Name: chromatin isolation by rna purification (chirp)
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Biz T. Hung, MC teşekkür ederim. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut ve tartışmalar için I. Shestopalov. Bilim, Teknoloji ve Singapur (CC), NIH R01-CA118750 ve R01-HG004361 (HYC) ve Rejeneratif Tıp (HYC) için California Institute of Araştırma Ajansı tarafından desteklenir. HYC Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Erken Kariyer bilim adamıdır.

1. Prob Tasarım Tasarım anti-sense DNA cıvıldamak tarafından RNA hedef seçici alımı için probları fayans. <ol><li> Adresindeki çevrimiçi prob tasarımcısını kullanarak Tasarım anti-sense oligo probları <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Bu parametreleri kullanın: probları RNA uzunluğu = 1 prob / 100 bp sayısı; 2) Hedef GC% = 45; 3) Oligonükleotid uzunluğu = 20; 4) Aralığı uzunluğu = 60-80. Çok uzun eğer tasarımcı için segmente RNA kırın. Tekrarlar veya geniş homoloji bölgeleri atlayın. </li><li> 3-prime sonunda BiotinTEG ile Sipariş anti-sense DNA probları. </li><li> RNA boyunca konumlarına göre Etiket sondalar. &quot;Hatta&quot; havuzu tüm problar numaralandırma 2, 4, 6, vb içerir ve &quot;tuhaf&quot; havuz 1 numaralandırma probları, 3, 5 içerecek şekilde iki havuz ayırın, vb 100 uM konsantrasyonu problarla havuzu sulandırıp -20 ° C&#39;de mağaza </li><li> Bütün deneyler kullanılarak yapılacak olanbirbirleri için iç kontroller olarak hizmet hem havuzları,. Prob özgü sesler her havuz için benzersiz olacağını ise Gerçek RNA-bağımlı sinyal, hem havuzlarından mevcut olacaktır. Bu cıvıldamak-qPCR ve cıvıldamak-seq her ikisi için de geçerlidir. </li></ol> 2. Hasat Hücreleri Cıvıldamak deney için kullanılacak olan hücreler toplanır. <ol><li> Doku kültürü plaka veya konfluense için matara hücreleri büyümek. Fosfat ile durulayın kez (PBS) tamponlu ve trypsinize. Hücreleri çıkarmak ve tek hücre süspansiyonu haline tekrar süspansiyon aşağı, medya&gt; 2x hacmi ile pipet tripsin kadar gidermek ve. 50 ml Falcon tüp içine tüm medya ve süspanse hücreler aktarın. 20 milyon hücreler tipik bir örnek cıvıldamak için yeterlidir. </li><li> 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Gerekirse PBS 40 ml aspirat ortam ve Pastör pipetiyle 40000000 hücreleri, tüpler birleştirmektedir. 4 dakika 800RCF hücrelere Spin. Durusu PBS, dikkatli bir açı kalan sıvı üzerinde aspire. </li></ol&gt; 3. Cross-Link Hücre ve Hücre Pelet toplayın Crosslink RNA-Kromatin etkileşimleri korumak ve hücre pelletini hazırlamak için glutaraldehitle hücreleri toplanır. <ol><li> Oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 PBS içinde% glutaraldehid hazırlayın. 10 milyon hücre (0.4 mL% 25 gluteraldehit stok + 9.6 ml PBS) başına 10 ml hazırlayın. Glutaraldehyde taze kullanılması gerekir. </li><li> Pelet çıkarmak için Falcon tüpler alt dokunun. Pastör pipetiyle hücre pelletini% 1 gluteraldehit ile, parçalar önlemek için küçük bir hacim ile başlayan, daha sonra tam hacmine kontör. Karıştırmak için ters çevirin. Uçtan uca çalkalayıcı veya rotator üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika süreyle çapraz bağ. </li><li> 5 dk için oda sıcaklığında 1.25 M glisin 1/10th hacmi ile çapraz bağlama reaksiyonu Quench. </li><li> 5 dakika 2000RCF döndürme. 20 mL 5 dakika 2000RCF dönüyor, bir kez PBS ile soğutulmuş süpernatan ve yıkama pelet aspire. </li><li> W aspire edin ve tekrar süspansiyonküllendirilmekte, çapraz bağlı pelet 20000000 hücre başına 1 ml PBS ile soğutulmuş. Dikkatli pipet ile mümkün olduğunca çok PBS çıkarın 4 C&#39;de 3 dakika 2000RCF bir Eppendorf tüp ve spin her ml aktarın. </li><li> -80 Sıvı nitrojen ve mağaza içinde hücre pelletleri Flash dondurmak ° C süresiz. </li></ol> 4. Hücre Lizis Hücre lizatı hazırlamak için, çapraz bağlı hücre parçalayan. <ol><li> Oda sıcaklığında dondurulmuş hücre pelletleri çözünmesi. Hücre pelletini çıkarmak ve karıştırmak için sert dokunun. 4 3 dakika ° C için 2000RCF de pelet aşağı Spin Kalan PBS kaldırmak için keskin bir 10 ul pipet kullanın. </li><li> Elektronik denge (1mg doğru) boş bir Eppendorf tüp dara kütlesi Açık (bizim tüpler çok tutarlı 1.060 gram ağırlığında). Her pelet tartılır ve ağırlığı kaydetmek. Çapraz HeLa hücre tam 15 santimlik genellikle 100 mg ağırlığındadır. </li><li> Fres ile Supplement Lysis Buffer (pelet 10X kitle, 100mg örneğin 1 ml)h Proteaz İnhibitör, PMSF ve Superase-in (ekli tampon listesine bakınız). İyice karıştırın. </li><li> Her tüpe 10X hacmi ilave Lizis Tampon ekleyin ve pelletini. Küçük saçmalar için &lt;250 ul takviye lizis tamponunda tekrar süspansiyon 25 mg. Süspansiyon düzgün olmalıdır. Değilse, 500 ul kısma süspansiyon bölmek ve öbekler kırmak için motorlu bir pelet karıştırıcı kullanınız. Sonikasyon hemen geçin. </li></ol> 5.. Sonikasyon Çapraz bağlı hücre lizatları sonicating tarafından Kesme DNA. <ol><li> 15 ml Falcon tüplerinde Bioruptor hücre lizatı sonikasyon. Her bir tüp içinde &lt;1.5 ml lizat kullanın ve daha hızlı sonication için, bir defada en fazla iki tüp ses dalgalarına maruz. </li><li> Nabız aralıklarında KAPALI 45 saniye, 30 saniye AÇIK ile yüksek ayarda bir 4 ° C su banyosunda sonikasyon. Her 30 dakikada Lizat kontrol edin. Hücre lizatı artık tortulaşmış kadar sonicating devam etmektedir. Bu kadar az 30 dakika olarak ve birçok 4 saat kadar sürebilir. Numarasıtüpler, örnek hacmi, banyo sıcaklığı ve sonication süre süreci ne kadar uzun sürdüğünü etkileyecektir. Tüpler olasılıkla farklı hızlarda ses dalgalarına maruz, bu yüzden birlikte homojenlik sağlamak için orijinal tüpler içine her 30 dakikada bir ve yeniden dağıtma onları havuzundan olacaktır. Not: glutaraldehit-çapraz bağlı hücreleri formaldehit muadillerine göre ses dalgalarına maruz uzun ölçüde alır. </li><li> Lizat net döndüğünde, taze bir Eppendorf tüpüne 5 uL lizat aktarın. 90 uL DNA Proteaz K (PK) Buffer (tampon listesine bakınız) ve 5 uL PK ekleyin. Vortex karıştırın ve kısa süre basılı dönmeye. 50 azından 45 dakika süreyle inkübe ° C. </li><li> Qiagen PCR saflaştırma kiti ile DNA ayıklayın. Zehir 30 uL Qiagen Elüsyon Buffer (EB) DNA ve% 1 agaroz jel üzerinde DNA boyutunu kontrol edin. DNA yayma dökme 100-500 bp olması durumunda, sonication tamam olmaktadır. Eğer yoksa, ses dalgalarına maruz devam etmektedir. </li><li> 4 azından 10 dakika süreyle 16100RCF azından sonike örnekleri santrifüje ° C. Sıvı nitroge için 1 mL örnekleri ve flash-donma içine süpernatantlar, tablet birleştirinn. -80 ° C de saklayınız </li></ol> 6. Cıvıldamak Bağlı kromatin RNA ve izole etmek için biyotinile DNA probları melezler. <ol><li> Oda sıcaklığında kromatin Çözülme tüpleri. </li><li> (Kromatin ml başına 2 ml hazırlamak, tampon listesine bakınız) Hibridizasyon Tamponu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. </li><li> Lizat 1 ml kullanarak tipik bir cıvıldamak örnek için, Eppendorf tüpleri DNA INPUT ve yer için RNA INPUT ve 10 uL 10 uL kaldırın. Daha fazla kullanmak kadar buz üzerinde tutun. </li><li> 15 ml Falcon tüpüne 1 mL kromatin aktarın. Her tüpe 2 mL Hibridizasyon Tamponu ekleyin. Toplam hacim için &lt;1.5 ml Eppendorf tüpleri kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında probları çözünmesi. Eğer uzun süreli olarak kullanılan değilseniz, miktarını kontrol etmek için Nanodrop sondalar (100 uM sondaları gerektiği spec ~ tek iplikli DNA ayarını kullanarak 500-600 ng / ml). Özel borular (1 ml kromatin başına 100 pmol probu, 1 ml kromatin başına 100 uL / ​​pmol probu 1 uL) problarla uygun hacimde ekleyin.İyice karıştırın. Çalkalama ile 4 saat için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 20 dakika için geri kalan ile melezleştirme, C-1 manyetik boncuklar (4 ° C de muhafaza) hazırlanır. Probların 100 pmol başına 100 mcL kullanın. 1 ml unsupplemented Lizis Tampon ile tampon ayrı boncuk DynaMag-2 mıknatıslı şerit kullanarak üç kez yıkayın. </li><li> Lizis Tampon orijinal hacminin Pastör pipetiyle boncuklar; taze PMSF, PI ve Superase-in eki. 4 saat hibridizasyon Reaksiyon tamamlandıktan sonra, her tüpe 100 uL boncuklar ilave edin. İyice karıştırın. Çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> (Örnek başına 5 mL) Yıkama solusyonu hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. 37 öncesi sıcak ° C Kullanmadan önce PMSF ekleyin. </li><li> 1 ml yıkama tamponu ile beş kez yıka boncuklar. Ilk yıkamada, 1 ml yıkama tamponu ayrı boncuk, aktarmak ve Pastör pipetiyle için DynaMag-15 manyetik bant kullanın. 1,5 ml Eppendorf tüpüne hacmi aktarın. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sonraki yıkar, bir minicentrifuge her tüp aşağı spin, 1 dakika DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde örnekleme ayarlayın. Örnek boşaltmak, 1 ml yıkama tamponu içinde yeniden süspanse bir Kimwipe, herhangi bir damlalar mendil. 5 dk için çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Toplam beş yıkama için tekrarlayın. </li><li> Son yıkama anda, iyi boncuklar tekrar süspansiyon. 100 uL çıkarın ve RNA izolasyonu için kenara koyun. DNA fraksiyonu karşılığı 900 uL. DynaMag-2 manyetik şerit üzerindeki tüm tüpler yerleştirin ve yıkama tamponu çıkarın. Kısaca aşağıya tüpleri Spin; mıknatıslı şerit üzerine koyun. Keskin bir 10 ul pipet ucu ile tamamen yıkama tamponu son bit çıkarın. </li></ol> 7. RNA İzolasyonu QRT-PCR ile quantitate cıvıldamak örneklerinden RNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> 100 uL boncuk örnekleri ve 10 uL RNA GİRİŞ örnek alın. GİRİŞ RNA 85 uL RNA PK Tamponu pH 7.0 ekleyin. 95 uL RNA PK Tampon pH 7.0 Pastör pipetiyle boncuk. Uçtan uca çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de 5 uL Proteinease K ve inkübe ekleyin. </li><li> Kısaca tüm tüpler aşağı spin ve95 az ısı blokta 10 dakika süreyle örnekleri kaynamaya ° C. </li><li> Buz örnekleri Chill, 10 saniye boyunca kuvvetlice 500 uL TRIzol, girdap ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. -80 ° C&#39;de saklayın veya 4. adıma geçin. </li><li> TRIzol muamele örnekleri ile 100 uL kloroform ekleyin. 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika için bir tezgah üstü santrifüj üzerine 16100RCF at Spin </li><li> Organik ve arayüz kaçınarak, ~ 400 uL sulu süpernatantı. </li><li> 600 uL (1.5 hacim)% 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. MIRNeasy Mini sütunlar aracılığıyla örnek Spin. GDK (MIRNeasy Mini kiti), üreticinin protokol başına RPE ile 2x 1x yıkayın. 30 uL nükleaz içermeyen H 2 O (nfH 2 O) ile Zehir. </li><li> RNA eluat üreticinin protokol başına DNA ücretsiz davranın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, 65, 15 dakika boyunca ısıtılması Örnek ° C&#39;de tamamen kalan DNase inaktive etmek için. </li><li> 1 uL RNA kullanın lncRNA onaylamak için QRT-PCR analizi için başına ve izolealma. GAPDH genellikle bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. </li></ol> 8. DNA İzolasyonu Sekanslamasıyla tanımlamak veya qPCR tarafından quantitate cıvıldamak örneklerinden DNA fraksiyonu ayıklayın. <ol><li> DNA Elüsyon Buffer (tampon listeye bakın), DNA GİRİŞ dahil numune başına 150 ul, hazırlayın. </li><li> Karıştırmak için 1 0μL RNaz A (10 mg / mL) ve 10 uL RNaz H (10 U / ml) DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ml&#39;de ve girdap ekleyin. </li><li> RNases DNA Seyreltme Tampon 150 uL boncuk her numune yeniden süspanse edin. (140 uL in Pastör pipetiyle DNA GİRİŞ) çalkalama ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Ayrı boncuk ve DynaMag-2 manyetik şerit üzerinde yüzer. Süpernatantı ve etiketli tüpler ekleyin. </li><li> 10 uL RNaz A (10 mg / mL) ve RNaseH (10 U / ml) tam olarak 8,2 yapılır) ile DNA Seyreltme Tampon maddesi ile ikinci bir alikotu hazırlayın. Her numune (DNA INPUT dahil), inkübe 150 uL ekleyin ve süpernatant çıkarın. Tüm supernatant (omuz toplayınd) ~ 300 uL olabilir. </li><li> Her numune için 15 uL PK ekleyin. Çalkalama ile 45 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Sarı faz kilidi jel tüpler (5PRIME) aşağı Öncesi dönerler. Faz-kilit jel tüpler için DNA örnekleri aktarın ve 300 uL PhOH ekleyin: numune başına İzoamil: Kloroform. 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır, ve 4 ° C sıcaklıkta 5 dk için 16100RCF bir tezgah üstü üzerinde aşağı doğru dönmeye santrifüj Üst (~ 300 uL) gelen sulu atın. 3 uL GlycoBlue, 30 uL NaOAc ve 900 uL% 100 EtOH ekleyin. Gece -20 ° C de ve mağaza karıştırın. </li><li> 4 azından 30 dakika süreyle 16100RCF azından örnekleri Spin ° C. </li><li> Dikkatli Durusu süpernatant. 1 ml% 70 EtOH ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 5 dakika 16100RCF döndürme. Pipet ile süpernatantı. Hava 1dk için kurulayın. 30 uL EB yeniden süspanse edin. </li><li> DNA örnekleri qPCR veya Illumina protokol başına yüksek verim sıralama kütüphaneler hazırlanması tarafından analiz için hazırdır. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 </strong&gt; cıvıldamak iş akışı gösteriyor. Başarılı bir cıvıldamak deneyi tipik olarak önemli ölçüde spesifik olmayan RNA üzerinde hedef RNA zenginleştirir. Şekil 2 GAPDH üzerinde HeLa hücreleri insan telomeraz RNA (TERC), bir negatif kontrol görevi gören bir bol hücresel RNA zenginleşme gösterir. GAPDH RNA sadece% 0.46 olarak alınmıştır ise hücrede yer TERC RNA&#39;lar (~% 88) çoğunluk ~ 200 kat bir zenginleştirme faktörü göstererek, cıvıldamak yaparak yıkıldılar. Gibi memeli hücreleri (Şekil 2) ile ifade değildir lacZ RNA, hedefleme probları gibi spesifik olmayan probları ilave negatif kontrol olarak kullanılabilir. Hedef lncRNA bağlamak için beklenen DNA bölgeleri genellikle qPCR tarafından ölçülen negatif bölgeler üzerinde zenginleştirilmiştir. Şekil 3 biz aynı hücre dizisinde cıvıldamak-seq yapılarak belirlenen birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında dört HOTAIR bağlı sitelerin qPCR doğrulama gösterir iken TERC ve GAPDH DNA bölgeleri senegatif kontrol bölgeler olarak RVE. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; sonda negatif bölgelerin, gerçek lncRNA bağlayıcı siteleri bir işaretidir boyunca beklenenden HOTAIR bağlı sitelerin vermiştir karşılaştırılabilir zenginleştirme ayarlar. Cıvıldamak zenginleştirilmiş DNA Yüksek throughput sıralama lncRNA bağlayıcı sitelerinin bir dünya haritası verir. Drosophila lncRNA roX2 dozaj telafisi için gerekli olan bir tarzda X-kromozom ile etkileşim olduğu bilinmektedir. Şekil 4, X kromozom bir bölümünün üzerine roX2 bağlanma profili gösterir. Her ikisi de &quot;düz&quot; ve &quot;tuhaf&quot; örnekleri dizisi edilmiş ve kendilerine özgü sesler üst üste gelen sinyaller bir parça üretmek için silinmiştir. Her bir &quot;zirve&quot; Burada roX2 bağlama güçlü bir site gösterir. Tüm takip ve roX2 hedef genlerin listesini Chu ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 2.011 17. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Cıvıldamak prosedürü Şekil 1. Akış şemasıDure. Tinile fayans probları lncRNA hedef melezlendi ve in vivo protein adducts ve kromatin kompleksleri katı yıkama izledi, manyetik streptavidin boncuklar kullanılarak saflaştırıldı edilir. Kromatin lncRNA çaprazlandı edilir. Biz A olası lncRNA bağlayıcı sırası turuncu şematize edilmiştir RNaz A ve H. bir kokteyl ile lncRNA bağlı DNA veya protein Zehir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Insan TERC RNA için Şekil 2. Cıvıldamak zenginleştirir. TERC-asDNA problar hücresel TERC RNA ve saptanamayan GAPDH arasında ~% 88 almak. LacZ-asDNA problar negatif kontrol olarak kullanıldı ve ne RNA&#39;lar almak edilir. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Şekil 3. Birincil insan HOTAIR cıvıldamak-qPCR içinEskin fibroblastlar. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ve ABCA2 HOTAIR etkileşim bölgeleridir. TERC ve GAPDH negatif kontrol olarak görev yaptı. Ortalama + SD gösterilmiştir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17 <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Şekil 4. SL2 Drosophila hücrelerinde roX2 RNA cıvıldamak-seq veri. &quot;Hatta&quot; ve &quot;tuhaf&quot; ayrı dizilenmisti.r; kendi veri hem de tek ortak zirveleri yansıtacak şekilde birleştirmek. Birleştirilen parça gösterilir. Daha önce Chu ve ark yayınlandı. 2011. 17

<ol>
	<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes.">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 142-148 (2010).</li><li>Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNAs:+insights+into+functions.">Long non-coding RNAs: insights into functions.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 155-159 (2009).</li><li>Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129, 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Kelley, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+spreading+of+the+Drosophila+dosage+compensation+complex+from+roX+RNA+genes+into+flanking+chromatin.">Epigenetic spreading of the Drosophila dosage compensation complex from roX RNA genes into flanking chromatin.</a> Cell. 98, 513-522 (1999).</li><li>Pandey, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kcnq1ot1+antisense+noncoding+RNA+mediates+lineage-specific+transcriptional+silencing+through+chromatin-level+regulation.">Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation.</a> Mol. Cell. 32, 232-246 (2008).</li><li>Wang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+maintains+active+chromatin+to+coordinate+homeotic+gene+expression.">A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression.</a> Nature. 472, 120-124 (2011).</li><li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol. Cell. 40, 939-953 (2010).</li><li>Meller, V. H., Wu, K. H., Roman, G., Kuroda, M. I., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=roX1+RNA+paints+the+X+chromosome+of+male+Drosophila+and+is+regulated+by+the+dosage+compensation+system.">roX1 RNA paints the X chromosome of male Drosophila and is regulated by the dosage compensation system.</a> Cell. 88, 445-457 (1997).</li><li>Franke, A., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rox1+and+rox2+RNAs+are+essential+components+of+the+compensasome,+which+mediates+dosage+compensation+in+Drosophila.">The rox1 and rox2 RNAs are essential components of the compensasome, which mediates dosage compensation in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 117-122 (1999).</li><li>Gupta, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+HOTAIR+reprograms+chromatin+state+to+promote+cancer+metastasis.">Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.</a> Nature. 464, 1071-1076 (2010).</li><li>Tsai, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+as+modular+scaffold+of+histone+modification+complexes.">Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.</a> Science. 329, 689-693 (2010).</li><li>Zappulla, D. C., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+flexible+scaffold+for+proteins:+yeast+telomerase+and+beyond.">RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.. 71, 217-224 (2006).</li><li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Air+noncoding+RNA+epigenetically+silences+transcription+by+targeting+G9a+to+chromatin.">The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin.</a> Science. 322, 1717-1720 (2008).</li><li>Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+chromatin+regulatory+interactions+in+vivo.">Long-range chromatin regulatory interactions in vivo.</a> Nature. 32, 623-626 (2002).</li><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Maps+of+Long+Noncoding+RNA+Occupancy+Reveal+Principles+of+RNA-Chromatin+Interactions.">Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions.</a> Mol. Cell. , (2011).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li></ol>

C. Chu ve HY Chang, bu yönteme dayalı bir patent başvurusu üzerine mucitler olarak adlandırılır.

Burada cıvıldamak-seq, in vivo lncRNA bağlayıcı siteleri genom içinde haritalama yöntemi tanımladı. Başarı için anahtar parametreleri oligonükleotid problar ve glutaraldehit çapraz döşeme arasında bölünmüş havuzları vardır. Afinite-prob tasarımı RNA dizisi verilen basittir ve RNA&#39;nın yapı veya fonksiyonel etki hiçbir ön bilgi gerektirir. İki tür üç oldukça farklı RNA&#39;lar - - roX2, TERC ve HOTAIR elde ettiğimiz başarılar cıvıldamak-seq birçok lncRNAs muhtemeldir genellenebilir olduğunu göstermektedir. Tüm deneylerde olduğu gibi, bakım ve uygun kontrollerin sonuçlarını yorumlamak için gereklidir. Farklı lncRNA koşulları titrasyonu ve bu farklı ilgi prob veya çapraz bağlayıcıların seçimi gibi koşullar, politikasıyla değişikliği gerektirebilir, RNA-kromatin etkileşimleri farklı yönlerini vurgulamak olabilir. ChIP-SEQ gibi, tüm bağlama olayları ille fonksiyonel olup, ek çalışmalar RNA o biyolojik sonuçlarını tespit etmek için gerekli olankromatin üzerine ccupancy. Yine de, binlerce 8,9 şimdi sayısı diğer kromatin ile ilişkili lncRNAs, araştırmacıları için bu teknolojinin pek çok ilginç uygulama öngörüyoruz. ChIP-seq DNA-protein etkileşimleri genom araştırmaları için kapıyı açtı gibi, &quot;RNA interactome&quot; nin cıvıldamak-seq çalışmaları biyoloji birçok yeni yollar ortaya çıkarabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Buffer List:</td></tr><tr><td colspan="4">Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Lysis Buffer:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads</td></tr><tr><td colspan="4">Proteinase K Buffer (for DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">Hybridization Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamide (store in the dark at 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">Wash Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Always add PMSF fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">DNA elution Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Table of specific reagents and equipment:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (EM grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Motorized pellet mixer</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696&quot;&gt;AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes (for sonication)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1 magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Elution Buffer (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Buffer kit</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Uzun kodsuz RNA gibi dozaj tazminat, basma, ve gelişimsel gen ekspresyonu 1,2,3,4,5,6,7 gibi önemli biyolojik süreçler için kromatin devletlerin anahtar düzenleyicileri vardır. Aracılık histon H3 lizin 27 trimethylation (H3K27me3), bir gen-spesifik kromatin devletlerin yönetiminde çok sayıda lncRNAs için geniş rolleri önerdiği gibi Polycomb Baskıcı Kompleksi 2 (PRC2) gibi belirli kromatin modifikasyonu kompleksleri ile birlikte lncRNAs binlerce son keşif moda 8,9. Bazı lncRNAs komşu genler üzerinde cis çalışmak için düşünülen, diğer lncRNAs uzaktan bulunan genleri düzenleyen trans çalışır. Örneğin, Drosophila lncRNAs roX1 ve erkek hücrelerin X kromozomu üzerinde roX2 bağlaması çok sayıda bölge ve dozaj tazminat 10,11 kritik öneme sahiptir. Ancak, bağlanma yerlerinin tam yeri yüksek çözünürlükte bilinmemektedir. Benzer şekilde, insan lncRNA HOTAIR h PRC2 doluluk etkileyebilirgenler genom 3,12,13, ama nasıl özgüllük elde edilir ve undreds belirsizdir. LncRNAs aynı zamanda birden fazla protein komplekslerinin birleşmesini işe modüler iskele olarak hizmet verebilir. Klasik trans-etkili RNA iskele 14 karmaşık telomeraz için şablon ve iskele olarak hizmet TERC RNA; HOTAIR de PRC2 için bir iskele ve 13 karmaşık bir H3K4 demetilaz olarak hizmet verebilir. Kromatin RNA doluluk haritalama Önceki çalışmalar önemli anlayışlar 15,16 olduğu ancak bir seferde sadece tek bir gen de var. En lncRNAs ve doluluk siteleri bilinmemektedir ve kromatin yönetmelikte lncRNAs rolleri çoğunlukla lncRNA pertürbasyon dolaylı etkilerinin olayla edilmiştir. Kromatin immünopresipitasyon mikroarray veya derin sıralama (sırasıyla ChIP-çip ya da ChIP-seq) tarafından takip ettiği gibi büyük bir genomik ölçekte protein-DNA etkileşimleri anlayışımız geliştirdi, burada bir recen göstermektly yüksek çözünürlükte 17 uzun RNA doluluk genom haritası için strateji yayınladı. Sonra birkaç yüz üsleri çözünürlükte genomik bağlama bölgelerinin bir harita oluşturur antisens oligos, döşeme tarafından kromatin kompleksi: RNA Arıtma (chirp) (Şekil 1), bu yöntemi, Kromatin İzolasyon hedef lncRNA bir afinitesi yakalama dayanmaktadır yüksek hassasiyet ve arka plan düşük. Afinite-prob tasarım RNA sekansı verilen basittir ve RNA yapısı ya da işlevsel etki hiçbir bilgi gerektirdiğinden cıvıldamak birçok lncRNAs için de geçerlidir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP at JoVE.com

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Cıvıldamak uzun kodsuz RNA&#39;lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

86.0K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

Video: Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Genetik

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Biyoloji

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...