Bu çalışma, Sağlık (GM070736) National Institutes of H. Fölsch bir hibe ile finanse edildi. SF Ang A * STAR Lisansüstü bursu tarafından desteklenen ve RS Kang Hücresel ve Moleküler Temelleri (GM8061) Hastalığı Eğitim Programı tarafından desteklenen

1. Plazmid DNA İzolasyonu <ol><li> Üreticinin protokole göre endotoksin DNA hazırlamak için Sigma-Aldrich endotoksin maxiprep kiti kullanın. Bu kit, güvenilir bir şekilde herhangi bir DNA hazırlıkları endotoksin kaldırır, çünkü bizim için çalışır. DNA hücre çekirdeklerinin içine enjekte edilir endotoksin, hücre ölümüne yol açacaktır. </li><li> Izole edilmiş DNA, girdap ve bir Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 devirde 1 dakika için spin ul 100 fenol / chlorofom / izoamilalkol (25:24:1) ekleyin. Suyun üst faz yeni bir tüpe transfer ve 100 ul kloroform / izoamilalkol (24:1), yukarıdaki gibi vorteks ve spin ekleyin. DNA içeren yeni bir tüpe suyun üst faz transfer. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne tıkanmasını önler DNA, herhangi bir protein kaldırmak için gereklidir. </li><li> Na asetat (pH 6.0) eklenerek nihai konsantrasyonu 300 mM ve 2 X vol% 100 etanol DNA çöktürün. Gecede -20 ° C&#39;de inkübe edin. Eppendorf mikrosantrifüj 13.000 rpm&#39;de 20 dakika için DNA Spin,% 70 etanol ile bir kez yıkayın ve 300 ul endotoksin ücretsiz su (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> DNA konsantrasyonu belirleyin. Tipik bir DNA konsantrasyonu, 1 ila 5 mg / ml arasında değişmektedir. </li></ol> 2. MDCK Hücreler Kültür <ol><li> Split MDCK hücreleri. Net 12 mm transwell filtreleri (0.4 mikron gözenek boyutu, Corning Costar, 3460) üzerine X 10 5 hücre hücre ve tohum 4 Sayımı. Mock-enjeksiyon kontrolü ve üç filtreler tohum gereken iki farklı mutant Rab proteinleri içeren bir deneme için. </li><li> 2 mM L-glutamin, 37 az 0.1 mg / ml penisilin / streptomisin ve% 7 (hacim / hacim) fetal sığır serumu (= MEM büyüme ortamı) ° C ve% 5 CO 2 ile MEM orta Kültür MDCK hücreleri </li><li> Her gün bazolateral odasında ortam değiştirin. Hayvanlarda epitel hücrelerinin durumu taklit eder, çünkü bu kutuplaşma sürecinde yardımcı olur. </li><li> 2 gün kapalı bir tek tabakalı hücrelerin büyüyen olup olmadığını mikroskop tohumlama sonrası kontrol. Tek tabaka herhangi bir delik tespit edemiyorsanız, 3. günde deney gerçekleştirmek. Delikleri hala varsa, günde 4 deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon Usul ve Post-enjeksiyon inkübatörü <ol><li> Deney günü 39 ° C inkübatör içine 5 ml MEM büyüme ortamı artı her filtre ve yer için bir 60 x 15 mm plakası 50 mM HEPES hazırlar. Buna ek olarak, 1 ml MEM büyüme medya artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz başına filtresi ve 31 ° C inkübatör içine yer 12 plaka iyi biri. </li><li> Mikroenjeksiyon mikroskop açın ve 39 ısıtmalı sahne ° C Isıtılmış bir sahne ile inverted mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), 10X ve 32X hedefleri ve Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2) kullanın. Son olarak, nitrojen ile hava masa malzemeleri nitrojen gazı tankının açın. </li><li> 100 ul - 10 toplam hacmi 0.2 mg / ml bir final konsantrasyon filtrelenmiş su (0.2 mikron filtre kullanın) ile DNA seyreltilir. Daha sonra, 30 dakika 13.000 rpm&#39;de Eppendorf mikrosantrifüj DNA döndürün. Yeni bir tüp içinde üst kısmında yer ve çıkarın. Bu adım, mikroenjeksiyon iğne içine seyreltilmiş DNA yüklediğinizde doğru &quot;temiz&quot; DNA yükleyebilirsiniz sigortalanır. DNA şimdi mikroenjeksiyon için hazırdır. </li><li> Kültürü yemeğin ilk filtre yaptırmayı hücreleri hazırlayın. Bir cerrahi bıçağı (Feather Cerrahi Bıçak, paslanmaz çelik, No 11), 5 ml, 39 ° C sıcak MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES (60 x 15 mm plaka) içine filtre filtre tutucu ve yerden kesilmiş. Kültür plaka filtre aşağı kesmek için kullanılan cerrahi bıçak ile tartılır. Cerrahi bıçak delik filtre ortasında çevreleyen, filtre gibi yerleştirin. Mikroskobun ısıtılmış sahneye kültür plakasına yerleştirin. </li><li> Mikroenjeksiyon iğnesi (Femtotip II, Eppendorf, 930.000.043) içine seyreltilmiş DNA (Bu durumda plazmid kodlama VSVGts045-GFP = sahte enjeksiyon kontrolü) 2-3 ul Yük, iğnenin koruyucu kapağını büküm ve yere düşürdüm . Şimdi iğne onun sahibinin vidalanan hazır. Bunu yapmak için, sizin InjectMan menü tuşuna basın ve vana kapatıldı olduğundan emin olun. Vida, iğne yuvasına doğru kırılmaya neden olabileceğinden çok sıkı iğne vida sakının. Şimdi, tekrar menü tuşuna basın, uygulanan P c microinjeciton işlemi sırasında iğne içine çekilmesine engel medya önleyecektir. Son olarak, saklanan homing silmek için joystick&#39;e dokunun. </li><li> Hücreleri üzerine iğne düşürmek için, 10X objektif kullanımı ve sıvı üzerindeki ışık demeti içine iğne getirmek. Şimdi hücreler, yine odak odak tekerleği 180 dönüm ° getirmek odaklama ve iğne bulmak. Daha sonra, yavaş yavaş (hücrelerin yeniden odak noktası haline getirmeye yönelik çalışma) odak tekrar ortaya çıkarmak, sonra odak noktası haline iğne taşımak için, içine iğne aşağı getirmektekrar cus. Iğne medya yüzeyine temas edene kadar tekrarlayın göreceksiniz, bu noktada bir hale. Hücreleri odakta olduğu bir noktaya ulaşabilir, ama iğne (odak düzlemli yani) 32X objektif ve ince kaba ayarları değiştirmek hala bulanık. </li><li> Apikal membran iğne ucu ile dokunarak ve yaklaşık olarak 10 mikron çekirdekleri çıkartılarak apikal membran altındaki yaklaşık 10 mm döşeme z-limit ayarlayın. </li><li> Z-limit ayarladıktan sonra, sağ enjeksiyon basıncı bulabilirsiniz. 95 PSI başlayın. Basıncı çok yüksek ise, hücre darbe olacaktır. Basıncı çok düşükse, kalan bir beyaz nokta göreceksiniz, ama başka hiçbir şey olmuyor. Başarılı bir enjeksiyon ile, bir hücre boyutu değişiklik olmadan bir faz değişimi göreceksiniz. Enjeksiyon için, mümkün olduğunca hızlı odak düzlemli iğne birkaç mikron çıkarmak. Çekirdeğin üzerinde iğne (yani bireysel bir hücrenin ortasında) ve joystick enjeksiyon düğmesine basın Amaç, ama düğmesini basılı tutmayın. </li><li> Hücreleri üzerinde yatıyor cerrahi bıçak delik içinde 100-500 hücreleri enjekte edilir. İşiniz bittiğinde, 2 saat için 39 ° C inkübatör içine kültür çanağı ve cerrahi bıçak ve inkübe hücrelerin Bu süre zarfında, VSVGts045-GFP ifade edilir ve ER salınır. Ancak, 39 ° C, VSVGts045 GFP doğru katlayın edemez ve böylece ER terk edemez. Bu arada, faiz küçük GTPaz ko-enjeksiyon deneyleri sitoplazmada birikir. </li><li> 31 ° C&#39;de 2 saat, 2 saat sonra, 12 plaka ve inkübe 1 ml MEM büyüme ortamı artı 50 mM HEPES ve 0.1 mg / ml Siklohekzimidsiz içine hücreleri yerde Bu kovalamaca dönemde, VSVGts045-GFP, doğru katlayın ER bırakın ve hücre yüzeyine teslim edilir. </li><li> (Plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13Q67L V5-etiketli) filtreleri iki (plazmid kodlama VSVGts045-GFP enjekte örneğin Rab13T22N V5-etiketli) ve üç adımları 3.1 - 3.10 tekrarlayın. Her enjeksiyondan yaklaşık 20 - 60 dakika sürecektir. Bununla birlikte, hücrelerin düzeltmek kadar bu sıcaklık değişimi inkubasyon ve yüzey boyama boyunca her filtre aynı şekilde tedavi etmek için kesinlikle çok önemlidir. Fiksasyon sonra, boyama protokol aynı zamanda tüm filtreler geri kalanı yapabilir. </li></ol> 4. Yüzey Boyama İmmünofloresan Analizi Not VSVGts045-GFP, GFP sinyali beyazlatma önlemek için, sonraki tüm işlemleri sırasında alüminyum folyo ile kaplayarak ışığı örneklerin korumak. <ol><li> Yüzey boyama yapmak istiyorsanız, buz üzerinde metal bir plaka üzerine bir kültür çanak hücrelerinin yeri ve buz PBS 2 + (PBS [0,2 g / L KCl, 0.2 g / L KH 2 PO 4 ile 1X hücreleri yıkayın 8 g / L NaCl ve 2.17 g / L Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] artı 0.1 g / L CaCl 2 ve 0,1 g / L MgCl 2 x 6 H 2 O). Daha sonra, yer, bu durumda protein ectodomain tanıyan bir antikor 30 ul fare monoklonal antikor TK1 (IgG 1, geç Thomas Kreis elde edilen), buz üzerinde metal plaka üzerine yerleştirilir temiz parafilm üzerine. Hücreleri ile filtre baş aşağı düşüş üzerine yerleştirin ve arka filtre üzerine antikor birkaç damla damlatılır. 1 saat buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 12 plaka içine yerleştirin hücreleri, 3X buz PBS 2 ile yıkama + (veya RT sıcak PBS 2 + önceki yüzeyi boyama hariç) ve RT 15 dakika için% 3 paraformaldehid ile düzeltmek. </li><li> PBS 2 + ile bir kez hücreleri yıkayın ve PBS 2 + 5 dakika bekletin. </li><li> / Permeabilization tampon (BPB) (% 2 [ağırlık / hacim] BSA,% 0.4 [wt / vol] PBS 2 saponin +)% 10 hacim / hacim] keçi serumu engelleme hücreleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bu örnekte BPB&#39;deki anti-V5 (fare monoklonal antikor IgG 2a, Invitrogen), 1:200, ifade Rab GTPaz algılamak için primer antikor sulandırınız. 13.000 rpm&#39;de 10 dakika için bir Eppendorf mikrosantrifüj seyreltilmiş antikorlar dönerler. Yeri 30 ul temiz parafilm antikor çözüm ıslak bir odasına yerleştirdi. Filtre hücreleri antikor düşüşü üzerine baş aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 12 plaka ve 5X RT BPB ile 30 dakika boyunca yıkayın geri yerleştirin hücreleri (sağ tarafında yukarı). </li><li> Bu durumda, keçi anti-fare IgG 1 Alexa (yüzeyinde tespiti VSVG için, Invitrogen) 594 etiketli ve Cy5 etiketli sekonder antikor Bu örnekte keçi, Rab GTPaz tanımak için anti-fare IgG 2a, uygun ikincil antikorlar sulandırınız BPB içine 1:200, (Jackson ImmunoResearch) Cy5, etiketli ve yukarıdaki gibi döndürün. Filtre baş aşağı antikor düşüşü üzerine ıslak bir oda ve yer hücreleri temiz parafilm üzerine koyun 30 ul antikor çözüm. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 4.6 adımı tekrarlayın. </li><li> Deiyonize su ve yer r içine 3X filtre Dip hücreleriLamlar üzerine ight yüzü yukarı. 10-15 ul montaj (% 10 distile su [wt / vol] DABCO,% 50 ağırlık / hacim] gliserol) hücrelerin üstüne ekleyin. Üst ve kutu mendil kullanarak yerleştirin 18x18 mm mikro cam kapak hücreleri hafifçe üzerine mikro cam kapak tuşuna basın. Seal ile oje. </li><li> Konfokal bir mikroskop ile örneklerin analiz edin. Biz 63X suya daldırma lens ile donatılmış bir Microsystems&#39;ın EKK 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. Kullandı. </li><li> Rakamlar hazırlanması için, ayarlamak ve Adobe Photoshop ve Adobe Illustrator gibi programları kullanarak görüntüleri birleştirmek. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Küçük GTPases eş ifade sıralama VSVG müdahale nasıl örnekler için nazik apikal missorting 3, 4 veya 7 yüzey teslim inhibisyonu ya da yayınlanan makalelere bakın. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Mock-enjeksiyon, yüzey boyama (kırmızı, Şekil 1 A) tarafından değerlendirilecek gibi, sadece plazmid kodlama VSVGts045 GFP bir enjeksiyon, yani protein iyi polarize MDCK hücreleri bazolateral yüzeyinde teslim edilir. Tüm VSVGts045-GFP 31, kovalamaca sırasında bazolateral membran teslim olduğunu ° C gibi geniş total protein, hücre içi sinyal kanıtladığı (yeşil, 1 A ve B Rakamlar). Iyi polarize değildir hücrelerinde VSVGts045-GFP apikal membran (Şekil 1 B) teslim edilecektir. Kontrol örnekleri Şekil 1 B hücre gibi bakarsanız, size güven ve iyi polarize hücreler ile deneme tekrarlamak zorunda değildir. Ölçeği çubuklar 5 mikron.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

, Başarılı bir mikroenjeksiyon deney için en kritik adımlar hücrelerinin DNA ve polarite kalite ve saflık. Polarize hücreler olmadan, enjeksiyon kontrolü zaten VSVG mistargeted olacak ve deney kullanılamaz. DNA kalitesiz ise, DNA yoksullara açan bir iğne ya da istenilen protein hiçbir ifade tıkayabilir. Ayrıca, böyle pRKV gibi yüksek ekspresyon düzeyleri yol açtığı bilinen ifade plazmid kullanmak için tavsiye edilir. Diğer kargo proteinler sıralamak için test etmek ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Isıtmalı aşaması ile 200 Mikroskop Axiovert </td><td> Carl Zeiss A.Ş. </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet mikromanipülatör </td><td> Eppendorf </td><td> Özel sipariş </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroenjeksiyon iğneler) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader ipuçları </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Clear 12 mm transwell filtre destekler </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoksin ücretsiz plazmid maxiprep kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Apikal etki &#39;ücretsiz&#39; yüzeyleri yüzleri ve bazolateral membran substrat ve komşu hücrelerle temas biyokimyasal ve fonksiyonel olarak farklı apikal ve bazolateral etki alanı içine plazma zarı kutuplaştırırlar epitel hücreleri. Her iki membran etki, bir difüzyon bariyeri oluşturan sıkı bağlantıları ayrılır. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri, epitel hücreleri polikarbonat filtreler yüksek yoğunluklu numaralı seribaşı ve birkaç gün 1 2 kültüre Apikal-bazolateral kutuplaşma kültürü başarıyla değinmeyecek. Ras süperailesinin RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ve Rab13 3 4 5 6 7 gibi küçük GTPases bir dizi hücre polarite kurulması ve bakımı tarafından düzenlenir. GDP-bağlı etkin olmayan bir devlet ve aktif bir GTP bağlı devlet arasındaki tüm GTPases gibi bu proteinlerin döngüsü. Bu bisiklet 8 ile nükleotid bağlayıcı bölgelerinde spesifik mutasyonların etkileyebilir. Örneğin, Rab13T22N kalıcı GSYİH-form kilitlenir ve böylece &#39;olumsuz baskın&#39; olarak adlandırılan, Rab13Q67L artık GTP hidroliz ise ve bu nedenle bir &#39;baskın aktif&#39; devlet 7 kilitlenmiş durumda . Hücreleri, kendi işlevlerini analiz etmek GTPases iki baskın baskın negatif ve aktif allel genellikle endojen proteinlerin 9 fonksiyonu ile müdahale yüksek seviyelerde ifade edilir. Kısa bir miktarı aşırı ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak için zarif bir şekilde, filtre, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak destekler yetişen polarize hücrelerinin çekirdekleri doğrudan ilgili proteinleri kodlayan plazmid tanıtmaktır. Bu çoğu zaman özellikle apikal veya bazolateral etki alanı sıralanır plazma membran reseptörleri kodlayan plazmid muhabiri ko-enjeksiyon ile birleştirilmiştir. Bazolateral etki sıralama kargo analiz etmek için sık sık kullanılan bir kargo veziküler stomatit virüsü glikoprotein (VSVGts045) 10 ısıya duyarlı bir allel . Bu protein, 39 ° C&#39;de düzgün bir şekilde katlayın ve ilgi düzenleyici protein sitoplazmada monte edilir ve böylece endoplazmik retikulum (ER) muhafaza edilecektir. Bir kayma ile 31 ° C VSVGts045 plazma zarı 11 ER ve seyahat düzgün kat terk etmeye izin verecek. Bu kovalamaca genellikle temiz sonuçları neden daha fazla protein sentezini önlemek için Siklohekzimidsiz varlığı yapılır. Burada detaylı olarak, kapsamlı bir analiz bazolateral sıralama yer alan düzenleyici proteinlerin izin sıcaklık vardiya de dahil olmak üzere polarize hücreler ve sonraki inkubasyon plazmid microinjecting prosedürü açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Northwestern University. Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Video: Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biyoloji

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Tavuk Lensi Gelişimi Sırasında Protein Ekspresyonunun İncelenmesi

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Yazar Gündemi: Embriyonik Tavuk Lensinde RCAS(A) Retrovirüsünün Mikroenjeksiyonu Yoluyla Lens Gelişimi ve İşlevinin Araştırılması 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...