700 U / ml&#39; si ile 3-4 saat boyunca 19 ° C &#39;de enzimatik sindirme ile yumurtalık loblarından alınmış oositleri izole edin. </li><li> Seçimi için, çözelti içeren yüksek sodyum bir mikroskop altında bir Petri tabağına yerleştirin sonra soyuldular oosit (ND96: tarifi tablo 1 &#39;de). </li><li> Evre V-VI oosit seçin ve bir Pasteur pipeti ile başka bir Petri kabı koyun. NOT: Blunt Pasteur pipeti oosit yaralanmayı önlemek için yanan tarafından. </li><li> CRNA (örneğin, 0.2 ng başına αβγENaC alt birim) ile oosit enjekte edilir. RNase-içermeyen su içinde cRNAs çözülür. NOT: Toplamher bir oosite enjekte edilen hacim 46 nl. </li><li> (: Tablo 1 &#39;de tarif ND9) Mağaza oosit sodyum yüklenmesini önlemek için düşük bir sodyum çözeltisi içinde 19 ° C&#39; de oosit enjekte edilir. Bakteri gelişimini önlemek için 100 U / mL sodyum penisilin ve 100 ug / ml streptomisin sülfat ile çözüm Ek. Dikkatlice hasarlı veya ölü oosit miktarını sınırlamak ve cRNA, enjeksiyondan sonra iki gün boyunca banyo çözeltisi ile doldurulmuş bir 12 kuyulu bir levha kuyuları bireysel küçük gruplar halinde muhafaza edilmesi için oosit kolu. </li></ol> 2.. Iki elektrotlu voltaj-kelepçe deneyler <ol><li> Enjeksiyondan iki gün sonra, oosit ölçün. </li><li> ND96 çözeltisi ile bir ağırlık beslenen perfüzyon sistemine ve amilorid (2 uM) ihtiva eden bir çözelti ile ND96 şırınganın bir şırınga doldurun. Dağı 50 cm oosit banyo odasının üstünde şırınga. Not: ENaC inhibitör amilorid konsantrasyonu olan IC50 den 20 kat daha yüksek olduğu için seçildi </sub&gt; (100 nM). </li><li> 150 W halojen soğuk ışık kaynağı açın ve binoküler mikroskop ile iyi görselleştirme izin oosit banyo odasının üstünde 10 cm ayarlayın. Daha sonra emme açmak ve oosit banyo odası sonunda emme borusunu ayarlayın. Tüpler süperfüzyon emme borusu karşısında yerini &#39;adaptör oosit banyo giren. NOT: Emiş gücü oosit superfusing solüsyonun sürekli akışını desteklemek için yeterli olmalıdır. </li><li> Iv yerçekimi akış kontrol cihazı ile 3-5 ml / dak her çözümün süperfüzyon hızını ayarlayın. Oosit banyo odasına bir adaptör ile süperfüzyon tüpleri bağlayın. </li><li> &lt;1 mikron ucu çapı elde etmek bir mikropipet çektirmesi ile cam kılcal damarları çekin. Daha sonra 3 M KCl ile ~ 1/4 için kılcal doldurun. Not: Elektrot tutucunun gümüş telin klorlanmış kısmı KCI çözeltisi içine daldırılmaktadır emin olun. Kılcal ucunda hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Hava kabarcıkları measu zarardirenç sokak kapasitans artırarak rement. </li><li> Mevcut elektrot sahipleri ve gerilim elektrot içine kılcal yerleştirin ve mikro manipülatörler kullanılarak ND96 içeren amilorid (2 uM) çözeltisi içine yerleştirin. </li></ol> Amilorid duyarlı Tüm hücre Akımlar 3. Ölçümü <ol><li> Sıfır m V ve V e ayarlayarak gerilim elektrodunun (V m) ve akım elektrot (V e) &#39;nin, elektrod potansiyeli düğmeleri ofset Not:. Direnç V ve m 0,5 ölçmek için elektrot için 1-2 MQ olmalıdır Mevcut enjeksiyon elektrot için -1 MQ. </li><li> Voltaj algılama elektrotun yakınında banyo odası içine oosit yerleştirin. NOT: Bu transferi adımların herhangi sırasında oosit zarar vermeyin. Oositin aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın. Oosit pipet kenarlarını zarar görmesini önlemek için yanan tarafından köreltilmiş olmalıdır. </li><li> Oo impaleher ikisi de mikro elektrod ile hafifçe cytes. </li><li> -60 MV yükseltecideki tutma potansiyeli ayarlayın ve grafik kaydedici açın. Çözeltisi içeren amilorid (2 uM) açın. NOT: Geçerli yaklaşık 0 ± 0.5 uA olmalıdır. Büyük sızıntı akımları bir sızdıran Impalement göstermektedir. Bu nedenle, bu oosit ret edilmelidir. Ayrıca, amilorid (2 uM) varlığında ölçülen kaçak akımlar αβγ-WT oosit ifade αβγ-mutant ENaC&#39;nın ölçülen kişilerce oosit ifade benzer olmalıdır. Bu mutasyonlar, kanalın Amilorid duyarlılığı etkilemez gösterir. </li><li> Kaydetmeye başlayın. Gerekirse kazancını kontrol etmektedir. </li><li> Ölçülen akım sabit bir düzlüğe ulaştığında, amilorit-serbest çözeltisine değiştirin. Not: Mevcut izleri aşağı akım deplasmanlar içeri doğru akımlar, hücre içine, hücre dışı taraftan pozitif yük, yani hareket (Na +) karşılık gelir. </li><li> AfBir akım plato sonra (~ 60 sn) ulaşıldığında ter, geri amilorit içeren solüsyona Superfusion geçmek. Oositin akım ilk taban akımı ulaştıktan sonra, voltaj kelepçe kapatın ve yavaşça geri elektrotlar. </li><li> , Impalement bölgelerinde de, plazma zarının sızdırmazlığı sağlayan bir proteaz serbest ND96 çözeltisi 100-150 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı plakanın bir oyuğuna oosit yerleştirin. </li><li> 5 dakika sonra, 30 dakikalık bir inkübasyon süresi için çözeltisini ihtiva eden bir proteaz veya proteaz olmayan bir kontrol çözeltiye oosit aktarın. NOT: Kuluçka süresi proteaz ve çalışılan kanal bağlıdır. </li><li> Inkübasyon adım akım ölçümü tekrarlayın sonra (3.2 ve aşağıdaki bakın). NOT: Bu proteaz çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra oosit&gt;% 90 ölçmek mümkündür. </li></ol> 4. Biyotinilasyonu Deneyi <ol><li> Seçmek ve binoküler mikroskop altında kusurlu oosit atın. NOT: enjekte kullanıned akım ölçümleri için ve biyotinilasyon deneyler için aynı partiden oositlerde. </li><li> Deneyde kullanılmadan önce en az 20 dakika boyunca oda sıcaklığında biotin tutun. </li><li> Çözümler hazırlayın: ND96 ve ND96 uygun proteaz içeren. Etiketleyerek ve kısaca oosit yaralanmaları önlemek için kendi ipuçları yanan tarafından Pasteur pipetler hazırlayın. Not: Burada ND96&#39;da proteaz kimotripsin 2 ug / ml kullanılır. Çözümleri çapraz bulaşmayı önlemek için ayrı bir pipet ile her grup tedavi. </li><li> Oda sıcaklığında bir proteaz ihtiva eden 2.5 ml kontrol ND96 ve ND96 ile 6 oyuklu plakanın her doldurun. Daha sonra oyuk başına 30 oosit yatırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. NOT: Sonraki işlemler için her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak önemlidir. Bütün santrifüjleme aşamaları, 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmiştir </li><li> 2.5 ml ND96 (her grup, yıkama adımları için 3 kuyu ihtiyaç) ile yeni bir 6-yuvalı plakanın her doldurun ve biyotin tartın. Not: 2.5 mg biyotin per de (1 mg / ml) gereklidir. 25 ml tampon maddesi biyotinilasyon Tablo 1 &#39;de (tarifi)&#39; de 10 biyotinilasyon tampon grupları (örneğin, 25 mg biyotin () &#39;de biotin çözülür. </li><li> Bir de 2.5 ml ND96&#39;da dolu oositlerin her grup aktarın. Aktarım kalan proteaz yıkayın ND96 ile iki kuyu içine bir sekans oositlerde. ND96 içinde 5 dakika için oosit inkübe edin. </li><li> Iyi olarak ihtiva eden 2.5 ml biyotin çözeltisi içine oosit aktarın ve 15 dakika süre ile hafif bir çalkalama (&#39;çalkalayıcı&#39;) ile inkübe edin. Not: biotin solüsyonu seyreltme önlemek için pipet ile transfer ND96 en aza indirmek. </li><li> Biyotinilasyon reaksiyonu durdurmak için iyi olarak ihtiva eden 2.5 ml soğutma tamponu (Tablo 1 &#39;de tarifi) içine oosit her grup aktarın. Daha sonra, aynı zamanda 2.5 ml tampon söndürmek ve yumuşak çalkalama ile 5 dakika boyunca inkübe içeren ikinci bir kuyuya oosit her grup aktarın. </li><li> Hasarlı veya ölü oosit çıkarın. Not:Aşağıdaki prosedür için grup başına oosit aynı sayıda seçin. </li><li> Bir 1.5 ml plastik bir mikrosantrifüj tüpüne oosit her grup aktarın. NOT: aktarılan söndürme tampon miktarını en aza indirin. </li><li> Daha sonra, proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş (tarifi bkz. Tablo 1) 1 ml liziz tamponunda, bir 27 G iğne içinden geçirilerek lize oosit. </li><li> 1500 x g 10 dakika boyunca lizatları santrifüjleyin. </li><li> Aspire edilen süpernatan ve% 0.5 Triton-X-100 ve% 0.5 NP40 ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer. Kalan pelet atın. Not: Süpernatan biyotinile edilmiş plazma zar proteinleri ve non-biyotinile hücre içi proteinler içerir. </li><li> , Buz üzerinde 20 dakika için bir mikrosantrifüj tüpleri inkübe edin. Tekrar tekrar girdap Bu periyot süresince, tüpler tam NP40 ve Triton-X-100&#39;de proteinleri çözmek için olan. </li><li> 1500 x g de 3 dakika boyunca oosit grup başına agaroz boncuklar santrifüj 100 ul. Sonrasantrifüj boncuklar çözeltiden süpernatant kaldırmak ve tampon ile boncuk denge sağlaması için lizis tamponuyla üç kez yıkayın. </li><li> Boncuklara biyotinile protein bağlanmasına olanak sağlamak üzere 4,13 &#39;de hazırlanan protein-deterjan çözeltisini ihtiva eden her bir mikrosantrifüj tüpü içine yıkandı, tanelerin Pipet 100 ul. </li><li> 4 ° C&#39;de genel dönme O / N mikrosantrifüj tüpleri inkübe </li><li> 1500 x g de 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra, yeni bir tüp içine süpernatant aktarın. NOT: Hücre içi protein biotin ile etiketlenmiş değildir. Üst faz, -20 ° C&#39;de saklanabilir Boncuk aspire etmeyin. </li></ol> Western Blot Analizi ile hücre yüzeyinde ENaC Cleavage Parçalarının 5. Algılama <ol><li> Liziz tamponu ile boncuk üç kez yıkayın ve 2x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde 100 ul ilave edin. Not: Numuneler -20 ° C&#39;de saklanır ya da hemen western blot analizi için hazırlanabilir. </li><li> Çıban s5 95 ° C&#39;de dakika ve daha sonra buz üzerinde yer borular depas&#39;lar. </li><li> 3 dakika 20,000 xg&#39;de ve yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatan pipetle santrifüj örnekleri. NOT: Bu yüzer oositin hücre yüzeyinden biyotinile edilmiş plazma zan proteinleri içerir. </li><li> Hücre yüzeyinde yarılma fragmanlarının araştırmak için western blot ile bu süpernatan 30 ul analiz eder. </li><li> Uygun bir jel (% 8,% 10,% 12 incelenmiştir yarılma fragmanlarının moleküler ağırlığına bağlı olarak) kullanılarak SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile biyotinile edilmiş proteinleri ayırın. </li><li> Yarı kuru blotting ile poliviniliden difluorür (PVDF) membran proteinleri için aktarın. </li><li> (Şekil 3 ve 13) C-terminalindeki bir epitopa karşı yönlendirilen insan γENaC karşı spesifik bir antikor ile membran kontrol edin. </li><li> İkinci olarak anti-yaban turpu peroksidaz etiketli keçi anti-tavşan antikoru kullanarakvücut. </li><li> Kemilüminesan sinyalleri algılar. </li></ol>

<ol>
	<li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENaC+at+the+cutting+edge:+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases.">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li><li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+serine+proteases.">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li><li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases.">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li><li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating.">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li><li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase.">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li><li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-activated+receptors:+contribution+to+physiology+and+disease.">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li><li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+&#946;-subunit.">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin &#946;-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li><li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S.">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li><li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes.">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li><li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+epithelial+Na++channels+by+cleaving+the+&#947;-subunit.">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the &#947;-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li><li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel.">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li><li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel.">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li><li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+&#947;-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel.">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the &#947;-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li><li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li><li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Na++removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na+-channel+(ENaC)+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval.">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yazıda başarılı bir proteaz ile ENaC&#39;nın aktivasyonunu altında yatan mekanizmaları incelemek için uygulanan bir metodolojik 8,13 yaklaşım tarif edilmektedir. Iyi kurulmuş Xenopus laevis oosit ekspresyon sistemi işlevsel olarak ifade ENaC için kullanılmıştır. ENaC işlevi geleneksel iki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği ile değerlendirildi. Yer yönlendirmeli mutagenez, işlevsel olarak ilgili bir proteaz bölünme mevkilerini belirlemek için kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümlerle paralel olarak gerçekleştirilen deneyler Biyotinilasyon mümkün ENaC&#39;nın görünümünü mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ilişkilendirmek için yapılmıştır. Mevcut aktivasyon zaman süreci ve hücre yüzeyinde proteolitik yarılma fragmanlarının görünüşü arasında bir korelasyon proteolitik kanal aktivasyon kavramını desteklemektedir. Iki elektrotlu voltaj-kelepçe kayıtları, bir O Impalement gerektirirİki mikro elektrod ile ocyte. Bu prosedür genellikle bireysel bir oosit içinde sadece bir kez yapılır. Bununla birlikte, oosit için aşikar zarar vermeden bir ilk bütün hücre mevcut kaydın sonra Mikroelektronlar kaldırmak mümkün oldu. Gerçekten de, impalements bölgelerinde de plazma membranı, bir kaç dakika içinde yeniden mühürlemek için görüntülenir. Bu durumda, bir ilk iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü tamamladıktan sonra, bir mikrofüj tüpüne ya da dolu bir 96-yuvalı plakanın bir oyuğuna iki elektrotlu voltaj-kelepçe kurulum deney akış odasından oositin aktarmak mümkündür test veya kontrol solüsyonunun bir küçük hacimli. Daha sonra, aynı oosit akış odasının geri aktarılabilir ve bir ikinci iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü gerçekleştirmek için tekrar kazığa edilebilir. Dikkate değer, ENaC-aracılıklı akımları oosit kontrol çözelti içinde muhafaza edilmiştir, birinci ve ikinci ölçüm arasında çok farklılık yoktu. Bir proteaz içeren bir Sol oositin kontrastı, kuluçkalandırmaİlk ölçümden sonra, ution ikinci ölçümde artan ENaC aracılı akımı (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. Bu bulgu, proteolitik kanal aktivasyonunu gösterir. Tek bir oosit olarak iki ayrı akım ölçümleri gerçekleştirilmesi oosit test çözeltisi, küçük bir hacim içinde değişken bir zaman süresi için iki ölçüm arasında, proteazlar ya da diğer farmakolojik ajanlar maruz avantajını sunar. Büyük miktarlarda pahalı ve / veya kullanılamaz ajanlar, örneğin saflaştırılmış proteaz preparatlar kullanılırken bu önemlidir. Ajanların sınırlı durumu nedeniyle sürekli dakikada birkaç mililitre debilerde oosit superfusing için gerekli test solüsyonu geniş hacimli imkansız (ya da satın alınacak) sürekli iki elektrot gerilim-kelepçe kayıtları bunları kullanmak için yapabilir. Ayrıca, sürekli iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümleri bilinen fenomeni ile sınırlıdırspontan kanal kestirip Bu fenomene de ENaC&#39;nın 15 nitelendirdi. Buna karşılık, bir saat ya da daha fazlasına kadar için iki ayrı ölçümler arasındaki çözüm test etmek için oosit maruz değil genel olarak (bkz, Şekil 4A) bir sorun teşkil etmez. Son olarak, aynı oosit içinde yapılan iki ardışık ölçüm ilaç etkileri eşleştirilmiş gözlemler sağlar. Genellikle iyon kanalı bir ifadesinde, oositler, arasında yüksek değişkenlik sorununu azaltır, çünkü bu, oosit (proteaz ile muamele edilmiş ve araç ile tedavi edilmiş) iki ayrı gruplarından eşleştirilmemiş ölçümleri üzerinde bir avantaja sahiptir. Eşleştirilmiş gözlem ve ilk ölçüm verileri normalleştirmek için olasılığı ile, daha az sayıda oositler bir farmakolojik maddenin önemli bir etki göstermek için deney grubu başına ihtiyaç vardır. Verilerin Normalleştirme da bunun için farklı iyon kanalı ifade seviyeleri ve bu nedenle, farklı taban akımı (Şekil 2D, gametlerin, farklı gruplar verilerini özetleyen kolaylaştırır.) Bu yaklaşım, ilgi konusu iyon kanalı faaliyet (bkz. Şekil 2) ikinci bir ölçüm için birinci araç ile tedavi edilen kontrol oositlerde sabit kalır olduğunu göstermek için Açıkçası, kontrol deneyleri gereklidir. Mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ENaC&#39;nın görünümü ile karşılıklı ilişki içinde olduğunu göstermek için, biyotinilasyon yaklaşım, ilk Harris et al. 9 kullanılabilir. Bu prosedür, (Protokol bölümünde ayrıntılı olarak ve Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi) ve proteaz ENaC-aracılı aktivasyonu daha sonra akımlarının ayrılması parçalarının zamana bağımlı bir görünüm ile paralel olduğu kanalları bu maruz göstermek için uyarlanmıştır. Biyotinilasyon yöntem de hücre yüzeyinde genel bir artış ya da azalma zar proteinlerinin analizini sağlar. Bu nedenle bu yöntem, proteazlar ve diğer Phar etkisini araştırmak için uygundurplazma zarı içine veya kanal alma üzerine kanal ekleme üzerine macological ajanlar. Ayrıca, biyotinile edilmiş plazma zar proteinlerinin western blot analizi sağlar: protein fragmanları (örneğin, proteolitik ENaC fragmanları) ya da işlevsel olarak ilgili olabilir glikosilasyon deseni değişikliklerin tespiti. Sonuç olarak, yöntemlerin kombinasyonu ENaC aracılı bütün hücre akımları üzerinde proteazların uyarıcı etkisini araştırmak ve geniş bir uygulama yelpazesi için yararlı olabilir ENaC&#39;nın meydana gelmesi ile bir korelasyon hücre yüzeyinde ürün bölünmeye göstermek için kullanılır. Özel olarak, bu yöntemler, başka iyon kanalları, taşıyıcı ya da zar-ötesi reseptör (örneğin, proteaz tarafından aktive edilen reseptörleri PAR) düzenlemesi ile ilgili olarak benzer soruları için uygun olabilir.

Proteazlar, karmaşık bir düzenleyici sinyal yollarıyla ilgili son derece gelişmiş proteaz cascades, sindirim bağlamında, proteinlerin bilinen proteolitik bozulması kadar çeşitli fizyolojik reaksiyonların katılan enzimlerdir. Proteazlar katalitik aktif sitesine göre, yedi gruba ayrılır: aspartat, asparagin, sistein, glutamik asit, metalo, serin, treonin ve proteazlardır. Farklı proteazlar, her bir proteinin birincil yapısı tahmin etmek kolay değildir ayrı bölünme mevkilerini hedef. MEROPS veritabanı ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) Proteazlarla ve tercihli bölünme sitelerinin geniş bir yelpazede ayrıntılı bilgi sağlar. Fonksiyonel olarak, ilgili bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutagenez kullanılarak tespit edilebilir. İyi ENaC&#39;nın proteolitik işleme th aktivasyonu önemli bir mekanizmadır olduğu saptanmıştırÖzellikle iyon kanalı 1,2 olduğunu. İlginç bir şekilde, ilgili aside duyarlı iyon kanalı 1a (ASIC1a) fonksiyonu da proteazlar 3-5 ile modifiye edilebilir ki bir kanıt yoktur. Şu anda bu proteolitik kanal bölünme diğer iyon kanalları ya da taşıyıcıları aktivitesini düzenleyen bir ilgili fizyolojik bir rolü olup olmadığını açık bir soru kalır. Bununla birlikte, iyi proteolitik bölünme G-protein bağlı reseptörler, proteaz tarafından aktive edilen reseptör (PAR) bir grup aktive olduğu saptanmıştır 6. Çeşitli serin proteazları (örneğin, kanal aktive edici proteazların (cap1-3), kimotripsin, tripsin, furin, plasmin, nötrofil elastaz ve kallikrein) proteolitik ENaC 2 etkinleştirmek için gösterilmiştir. Serin proteazlara ilave olarak, proteaz diğer gruplar proteolitik ENaC aktivasyonu dahil olabilir. Gerçekten de, son veriler göstermektedir ki metaloproteinaz meprin-β 7 ve sistein proteaz, katepsin S-8 Ayrıca, Activate ENaC. Bununla birlikte, aktivasyon için ENaC (pato-) fizyolojik olarak uygun proteazlar, belirlenecek kalır ve dokuya dokudan farklı olabilir. Proteazlar, tercihen, amino asit sekansında belirli bölgelerindeki parçalamak için bilinir. Örneğin, serin proteaz kimotripsin, aromatik amino asit, fenilalanin ve tirozin kalıntıları sonra yaran belirli bir yarılma modelini göstermektedir. Temel kalıntılar, lisin ya da arginin sonra aksine, serin proteaz tripsin tercihli olarak böler. , Alana-yönelik mutagenez ile üretilen mutasyona uğramış insan γENaC yapıları kullanılarak, heterolog oosit ekspresyon sistemi içinde eksprese ENaC&#39;nın işlevsel olarak ilgili bölünme mevkilerinin 8-13 tespit edilebilir. Izole oositlerine ENaC üç birimden (αβγ) için cRNA ile enjekte, ENaC işlevsel olarak bu hücrelerde ifade edilebilir ve plazma membranında mevcut kanallarının aktivitesi ile ölçülebiliriki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği kullanılarak üretilebilir. Diüretik amilorit, belirli bir ENaC inhibitörü, amiloride duyarlı ENaC aracılı bütün hücre akımı bileşen (ΔI ami) kullanılarak spesifik olmayan kaçak akımlar ya da başka iyon kanalları tarafından yürütülen akımlarından ayrılabilir. Bu nedenle, ΔI ami değerler genel ENaC aktivitesini yansıtır ve amilorid yokluğunda kaydedilen ilgili bütün hücre akımlardan amilorid varlığında ölçülen bütün hücre akımları çıkarılması ile tespit edilebilir. Bir proteaz ENaC&#39;nın üzerinde uyarıcı bir etkiye sahip olup olmadığını test etmek için, ΔI ami yani önce ve bir proteaz içeren bir çözelti içinde, oositin inkübasyonundan sonra, aynı oosit iki kez ölçülür. Ikinci ölçüm birinci ΔI ami bir artış proteolitik ENaC aktivasyonunu gösterir. Kimotripsin ne de tripsin maksimum oosit ekspresyon sistemi içinde 2,14 ENaC uyarmak için bilinmektedir ve emin olmalarına kullanılabilirrm proteolitik harekete geçirme ENaC oosit belirli bir yığını olarak tespit edilebilir. Bütün hücre akım ölçümleri paralel olarak, biyotinilasyon yaklaşım 9 ENaC&#39;nın görünümü ile ilişkilidir hücre yüzeyinde fragmanları bölünmeye ΔI ami artış proteazlara maruz kaldığında oosit tespit olup olmadığını araştırmak için kullanıldı. Hücre yüzeyindeki proteinler biotin ile etiketlendi ve Neutravidin etiketli agaroz tanelerine biyotinile edilmiş proteinlerin bağlanması ile hücre içi proteinlerin ayrılabilir. Biyotinlenmiş proteinler western blot ile analiz edilebilir. Hücre yüzeyinde γENaC bölünme fragmanları, γENaC C-terminalinde bir epitopa karşı yönlendirilen özel bir antikor kullanılarak tespit edilebilir. Işlevsel olarak ilgili bölünme sitesi (ler) i tespit etmek için, bölünme mevkilerinin yer yönelimli mutagenez kullanılarak mutasyona uğratılabilir öngördü. Vahşi tipli ve mutant kanalları s den oosit kullanılarak paralel deneyler ile karşılaştırılırame toplu. Bu metodolojik yaklaşım sayesinde ENaC aracılı bütün hücre akımların proteolitik harekete geçirme hücre yüzeyinde fragmanlarının bölünmeye ENaC&#39;nın zamana bağımlı bir görünüm ile ilişkili olduğunu ilk kez gösterilmiştir. Bu sonuçlar kanal bölünme ve kanal aktivasyonu arasında nedensel bir bağlantı olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, iki-elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği, plazmin için, fonksiyonel olarak bağlantılı yarılma siteleri, 13, Kimotripsin ve katepsin S-8 ile birlikte varsayılan yarılma siteleri yer yönelimli mutagenez kullanılarak tespit edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Serin proteaz plazmin ENaC aracılıklı akımları aktif olup olmadığını araştırmak için, tek tek ENaC ifade eden oositlerin ΔI ami proteaz içermeyen (kontrol) &#39;de oosit 30 dakika süreyle kuluçkalamadan (Şekil 2A) ya da plazmin içeren çözelti (Şekil önce ve sonra belirlendi 2B) iki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği (bkz. Şekil 1) kullanılarak. Plazmine maruz ölçülen her oosite ΔI Ami artmıştır. Bunun aksine, kontrol deneylerinde, proteaz içermeyen solüsyon içinde ENaC-eksprese eden oositlere 30 dakika inkübasyon önemsiz bir etkiye sahiptir (Şekil 2, C, D) vardı. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak plazmin ile ENaC aracılı akımının bir uyarım tespit edilebilir. ENaC aracılı akımları aktivasyonu, hem de üzerine, varsayılan bölünme mevkilerini mutasyonlannın etkilerini incelemek için bir kanal bölünme üzerine, WT-ENaC&#39;nın on kimotripsin etkisi bu konuda karşılaştırılmıştırmutasyona uğramış prostasin ve plazmin yarılma bölgeleri olan bir mutant ENaC (γ RKRK178AAAA, K189A). Kanal kimotripsin ile aktivasyonu hem de ENaC&#39;nın görünümünü hücre yüzeyinde ürün parçalanmasının zaman süreci farklı proteaz inkübasyon sürelerini (Şekil 4A) kullanılarak araştırılmıştır. Bu mutant kanal gecikmeleri ve kimotripsin ile ENaC aracılı akımının aktivasyonunu azalttığı gösterilmiştir. Bu, tam olarak bölünmüş alt birimine karşılık gelen 67 kDa bir molekül ağırlığı düşük γENaC bölünme fragmanının geciktirilmiş bir görünüm ile paraleldir. Bölünme fragmanları, C-terminalindeki bir epitop (Şekil 3) karşı yönlendirilmiş bir γENaC antikor kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, metodolojik ENaC aracılı akımların proteolitik aktivasyon zaman süreci, hücre yüzeyinde bir 67 kDa γENaC bölünme ürününün görünümü (Şekil 4, B, C) ​​ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu, kavramını desteklemektedirproteolitik kanal bölünme ve kanal aktivasyonu 13 arasında nedensel bir bağlantı. Ayrıca, hücre yüzeyinde akım ölçümleri ve γENaC fragmanların tespiti birleştirerek bu mutasyona uğramış proteolitik bölünme mevkilerinin kanal aktivasyonu için, fonksiyonel olarak bağlantılı olduğu gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade ENaC&#39;nın bir proteazın uyarıcı etkisini belirlemek Prosedür laevis oositleri. ENaC aktivitesi Amilorid duyarlı bütün hücre akım bileşeni ΔI ami ölçülmesiyle tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Şekil 2,. Plazmin ENaC aracılı para birim uyarırENaC eksprese eden oositlerde ts. İnsan ENaC ifade (AD) Oositler bir proteaz içermeyen çözeltisi (kontrol) ya da plazmin (10 ug / ml) ihtiva eden çözelti içinde 30 dakika için kuluçkalanmıştır. (-) Daha önce ΔI ami belirlemek ve sonra (+) inkübasyon, oositler -60 mV tutma potansiyeline kadar sıkıştırıldı (A, B) oosit bir yığınından temsilci dört tam hücre akımı izler.. Amilorid (ami), siyah çubuklar ile belirtildiği gibi, özellikle ENaC inhibe etmek için banyo çözeltisi mevcuttu. (C) tek bir oosit elde edilen veri noktaları, bir çizgi ile birbirine bağlanmıştır. (D) &#39;e benzer deneylerin özeti C. Kolon gösterildiği gibi temsil ΔI ami göreli uyarıcı etkisi inkübasyon önce ölçülen ilk ΔI ami (ΔI ami başlangıç) için bir 30 dakika inkübasyon (ΔI ami 30 dakika) sonra ölçülen ΔI ami oranı olarak hesaplanır. Kolonların içindeki Numaraları gösterirölçülen ayrı oosit sayısı. K oosit farklı kısımlarının sayısını göstermektedir. (Bu rakam modifiye edilmiştir [Haerteis ve ark 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> Kanal plazma zarı ulaşmadan önce Golgi ilişkili dönüştürücü furin tarafından proteolitik aktivasyon ve kullanılan antikorun bağlanma yeri için γENaC alt birim gösteren yarılma siteleri Şekil 3.. Modeli. Proteolitik bölünme biyosentetik yolda ENaC olgunlaşması için önemlidir. 76 kDa fragmanının furin klevaj ile γ-alt-biriminin C-termininde bir epitopa karşı bir biyotinilasyon yaklaşımı ve bir antikor kullanılan hücre yüzeyinde tespit edilebilir sonra. Proteolitik EN önemli son adımaC muhtemelen aktivasyon γENaC bir 67 kDa bölünme fragmanının sonuçlanan furin sitesi için bir bölge distal hücre dışı proteazlar (örneğin plasmin veya kimotripsin) ile bölünmektedir plazma membranında gerçekleşir. (Bu rakam modifiye edilmiştir [Haerteis ve ark 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Şekil 4," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Şekil 4:. Plazmin (K189) ile prostasin bölünme sitesini (RKRK178) her iki mutasyonu ENaC aracılıklı akımları aktivasyonunu ve kanal γ-alt-birimi ve bir 67-kDa ayrışma ürünün görünümünü geciktiren Oositler WT sentezleyen (açık semboller) ve γ RKRK178AAAA; K189A ENaC mutant kanal (kapalı semboller) proteaz içermeyen çözeltisine (kontrol) içinde 30 dakika boyunca ya da 5, 3 için kuluçkalanmıştırKimotripsin (2 ug / ml) ihtiva eden bir çözelti içerisinde 0, ya da 60 dakika. (A) kuluçka öncesi ve sonrası ΔI ami belirlemek için, oosit -60 mV tutma potansiyeline kadar sıkıştırıldı. Daireler inkübasyondan önce ölçülen başlangıçtaki ΔI ami (ΔI ami hemen) için 5 sonra ölçülen ΔI AMI oranına, 30 ya da 60 dakika inkübasyon (ΔI ami dakika) temsil eder. Her bir veri noktası dört farklı partilerin 22-24 ayrı oosit ölçülen ortalama ΔI ami temsil eder. (BD) ΔI ami, hücre yüzeyinde biyotinile γENaC ekspresyonu, SDS-PAGE ile analiz edilmiştir deteksiyonuna paralel olarak. γENaC insan γENaC C-terminalinde bir epitopa karşı bir antikor ile tespit edilmiştir. Her bir şerit için, B ya da D&#39;de gösterilenlere benzer üç western blotlar, s oosit bir toplu işletmeye Örnek western blotlar gösterilmiştir. (CE) densitometrik analizi76 kD (açık sütunlar) ve 67 kD (gri sütun) bölgelerinde tespit ignals belirlenmiş ve bulgulanan toplam sinyalin toplamına göre normalize edilmiştir. N oosit farklı kısımlarının sayısını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments at JoVE.c

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade epitelyal sodyum kanal (ENaC) proteolitik aktivasyon oosit hücre yüzeyinde iyon kanal bölünme ürünlerinin görünümünü araştırmak için bir biyotinilasyon yaklaşımla akım ölçümleri birleştirerek gösterilebilir laevis. Fonksiyonel olarak önemli bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak tespit edilebilir.

Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K Görüntüleme.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade epitelyal sodyum kanal (ENaC) proteolitik aktivasyon oosit hücre yüzeyinde iyon kanal bölünme ürünlerinin görünümünü araştırmak için bir biyotinilasyon yaklaşımla akım ölçümleri birleştirerek gösterilebilir laevis. Fonksiyonel olarak önemli bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak tespit edilebilir. 

Video: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

CD1d glikolipid Antijen Tanıtım ve NKT hücre Etkinleştirme Terapötik Potansiyeli: Röportaj

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Biyoloji

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Gösterme Deri allodini Kronik Pelvik Ağrı Derneği

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...