Biz T. Hung, MC teşekkür ederim. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut ve tartışmalar için I. Shestopalov. Bilim, Teknoloji ve Singapur (CC), NIH R01-CA118750 ve R01-HG004361 (HYC) ve Rejeneratif Tıp (HYC) için California Institute of Araştırma Ajansı tarafından desteklenir. HYC Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Erken Kariyer bilim adamıdır.

1. Prob Tasarım Tasarım anti-sense DNA cıvıldamak tarafından RNA hedef seçici alımı için probları fayans. <ol><li> Adresindeki çevrimiçi prob tasarımcısını kullanarak Tasarım anti-sense oligo probları <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Bu parametreleri kullanın: probları RNA uzunluğu = 1 prob / 100 bp sayısı; 2) Hedef GC% = 45; 3) Oligonükleotid uzunluğu = 20; 4) Aralığı uzunluğu = 60-80. Çok uzun eğer tasarımcı için segmente RNA kırın. Tekrarlar veya geniş homoloji bölgeleri atlayın. </li><li> 3-prime sonunda BiotinTEG ile Sipariş anti-sense DNA probları. </li><li> RNA boyunca konumlarına göre Etiket sondalar. &quot;Hatta&quot; havuzu tüm problar numaralandırma 2, 4, 6, vb içerir ve &quot;tuhaf&quot; havuz 1 numaralandırma probları, 3, 5 içerecek şekilde iki havuz ayırın, vb 100 uM konsantrasyonu problarla havuzu sulandırıp -20 ° C&#39;de mağaza </li><li> Bütün deneyler kullanılarak yapılacak olanbirbirleri için iç kontroller olarak hizmet hem havuzları,. Prob özgü sesler her havuz için benzersiz olacağını ise Gerçek RNA-bağımlı sinyal, hem havuzlarından mevcut olacaktır. Bu cıvıldamak-qPCR ve cıvıldamak-seq her ikisi için de geçerlidir. </li></ol> 2. Hasat Hücreleri Cıvıldamak deney için kullanılacak olan hücreler toplanır. <ol><li> Doku kültürü plaka veya konfluense için matara hücreleri büyümek. Fosfat ile durulayın kez (PBS) tamponlu ve trypsinize. Hücreleri çıkarmak ve tek hücre süspansiyonu haline tekrar süspansiyon aşağı, medya&gt; 2x hacmi ile pipet tripsin kadar gidermek ve. 50 ml Falcon tüp içine tüm medya ve süspanse hücreler aktarın. 20 milyon hücreler tipik bir örnek cıvıldamak için yeterlidir. </li><li> 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Gerekirse PBS 40 ml aspirat ortam ve Pastör pipetiyle 40000000 hücreleri, tüpler birleştirmektedir. 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Durusu PBS, dikkatli bir açı kalan sıvı üzerinde aspire. </li></ol&gt; 3. Cross-Link Hücre ve Hücre Pelet toplayın Crosslink RNA-Kromatin etkileşimleri korumak ve hücre pelletini hazırlamak için glutaraldehitle hücreleri toplanır. <ol><li> Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 PBS içinde% glutaraldehid hazırlayın. 10 milyon hücre (0.4 mL% 25 gluteraldehit stok + 9.6 ml PBS) başına 10 ml hazırlayın. Glutaraldehyde taze kullanılması gerekir. </li><li> Pelet çıkarmak için Falcon tüpler alt dokunun. Pastör pipetiyle hücre pelletini% 1 gluteraldehit ile, parçalar önlemek için küçük bir hacim ile başlayan, daha sonra tam hacmine kontör. Karıştırmak için ters çevirin. Uçtan uca çalkalayıcı veya rotator üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika süreyle çapraz bağ. </li><li> 5 dk için oda sıcaklığında 1.25 M glisin 1/10th hacmi ile çapraz bağlama reaksiyonu Quench. </li><li> 5 dakika 2000RCF döndürme. 20 mL 5 dakika 2000RCF dönüyor, bir kez PBS ile soğutulmuş süpernatan ve yıkama pelet aspire. </li><li> W aspire edin ve tekrar süspansiyonküllendirilmekte, çapraz bağlı pelet 20000000 hücre başına 1 ml PBS ile soğutulmuş. Dikkatli pipet ile mümkün olduğunca çok PBS çıkarın 4 C&#39;de 3 dakika 2000RCF bir Eppendorf tüp ve spin her ml aktarın. </li><li> -80 Sıvı nitrojen ve mağaza içinde hücre pelletleri Flash dondurmak ° C süresiz. </li></ol> 4. Hücre Lizis Hücre lizatı hazırlamak için, çapraz bağlı hücre parçalayan. <ol><li> Oda sıcaklığında dondurulmuş hücre pelletleri çözünmesi. Hücre pelletini çıkarmak ve karıştırmak için sert dokunun. 4 3 dakika ° C için 2000RCF de pelet aşağı Spin Kalan PBS kaldırmak için keskin bir 10 ul pipet kullanın. </li><li> Elektronik denge (1mg doğru) boş bir Eppendorf tüp dara kütlesi Açık (bizim tüpler çok tutarlı 1.060 gram ağırlığında). Her pelet tartılır ve ağırlığı kaydetmek. Çapraz HeLa hücre tam 15 santimlik genellikle 100 mg ağırlığındadır. </li><li> Fres ile Supplement Lysis Buffer (pelet 10X kitle, 100mg örneğin 1 ml)h Proteaz İnhibitör, PMSF ve Superase-in (ekli tampon listesine bakınız). İyice karıştırın. </li><li> Her tüpe 10X hacmi ilave Lizis Tampon ekleyin ve pelletini. Küçük saçmalar için &lt;250 ul takviye lizis tamponunda tekrar süspansiyon 25 mg. Süspansiyon düzgün olmalıdır. Değilse, 500 ul kısma süspansiyon bölmek ve öbekler kırmak için motorlu bir pelet karıştırıcı kullanınız. Sonikasyon hemen geçin. </li></ol> 5.. Sonikasyon Çapraz bağlı hücre lizatları sonicating tarafından Kesme DNA. <ol><li> 15 ml Falcon tüplerinde Bioruptor hücre lizatı sonikasyon. Her bir tüp içinde &lt;1.5 ml lizat kullanın ve daha hızlı sonication için, bir defada en fazla iki tüp ses dalgalarına maruz. </li><li> Nabız aralıklarında KAPALI 45 saniye, 30 saniye AÇIK ile yüksek ayarda bir 4 ° C su banyosunda sonikasyon. Her 30 dakikada Lizat kontrol edin. Hücre lizatı artık tortulaşmış kadar sonicating devam etmektedir. Bu kadar az 30 dakika olarak ve birçok 4 saat kadar sürebilir. Numarasıtüpler, örnek hacmi, banyo sıcaklığı ve sonication süre süreci ne kadar uzun sürdüğünü etkileyecektir. Tüpler olasılıkla farklı hızlarda ses dalgalarına maruz, bu yüzden birlikte homojenlik sağlamak için orijinal tüpler içine her 30 dakikada bir ve yeniden dağıtma onları havuzundan olacaktır. Not: glutaraldehit-çapraz bağlı hücreleri formaldehit muadillerine göre ses dalgalarına maruz uzun ölçüde alır. </li><li> Lizat net döndüğünde, taze bir Eppendorf tüpüne 5 uL lizat aktarın. 90 uL DNA Proteaz K (PK) Buffer (tampon listesine bakınız) ve 5 uL PK ekleyin. Vortex karıştırın ve kısa süre basılı dönmeye. 50 azından 45 dakika süreyle inkübe ° C. </li><li> Qiagen PCR saflaştırma kiti ile DNA ayıklayın. Zehir 30 uL Qiagen Elüsyon Buffer (EB) DNA ve% 1 agaroz jel üzerinde DNA boyutunu kontrol edin. DNA yayma dökme 100-500 bp olması durumunda, sonication tamam olmaktadır. Eğer yoksa, ses dalgalarına maruz devam etmektedir. </li><li> 4 azından 10 dakika süreyle 16100RCF azından sonike örnekleri santrifüje ° C. Sıvı nitroge için 1 mL örnekleri ve flash-donma içine süpernatantlar, tablet birleştirinn. -80 ° C de saklayınız </li></ol> 6. Cıvıldamak Bağlı kromatin RNA ve izole etmek için biyotinile DNA probları melezler. <ol><li> Oda sıcaklığında kromatin Çözülme tüpleri. </li><li> (Kromatin ml başına 2 ml hazırlamak, tampon listesine bakınız) Hibridizasyon Tamponu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. </li><li> Lizat 1 ml kullanarak tipik bir cıvıldamak örnek için, Eppendorf tüpleri DNA INPUT ve yer için RNA INPUT ve 10 uL 10 uL kaldırın. Daha fazla kullanmak kadar buz üzerinde tutun. </li><li> 15 ml Falcon tüpüne 1 mL kromatin aktarın. Her tüpe 2 mL Hibridizasyon Tamponu ekleyin. Toplam hacim için &lt;1.5 ml Eppendorf tüpleri kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında probları çözünmesi. Eğer uzun süreli olarak kullanılan değilseniz, miktarını kontrol etmek için Nanodrop sondalar (100 uM sondaları gerektiği spec ~ tek iplikli DNA ayarını kullanarak 500-600 ng / ml). Özel borular (1 ml kromatin başına 100 pmol probu, 1 ml kromatin başına 100 uL / ​​pmol probu 1 uL) problarla uygun hacimde ekleyin.İyice karıştırın. Çalkalama ile 4 saat için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 20 dakika için geri kalan ile melezleştirme, C-1 manyetik boncuklar (4 ° C de muhafaza) hazırlanır. Probların 100 pmol başına 100 mcL kullanın. 1 ml unsupplemented Lizis Tampon ile tampon ayrı boncuk DynaMag-2 mıknatıslı şerit kullanarak üç kez yıkayın. </li><li> Lizis Tampon orijinal hacminin Pastör pipetiyle boncuklar; taze PMSF, PI ve Superase-in eki. 4 saat hibridizasyon Reaksiyon tamamlandıktan sonra, her tüpe 100 uL boncuklar ilave edin. İyice karıştırın. Çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> (Örnek başına 5 mL) Yıkama solusyonu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. 37 öncesi sıcak ° C Kullanmadan önce PMSF ekleyin. </li><li> 1 ml yıkama tamponu ile beş kez yıka boncuklar. Ilk yıkamada, 1 ml yıkama tamponu ayrı boncuk, aktarmak ve Pastör pipetiyle için DynaMag-15 manyetik bant kullanın. 1,5 ml Eppendorf tüpüne hacmi aktarın. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sonraki yıkar, bir minicentrifuge her tüp aşağı spin, 1 dakika DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde örnekleme ayarlayın. Örnek boşaltmak, 1 ml yıkama tamponu içinde yeniden süspanse bir Kimwipe, herhangi bir damlalar mendil. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Toplam beş yıkama için tekrarlayın. </li><li> Son yıkama anda, iyi boncuklar tekrar süspansiyon. 100 uL çıkarın ve RNA izolasyonu için kenara koyun. DNA fraksiyonu karşılığı 900 uL. DynaMag-2 manyetik şerit üzerindeki tüm tüpler yerleştirin ve yıkama tamponu çıkarın. Kısaca aşağıya tüpleri Spin; mıknatıslı şerit üzerine koyun. Keskin bir 10 ul pipet ucu ile tamamen yıkama tamponu son bit çıkarın. </li></ol> 7. RNA İzolasyonu QRT-PCR ile quantitate cıvıldamak örneklerinden RNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> 100 uL boncuk örnekleri ve 10 uL RNA GİRİŞ örnek alın. GİRİŞ RNA 85 uL RNA PK Tamponu pH 7.0 ekleyin. 95 uL RNA PK Tampon pH 7.0 Pastör pipetiyle boncuk. Uçtan uca çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de 5 uL Proteinease K ve inkübe ekleyin. </li><li> Kısaca tüm tüpler aşağı spin ve95 az ısı blokta 10 dakika süreyle örnekleri kaynamaya ° C. </li><li> Buz örnekleri Chill, 10 saniye boyunca kuvvetlice 500 uL TRIzol, girdap ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. -80 ° C&#39;de saklayın veya 4. adıma geçin. </li><li> TRIzol muamele örnekleri ile 100 uL kloroform ekleyin. 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika için bir tezgah üstü santrifüj üzerine 16100RCF at Spin </li><li> Organik ve arayüz kaçınarak, ~ 400 uL sulu süpernatantı. </li><li> 600 uL (1.5 hacim)% 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. MIRNeasy Mini sütunlar aracılığıyla örnek Spin. GDK (MIRNeasy Mini kiti), üreticinin protokol başına RPE ile 2x 1x yıkayın. 30 uL nükleaz içermeyen H 2 O (nfH 2 O) ile Zehir. </li><li> RNA eluat üreticinin protokol başına DNA ücretsiz davranın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, 65, 15 dakika boyunca ısıtılması Örnek ° C&#39;de tamamen kalan DNase inaktive etmek için. </li><li> 1 uL RNA kullanın lncRNA onaylamak için QRT-PCR analizi için başına ve izolealma. GAPDH genellikle bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. </li></ol> 8. DNA İzolasyonu Sekanslamasıyla tanımlamak veya qPCR tarafından quantitate cıvıldamak örneklerinden DNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> DNA Elüsyon Buffer (tampon listeye bakın), DNA GİRİŞ dahil numune başına 150 ul, hazırlayın. </li><li> Karıştırmak için 1 0μL RNaz A (10 mg / mL) ve 10 uL RNaz H (10 U / ml) DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ml&#39;de ve girdap ekleyin. </li><li> RNases DNA Seyreltme Tampon 150 uL boncuk her numune yeniden süspanse edin. (140 uL in Pastör pipetiyle DNA GİRİŞ) çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Ayrı boncuk ve DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde yüzer. Süpernatantı ve etiketli tüpler ekleyin. </li><li> 10 uL RNaz A (10 mg / mL) ve RNaseH (10 U / ml) tam olarak 8,2 yapılır) ile DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ikinci bir alikotu hazırlayın. Her numune (DNA INPUT dahil), inkübe 150 uL ekleyin ve süpernatant çıkarın. Tüm supernatant (omuz toplayınd) ~ 300 uL olabilir. </li><li> Her numune için 15 uL PK ekleyin. Çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sarı faz kilidi jel tüpler (5PRIME) aşağı Öncesi dönerler. Faz-kilit jel tüpler için DNA örnekleri aktarın ve 300 uL PhOH ekleyin: numune başına İzoamil: Kloroform. 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır, ve 4 ° C sıcaklıkta 5 dk için 16100RCF bir tezgah üstü üzerinde aşağı doğru dönmeye santrifüj Üst (~ 300 uL) gelen sulu atın. 3 uL GlycoBlue, 30 uL NaOAc ve 900 uL% 100 EtOH ekleyin. Gece -20 ° C de ve mağaza karıştırın. </li><li> 4 azından 30 dakika süreyle 16100RCF azından örnekleri Spin ° C. </li><li> Dikkatli Durusu süpernatant. 1 ml% 70 EtOH ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 5 dakika 16100RCF döndürme. Pipet ile süpernatantı. Hava 1dk için kurulayın. 30 uL EB yeniden süspanse edin. </li><li> DNA örnekleri qPCR veya Illumina protokol başına yüksek verim sıralama kütüphaneler hazırlanması tarafından analiz için hazırdır. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 </strong&gt; cıvıldamak iş akışı gösteriyor. Başarılı bir cıvıldamak deneyi tipik olarak önemli ölçüde spesifik olmayan RNA üzerinde hedef RNA zenginleştirir. Şekil 2 GAPDH üzerinde HeLa hücreleri insan telomeraz RNA (TERC), bir negatif kontrol görevi gören bir bol hücresel RNA zenginleşme gösterir. GAPDH RNA sadece% 0.46 olarak alınmıştır ise hücrede yer TERC RNA&#39;lar (~% 88) çoğunluk ~ 200 kat bir zenginleştirme faktörü göstererek, cıvıldamak yaparak yıkıldılar. Gibi memeli hücreleri (Şekil 2) ile ifade değildir lacZ RNA, hedefleme probları gibi spesifik olmayan probları ilave negatif kontrol olarak kullanılabilir. Hedef lncRNA bağlamak için beklenen DNA bölgeleri genellikle qPCR tarafından ölçülen negatif bölgeler üzerinde zenginleştirilmiştir. Şekil 3 biz aynı hücre dizisinde cıvıldamak-seq yapılarak belirlenen birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında dört HOTAIR bağlı sitelerin qPCR doğrulama gösterir iken TERC ve GAPDH DNA bölgeleri senegatif kontrol bölgeler olarak RVE. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; sonda negatif bölgelerin, gerçek lncRNA bağlayıcı siteleri bir işaretidir boyunca beklenenden HOTAIR bağlı sitelerin vermiştir karşılaştırılabilir zenginleştirme ayarlar. Cıvıldamak zenginleştirilmiş DNA Yüksek throughput sıralama lncRNA bağlayıcı sitelerinin bir dünya haritası verir. Drosophila lncRNA roX2 dozaj telafisi için gerekli olan bir tarzda X-kromozom ile etkileşim olduğu bilinmektedir. Şekil 4, X kromozom bir bölümünün üzerine roX2 bağlanma profili gösterir. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; örnekleri dizisi edilmiş ve kendilerine özgü sesler üst üste gelen sinyaller bir parça üretmek için silinmiştir. Her bir &quot;zirve&quot; Burada roX2 bağlama güçlü bir site gösterir. Tüm takip ve roX2 hedef genlerin listesini Chu ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 2.011 17. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Cıvıldamak prosedürü Şekil 1. Akış şemasıDure. Tinile fayans probları lncRNA hedef melezlendi ve in vivo protein adducts ve kromatin kompleksleri katı yıkama izledi, manyetik streptavidin boncuklar kullanılarak saflaştırıldı edilir. Kromatin lncRNA çaprazlandı edilir. Biz A olası lncRNA bağlayıcı sırası turuncu şematize edilmiştir RNaz A ve H. bir kokteyl ile lncRNA bağlı DNA veya protein Zehir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Insan TERC RNA için Şekil 2. Cıvıldamak zenginleştirir. TERC-asDNA problar hücresel TERC RNA ve saptanamayan GAPDH arasında ~% 88 almak. LacZ-asDNA problar negatif kontrol olarak kullanıldı ve ne RNA&#39;lar almak edilir. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Şekil 3. Birincil insan HOTAIR cıvıldamak-qPCR içinEskin fibroblastlar. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ve ABCA2 HOTAIR etkileşim bölgeleridir. TERC ve GAPDH negatif kontrol olarak görev yaptı. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Şekil 4. SL2 Drosophila hücrelerinde roX2 RNA cıvıldamak-seq veri. &quot;Hatta&quot; ve &quot;tuhaf&quot; ayrı dizilenmisti.r; kendi veri hem de tek ortak zirveleri yansıtacak şekilde birleştirmek. Birleştirilen parça gösterilir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu ve HY Chang, bu yönteme dayalı bir patent başvurusu üzerine mucitler olarak adlandırılır.

Burada cıvıldamak-seq, in vivo lncRNA bağlayıcı siteleri genom içinde haritalama yöntemi tanımladı. Başarı için anahtar parametreleri oligonükleotid problar ve glutaraldehit çapraz döşeme arasında bölünmüş havuzları vardır. Afinite-prob tasarımı RNA dizisi verilen basittir ve RNA&#39;nın yapı veya fonksiyonel etki hiçbir ön bilgi gerektirir. İki tür üç oldukça farklı RNA&#39;lar - - roX2, TERC ve HOTAIR elde ettiğimiz başarılar cıvıldamak-seq birçok lncRNAs muhtemeldir genellenebilir olduğunu göstermektedir. Tüm deneylerde olduğu gibi, bakım ve uygun kontrollerin sonuçlarını yorumlamak için gereklidir. Farklı lncRNA koşulları titrasyonu ve bu farklı ilgi prob veya çapraz bağlayıcıların seçimi gibi koşullar, politikasıyla değişikliği gerektirebilir, RNA-kromatin etkileşimleri farklı yönlerini vurgulamak olabilir. ChIP-SEQ gibi, tüm bağlama olayları ille fonksiyonel olup, ek çalışmalar RNA o biyolojik sonuçlarını tespit etmek için gerekli olankromatin üzerine ccupancy. Yine de, binlerce 8,9 şimdi sayısı diğer kromatin ile ilişkili lncRNAs, araştırmacıları için bu teknolojinin pek çok ilginç uygulama öngörüyoruz. ChIP-seq DNA-protein etkileşimleri genom araştırmaları için kapıyı açtı gibi, &quot;RNA interactome&quot; nin cıvıldamak-seq çalışmaları biyoloji birçok yeni yollar ortaya çıkarabilir.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Uzun kodsuz RNA gibi dozaj tazminat, basma, ve gelişimsel gen ekspresyonu 1,2,3,4,5,6,7 gibi önemli biyolojik süreçler için kromatin devletlerin anahtar düzenleyicileri vardır. Aracılık histon H3 lizin 27 trimethylation (H3K27me3), bir gen-spesifik kromatin devletlerin yönetiminde çok sayıda lncRNAs için geniş rolleri önerdiği gibi Polycomb Baskıcı Kompleksi 2 (PRC2) gibi belirli kromatin modifikasyonu kompleksleri ile birlikte lncRNAs binlerce son keşif moda 8,9. Bazı lncRNAs komşu genler üzerinde cis çalışmak için düşünülen, diğer lncRNAs uzaktan bulunan genleri düzenleyen trans çalışır. Örneğin, Drosophila lncRNAs roX1 ve erkek hücrelerin X kromozomu üzerinde roX2 bağlaması çok sayıda bölge ve dozaj tazminat 10,11 kritik öneme sahiptir. Ancak, bağlanma yerlerinin tam yeri yüksek çözünürlükte bilinmemektedir. Benzer şekilde, insan lncRNA HOTAIR h PRC2 doluluk etkileyebilirgenler genom 3,12,13, ama nasıl özgüllük elde edilir ve undreds belirsizdir. LncRNAs aynı zamanda birden fazla protein komplekslerinin birleşmesini işe modüler iskele olarak hizmet verebilir. Klasik trans-etkili RNA iskele 14 karmaşık telomeraz için şablon ve iskele olarak hizmet TERC RNA; HOTAIR de PRC2 için bir iskele ve 13 karmaşık bir H3K4 demetilaz olarak hizmet verebilir. Kromatin RNA doluluk haritalama Önceki çalışmalar önemli anlayışlar 15,16 olduğu ancak bir seferde sadece tek bir gen de var. En lncRNAs ve doluluk siteleri bilinmemektedir ve kromatin yönetmelikte lncRNAs rolleri çoğunlukla lncRNA pertürbasyon dolaylı etkilerinin olayla edilmiştir. Kromatin immünopresipitasyon mikroarray veya derin sıralama (sırasıyla ChIP-çip ya da ChIP-seq) tarafından takip ettiği gibi büyük bir genomik ölçekte protein-DNA etkileşimleri anlayışımız geliştirdi, burada bir recen göstermektly yüksek çözünürlükte 17 uzun RNA doluluk genom haritası için strateji yayınladı. Sonra birkaç yüz üsleri çözünürlükte genomik bağlama bölgelerinin bir harita oluşturur antisens oligos, döşeme tarafından kromatin kompleksi: RNA Arıtma (chirp) (Şekil 1), bu yöntemi, Kromatin İzolasyon hedef lncRNA bir afinitesi yakalama dayanmaktadır yüksek hassasiyet ve arka plan düşük. Afinite-prob tasarım RNA sekansı verilen basittir ve RNA yapısı ya da işlevsel etki hiçbir bilgi gerektirdiğinden cıvıldamak birçok lncRNAs için de geçerlidir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Cıvıldamak uzun kodsuz RNA&#39;lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

85.4K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.