Biz T. Hung, MC teşekkür ederim. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut ve tartışmalar için I. Shestopalov. Bilim, Teknoloji ve Singapur (CC), NIH R01-CA118750 ve R01-HG004361 (HYC) ve Rejeneratif Tıp (HYC) için California Institute of Araştırma Ajansı tarafından desteklenir. HYC Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Erken Kariyer bilim adamıdır.

1. Prob Tasarım Tasarım anti-sense DNA cıvıldamak tarafından RNA hedef seçici alımı için probları fayans. <ol><li> Adresindeki çevrimiçi prob tasarımcısını kullanarak Tasarım anti-sense oligo probları <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Bu parametreleri kullanın: probları RNA uzunluğu = 1 prob / 100 bp sayısı; 2) Hedef GC% = 45; 3) Oligonükleotid uzunluğu = 20; 4) Aralığı uzunluğu = 60-80. Çok uzun eğer tasarımcı için segmente RNA kırın. Tekrarlar veya geniş homoloji bölgeleri atlayın. </li><li> 3-prime sonunda BiotinTEG ile Sipariş anti-sense DNA probları. </li><li> RNA boyunca konumlarına göre Etiket sondalar. &quot;Hatta&quot; havuzu tüm problar numaralandırma 2, 4, 6, vb içerir ve &quot;tuhaf&quot; havuz 1 numaralandırma probları, 3, 5 içerecek şekilde iki havuz ayırın, vb 100 uM konsantrasyonu problarla havuzu sulandırıp -20 ° C&#39;de mağaza </li><li> Bütün deneyler kullanılarak yapılacak olanbirbirleri için iç kontroller olarak hizmet hem havuzları,. Prob özgü sesler her havuz için benzersiz olacağını ise Gerçek RNA-bağımlı sinyal, hem havuzlarından mevcut olacaktır. Bu cıvıldamak-qPCR ve cıvıldamak-seq her ikisi için de geçerlidir. </li></ol> 2. Hasat Hücreleri Cıvıldamak deney için kullanılacak olan hücreler toplanır. <ol><li> Doku kültürü plaka veya konfluense için matara hücreleri büyümek. Fosfat ile durulayın kez (PBS) tamponlu ve trypsinize. Hücreleri çıkarmak ve tek hücre süspansiyonu haline tekrar süspansiyon aşağı, medya&gt; 2x hacmi ile pipet tripsin kadar gidermek ve. 50 ml Falcon tüp içine tüm medya ve süspanse hücreler aktarın. 20 milyon hücreler tipik bir örnek cıvıldamak için yeterlidir. </li><li> 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Gerekirse PBS 40 ml aspirat ortam ve Pastör pipetiyle 40000000 hücreleri, tüpler birleştirmektedir. 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Durusu PBS, dikkatli bir açı kalan sıvı üzerinde aspire. </li></ol&gt; 3. Cross-Link Hücre ve Hücre Pelet toplayın Crosslink RNA-Kromatin etkileşimleri korumak ve hücre pelletini hazırlamak için glutaraldehitle hücreleri toplanır. <ol><li> Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 PBS içinde% glutaraldehid hazırlayın. 10 milyon hücre (0.4 mL% 25 gluteraldehit stok + 9.6 ml PBS) başına 10 ml hazırlayın. Glutaraldehyde taze kullanılması gerekir. </li><li> Pelet çıkarmak için Falcon tüpler alt dokunun. Pastör pipetiyle hücre pelletini% 1 gluteraldehit ile, parçalar önlemek için küçük bir hacim ile başlayan, daha sonra tam hacmine kontör. Karıştırmak için ters çevirin. Uçtan uca çalkalayıcı veya rotator üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika süreyle çapraz bağ. </li><li> 5 dk için oda sıcaklığında 1.25 M glisin 1/10th hacmi ile çapraz bağlama reaksiyonu Quench. </li><li> 5 dakika 2000RCF döndürme. 20 mL 5 dakika 2000RCF dönüyor, bir kez PBS ile soğutulmuş süpernatan ve yıkama pelet aspire. </li><li> W aspire edin ve tekrar süspansiyonküllendirilmekte, çapraz bağlı pelet 20000000 hücre başına 1 ml PBS ile soğutulmuş. Dikkatli pipet ile mümkün olduğunca çok PBS çıkarın 4 C&#39;de 3 dakika 2000RCF bir Eppendorf tüp ve spin her ml aktarın. </li><li> -80 Sıvı nitrojen ve mağaza içinde hücre pelletleri Flash dondurmak ° C süresiz. </li></ol> 4. Hücre Lizis Hücre lizatı hazırlamak için, çapraz bağlı hücre parçalayan. <ol><li> Oda sıcaklığında dondurulmuş hücre pelletleri çözünmesi. Hücre pelletini çıkarmak ve karıştırmak için sert dokunun. 4 3 dakika ° C için 2000RCF de pelet aşağı Spin Kalan PBS kaldırmak için keskin bir 10 ul pipet kullanın. </li><li> Elektronik denge (1mg doğru) boş bir Eppendorf tüp dara kütlesi Açık (bizim tüpler çok tutarlı 1.060 gram ağırlığında). Her pelet tartılır ve ağırlığı kaydetmek. Çapraz HeLa hücre tam 15 santimlik genellikle 100 mg ağırlığındadır. </li><li> Fres ile Supplement Lysis Buffer (pelet 10X kitle, 100mg örneğin 1 ml)h Proteaz İnhibitör, PMSF ve Superase-in (ekli tampon listesine bakınız). İyice karıştırın. </li><li> Her tüpe 10X hacmi ilave Lizis Tampon ekleyin ve pelletini. Küçük saçmalar için &lt;250 ul takviye lizis tamponunda tekrar süspansiyon 25 mg. Süspansiyon düzgün olmalıdır. Değilse, 500 ul kısma süspansiyon bölmek ve öbekler kırmak için motorlu bir pelet karıştırıcı kullanınız. Sonikasyon hemen geçin. </li></ol> 5.. Sonikasyon Çapraz bağlı hücre lizatları sonicating tarafından Kesme DNA. <ol><li> 15 ml Falcon tüplerinde Bioruptor hücre lizatı sonikasyon. Her bir tüp içinde &lt;1.5 ml lizat kullanın ve daha hızlı sonication için, bir defada en fazla iki tüp ses dalgalarına maruz. </li><li> Nabız aralıklarında KAPALI 45 saniye, 30 saniye AÇIK ile yüksek ayarda bir 4 ° C su banyosunda sonikasyon. Her 30 dakikada Lizat kontrol edin. Hücre lizatı artık tortulaşmış kadar sonicating devam etmektedir. Bu kadar az 30 dakika olarak ve birçok 4 saat kadar sürebilir. Numarasıtüpler, örnek hacmi, banyo sıcaklığı ve sonication süre süreci ne kadar uzun sürdüğünü etkileyecektir. Tüpler olasılıkla farklı hızlarda ses dalgalarına maruz, bu yüzden birlikte homojenlik sağlamak için orijinal tüpler içine her 30 dakikada bir ve yeniden dağıtma onları havuzundan olacaktır. Not: glutaraldehit-çapraz bağlı hücreleri formaldehit muadillerine göre ses dalgalarına maruz uzun ölçüde alır. </li><li> Lizat net döndüğünde, taze bir Eppendorf tüpüne 5 uL lizat aktarın. 90 uL DNA Proteaz K (PK) Buffer (tampon listesine bakınız) ve 5 uL PK ekleyin. Vortex karıştırın ve kısa süre basılı dönmeye. 50 azından 45 dakika süreyle inkübe ° C. </li><li> Qiagen PCR saflaştırma kiti ile DNA ayıklayın. Zehir 30 uL Qiagen Elüsyon Buffer (EB) DNA ve% 1 agaroz jel üzerinde DNA boyutunu kontrol edin. DNA yayma dökme 100-500 bp olması durumunda, sonication tamam olmaktadır. Eğer yoksa, ses dalgalarına maruz devam etmektedir. </li><li> 4 azından 10 dakika süreyle 16100RCF azından sonike örnekleri santrifüje ° C. Sıvı nitroge için 1 mL örnekleri ve flash-donma içine süpernatantlar, tablet birleştirinn. -80 ° C de saklayınız </li></ol> 6. Cıvıldamak Bağlı kromatin RNA ve izole etmek için biyotinile DNA probları melezler. <ol><li> Oda sıcaklığında kromatin Çözülme tüpleri. </li><li> (Kromatin ml başına 2 ml hazırlamak, tampon listesine bakınız) Hibridizasyon Tamponu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. </li><li> Lizat 1 ml kullanarak tipik bir cıvıldamak örnek için, Eppendorf tüpleri DNA INPUT ve yer için RNA INPUT ve 10 uL 10 uL kaldırın. Daha fazla kullanmak kadar buz üzerinde tutun. </li><li> 15 ml Falcon tüpüne 1 mL kromatin aktarın. Her tüpe 2 mL Hibridizasyon Tamponu ekleyin. Toplam hacim için &lt;1.5 ml Eppendorf tüpleri kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında probları çözünmesi. Eğer uzun süreli olarak kullanılan değilseniz, miktarını kontrol etmek için Nanodrop sondalar (100 uM sondaları gerektiği spec ~ tek iplikli DNA ayarını kullanarak 500-600 ng / ml). Özel borular (1 ml kromatin başına 100 pmol probu, 1 ml kromatin başına 100 uL / ​​pmol probu 1 uL) problarla uygun hacimde ekleyin.İyice karıştırın. Çalkalama ile 4 saat için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 20 dakika için geri kalan ile melezleştirme, C-1 manyetik boncuklar (4 ° C de muhafaza) hazırlanır. Probların 100 pmol başına 100 mcL kullanın. 1 ml unsupplemented Lizis Tampon ile tampon ayrı boncuk DynaMag-2 mıknatıslı şerit kullanarak üç kez yıkayın. </li><li> Lizis Tampon orijinal hacminin Pastör pipetiyle boncuklar; taze PMSF, PI ve Superase-in eki. 4 saat hibridizasyon Reaksiyon tamamlandıktan sonra, her tüpe 100 uL boncuklar ilave edin. İyice karıştırın. Çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> (Örnek başına 5 mL) Yıkama solusyonu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. 37 öncesi sıcak ° C Kullanmadan önce PMSF ekleyin. </li><li> 1 ml yıkama tamponu ile beş kez yıka boncuklar. Ilk yıkamada, 1 ml yıkama tamponu ayrı boncuk, aktarmak ve Pastör pipetiyle için DynaMag-15 manyetik bant kullanın. 1,5 ml Eppendorf tüpüne hacmi aktarın. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sonraki yıkar, bir minicentrifuge her tüp aşağı spin, 1 dakika DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde örnekleme ayarlayın. Örnek boşaltmak, 1 ml yıkama tamponu içinde yeniden süspanse bir Kimwipe, herhangi bir damlalar mendil. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Toplam beş yıkama için tekrarlayın. </li><li> Son yıkama anda, iyi boncuklar tekrar süspansiyon. 100 uL çıkarın ve RNA izolasyonu için kenara koyun. DNA fraksiyonu karşılığı 900 uL. DynaMag-2 manyetik şerit üzerindeki tüm tüpler yerleştirin ve yıkama tamponu çıkarın. Kısaca aşağıya tüpleri Spin; mıknatıslı şerit üzerine koyun. Keskin bir 10 ul pipet ucu ile tamamen yıkama tamponu son bit çıkarın. </li></ol> 7. RNA İzolasyonu QRT-PCR ile quantitate cıvıldamak örneklerinden RNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> 100 uL boncuk örnekleri ve 10 uL RNA GİRİŞ örnek alın. GİRİŞ RNA 85 uL RNA PK Tamponu pH 7.0 ekleyin. 95 uL RNA PK Tampon pH 7.0 Pastör pipetiyle boncuk. Uçtan uca çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de 5 uL Proteinease K ve inkübe ekleyin. </li><li> Kısaca tüm tüpler aşağı spin ve95 az ısı blokta 10 dakika süreyle örnekleri kaynamaya ° C. </li><li> Buz örnekleri Chill, 10 saniye boyunca kuvvetlice 500 uL TRIzol, girdap ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. -80 ° C&#39;de saklayın veya 4. adıma geçin. </li><li> TRIzol muamele örnekleri ile 100 uL kloroform ekleyin. 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika için bir tezgah üstü santrifüj üzerine 16100RCF at Spin </li><li> Organik ve arayüz kaçınarak, ~ 400 uL sulu süpernatantı. </li><li> 600 uL (1.5 hacim)% 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. MIRNeasy Mini sütunlar aracılığıyla örnek Spin. GDK (MIRNeasy Mini kiti), üreticinin protokol başına RPE ile 2x 1x yıkayın. 30 uL nükleaz içermeyen H 2 O (nfH 2 O) ile Zehir. </li><li> RNA eluat üreticinin protokol başına DNA ücretsiz davranın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, 65, 15 dakika boyunca ısıtılması Örnek ° C&#39;de tamamen kalan DNase inaktive etmek için. </li><li> 1 uL RNA kullanın lncRNA onaylamak için QRT-PCR analizi için başına ve izolealma. GAPDH genellikle bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. </li></ol> 8. DNA İzolasyonu Sekanslamasıyla tanımlamak veya qPCR tarafından quantitate cıvıldamak örneklerinden DNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> DNA Elüsyon Buffer (tampon listeye bakın), DNA GİRİŞ dahil numune başına 150 ul, hazırlayın. </li><li> Karıştırmak için 1 0μL RNaz A (10 mg / mL) ve 10 uL RNaz H (10 U / ml) DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ml&#39;de ve girdap ekleyin. </li><li> RNases DNA Seyreltme Tampon 150 uL boncuk her numune yeniden süspanse edin. (140 uL in Pastör pipetiyle DNA GİRİŞ) çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Ayrı boncuk ve DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde yüzer. Süpernatantı ve etiketli tüpler ekleyin. </li><li> 10 uL RNaz A (10 mg / mL) ve RNaseH (10 U / ml) tam olarak 8,2 yapılır) ile DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ikinci bir alikotu hazırlayın. Her numune (DNA INPUT dahil), inkübe 150 uL ekleyin ve süpernatant çıkarın. Tüm supernatant (omuz toplayınd) ~ 300 uL olabilir. </li><li> Her numune için 15 uL PK ekleyin. Çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sarı faz kilidi jel tüpler (5PRIME) aşağı Öncesi dönerler. Faz-kilit jel tüpler için DNA örnekleri aktarın ve 300 uL PhOH ekleyin: numune başına İzoamil: Kloroform. 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır, ve 4 ° C sıcaklıkta 5 dk için 16100RCF bir tezgah üstü üzerinde aşağı doğru dönmeye santrifüj Üst (~ 300 uL) gelen sulu atın. 3 uL GlycoBlue, 30 uL NaOAc ve 900 uL% 100 EtOH ekleyin. Gece -20 ° C de ve mağaza karıştırın. </li><li> 4 azından 30 dakika süreyle 16100RCF azından örnekleri Spin ° C. </li><li> Dikkatli Durusu süpernatant. 1 ml% 70 EtOH ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 5 dakika 16100RCF döndürme. Pipet ile süpernatantı. Hava 1dk için kurulayın. 30 uL EB yeniden süspanse edin. </li><li> DNA örnekleri qPCR veya Illumina protokol başına yüksek verim sıralama kütüphaneler hazırlanması tarafından analiz için hazırdır. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 </strong&gt; cıvıldamak iş akışı gösteriyor. Başarılı bir cıvıldamak deneyi tipik olarak önemli ölçüde spesifik olmayan RNA üzerinde hedef RNA zenginleştirir. Şekil 2 GAPDH üzerinde HeLa hücreleri insan telomeraz RNA (TERC), bir negatif kontrol görevi gören bir bol hücresel RNA zenginleşme gösterir. GAPDH RNA sadece% 0.46 olarak alınmıştır ise hücrede yer TERC RNA&#39;lar (~% 88) çoğunluk ~ 200 kat bir zenginleştirme faktörü göstererek, cıvıldamak yaparak yıkıldılar. Gibi memeli hücreleri (Şekil 2) ile ifade değildir lacZ RNA, hedefleme probları gibi spesifik olmayan probları ilave negatif kontrol olarak kullanılabilir. Hedef lncRNA bağlamak için beklenen DNA bölgeleri genellikle qPCR tarafından ölçülen negatif bölgeler üzerinde zenginleştirilmiştir. Şekil 3 biz aynı hücre dizisinde cıvıldamak-seq yapılarak belirlenen birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında dört HOTAIR bağlı sitelerin qPCR doğrulama gösterir iken TERC ve GAPDH DNA bölgeleri senegatif kontrol bölgeler olarak RVE. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; sonda negatif bölgelerin, gerçek lncRNA bağlayıcı siteleri bir işaretidir boyunca beklenenden HOTAIR bağlı sitelerin vermiştir karşılaştırılabilir zenginleştirme ayarlar. Cıvıldamak zenginleştirilmiş DNA Yüksek throughput sıralama lncRNA bağlayıcı sitelerinin bir dünya haritası verir. Drosophila lncRNA roX2 dozaj telafisi için gerekli olan bir tarzda X-kromozom ile etkileşim olduğu bilinmektedir. Şekil 4, X kromozom bir bölümünün üzerine roX2 bağlanma profili gösterir. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; örnekleri dizisi edilmiş ve kendilerine özgü sesler üst üste gelen sinyaller bir parça üretmek için silinmiştir. Her bir &quot;zirve&quot; Burada roX2 bağlama güçlü bir site gösterir. Tüm takip ve roX2 hedef genlerin listesini Chu ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 2.011 17. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Cıvıldamak prosedürü Şekil 1. Akış şemasıDure. Tinile fayans probları lncRNA hedef melezlendi ve in vivo protein adducts ve kromatin kompleksleri katı yıkama izledi, manyetik streptavidin boncuklar kullanılarak saflaştırıldı edilir. Kromatin lncRNA çaprazlandı edilir. Biz A olası lncRNA bağlayıcı sırası turuncu şematize edilmiştir RNaz A ve H. bir kokteyl ile lncRNA bağlı DNA veya protein Zehir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Insan TERC RNA için Şekil 2. Cıvıldamak zenginleştirir. TERC-asDNA problar hücresel TERC RNA ve saptanamayan GAPDH arasında ~% 88 almak. LacZ-asDNA problar negatif kontrol olarak kullanıldı ve ne RNA&#39;lar almak edilir. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Şekil 3. Birincil insan HOTAIR cıvıldamak-qPCR içinEskin fibroblastlar. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ve ABCA2 HOTAIR etkileşim bölgeleridir. TERC ve GAPDH negatif kontrol olarak görev yaptı. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Şekil 4. SL2 Drosophila hücrelerinde roX2 RNA cıvıldamak-seq veri. &quot;Hatta&quot; ve &quot;tuhaf&quot; ayrı dizilenmisti.r; kendi veri hem de tek ortak zirveleri yansıtacak şekilde birleştirmek. Birleştirilen parça gösterilir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu ve HY Chang, bu yönteme dayalı bir patent başvurusu üzerine mucitler olarak adlandırılır.

Burada cıvıldamak-seq, in vivo lncRNA bağlayıcı siteleri genom içinde haritalama yöntemi tanımladı. Başarı için anahtar parametreleri oligonükleotid problar ve glutaraldehit çapraz döşeme arasında bölünmüş havuzları vardır. Afinite-prob tasarımı RNA dizisi verilen basittir ve RNA&#39;nın yapı veya fonksiyonel etki hiçbir ön bilgi gerektirir. İki tür üç oldukça farklı RNA&#39;lar - - roX2, TERC ve HOTAIR elde ettiğimiz başarılar cıvıldamak-seq birçok lncRNAs muhtemeldir genellenebilir olduğunu göstermektedir. Tüm deneylerde olduğu gibi, bakım ve uygun kontrollerin sonuçlarını yorumlamak için gereklidir. Farklı lncRNA koşulları titrasyonu ve bu farklı ilgi prob veya çapraz bağlayıcıların seçimi gibi koşullar, politikasıyla değişikliği gerektirebilir, RNA-kromatin etkileşimleri farklı yönlerini vurgulamak olabilir. ChIP-SEQ gibi, tüm bağlama olayları ille fonksiyonel olup, ek çalışmalar RNA o biyolojik sonuçlarını tespit etmek için gerekli olankromatin üzerine ccupancy. Yine de, binlerce 8,9 şimdi sayısı diğer kromatin ile ilişkili lncRNAs, araştırmacıları için bu teknolojinin pek çok ilginç uygulama öngörüyoruz. ChIP-seq DNA-protein etkileşimleri genom araştırmaları için kapıyı açtı gibi, &quot;RNA interactome&quot; nin cıvıldamak-seq çalışmaları biyoloji birçok yeni yollar ortaya çıkarabilir.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Uzun kodsuz RNA gibi dozaj tazminat, basma, ve gelişimsel gen ekspresyonu 1,2,3,4,5,6,7 gibi önemli biyolojik süreçler için kromatin devletlerin anahtar düzenleyicileri vardır. Aracılık histon H3 lizin 27 trimethylation (H3K27me3), bir gen-spesifik kromatin devletlerin yönetiminde çok sayıda lncRNAs için geniş rolleri önerdiği gibi Polycomb Baskıcı Kompleksi 2 (PRC2) gibi belirli kromatin modifikasyonu kompleksleri ile birlikte lncRNAs binlerce son keşif moda 8,9. Bazı lncRNAs komşu genler üzerinde cis çalışmak için düşünülen, diğer lncRNAs uzaktan bulunan genleri düzenleyen trans çalışır. Örneğin, Drosophila lncRNAs roX1 ve erkek hücrelerin X kromozomu üzerinde roX2 bağlaması çok sayıda bölge ve dozaj tazminat 10,11 kritik öneme sahiptir. Ancak, bağlanma yerlerinin tam yeri yüksek çözünürlükte bilinmemektedir. Benzer şekilde, insan lncRNA HOTAIR h PRC2 doluluk etkileyebilirgenler genom 3,12,13, ama nasıl özgüllük elde edilir ve undreds belirsizdir. LncRNAs aynı zamanda birden fazla protein komplekslerinin birleşmesini işe modüler iskele olarak hizmet verebilir. Klasik trans-etkili RNA iskele 14 karmaşık telomeraz için şablon ve iskele olarak hizmet TERC RNA; HOTAIR de PRC2 için bir iskele ve 13 karmaşık bir H3K4 demetilaz olarak hizmet verebilir. Kromatin RNA doluluk haritalama Önceki çalışmalar önemli anlayışlar 15,16 olduğu ancak bir seferde sadece tek bir gen de var. En lncRNAs ve doluluk siteleri bilinmemektedir ve kromatin yönetmelikte lncRNAs rolleri çoğunlukla lncRNA pertürbasyon dolaylı etkilerinin olayla edilmiştir. Kromatin immünopresipitasyon mikroarray veya derin sıralama (sırasıyla ChIP-çip ya da ChIP-seq) tarafından takip ettiği gibi büyük bir genomik ölçekte protein-DNA etkileşimleri anlayışımız geliştirdi, burada bir recen göstermektly yüksek çözünürlükte 17 uzun RNA doluluk genom haritası için strateji yayınladı. Sonra birkaç yüz üsleri çözünürlükte genomik bağlama bölgelerinin bir harita oluşturur antisens oligos, döşeme tarafından kromatin kompleksi: RNA Arıtma (chirp) (Şekil 1), bu yöntemi, Kromatin İzolasyon hedef lncRNA bir afinitesi yakalama dayanmaktadır yüksek hassasiyet ve arka plan düşük. Afinite-prob tasarım RNA sekansı verilen basittir ve RNA yapısı ya da işlevsel etki hiçbir bilgi gerektirdiğinden cıvıldamak birçok lncRNAs için de geçerlidir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Cıvıldamak uzun kodsuz RNA&#39;lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

85.9K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

Video: Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...