This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.

NOT: Protokol Kudüs İbrani Üniversitesi hayvan bakım yönergeleri takip eder. ACSF Çözüm 1. Hazırlık <ol><li> Su ya da uygun bir NaCI ilavesiyle ~ 300 mOsm / L ozmolarite getiren, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi. ACSF çözelti hazırlayın GKD 2 O 1 L (&gt; 18 M saflık) konur. </li></ol> 2. Ekipman ve Oda Kurma Kokain kaynaklı lokomotor davranış izlenmesi için donatım bir iç ışık kaynağı, fan ve kamera (veya kızılötesi sensörler) ile kablolu davranış odaları (50 x 45 cm) oluşur ve bir iç pleksiglas kutu (30 x 30 cm) olarak ile donatılmıştır bu fareler, lokomosyon takip edilmektedir serbestçe dolaşımına izin verildi. Davranışsal testler normal bir aydınlık / karanlık döngüsünde, ışık önce 1 saat için ışıkları sonra 1 saat arasında kapalı yapılmalıdır. Hayvanlar her gün aynı zamanda sürekli olarak eğitilmesi gerekmektedir. <ol><li&gt; Izleme ve farelerin lokomotor davranışını kayıt için uygun bir sistem fotoğraf makinesi veya kızılötesi sistemi bağlayın. </li><li> Koku işaret önyargı önlemek ve uygun dezenfeksiyon sağlamak için, fare imkan ve / veya koku kaldırarak ayıracı tarafından sağlanan dezenfektan ile her deneme sonrasında odaları temizleyin. </li></ol> ÖNEMLİ: tutarken farenin, sessiz, sakin ve dikkatli olun. 3. Hayvan Hazırlık <ol><li> Evi 5 C57BL6 erkek fareler; standartlara ve yerel Animal gereklerine göre, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve su ücretsiz erişim ile bir odada kafes başına (6-12 haftalık ağırlığı ~ 25-35 gr), Komite rehberlik ve protokolleri önemsiyorum. Deney başlamadan önce, fareler tartmak ve veri giriş. Kokain sonra farelerin ağırlığına göre tatbik edilmektedir. </li><li> İlk deneme başlamadan önce davranışsal oda 30 dakika içine fare içeren tüm kafesleri aktarın. </li><li> Her alıştırmakDeneyde kullanılan farenin, enjeksiyonları taşıma ve davranış kurulumunda izlenmesi deneyci. , Aşağıda tarif edildiği gibi 250 ul tuz çözeltisi, 3 günlük ardışık intraperitonal enjeksiyon ile elde edilir. </li><li> 250 ul serum fizyolojik intraperitoneal uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, 15 dakika boyunca lokomotor aktivitesini izlemek için bir davranış odasına fare. Her gün aynı saatte, 3 gün üst üste bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Dördüncü gün, iki gruba fareler bölmek. Tuzlu su içinde 2 mg / ml kokain bir stok çözelti hazırlayın. (- 30 gr fare 300 ul alacaksınız ise, 250 ul enjekte 25 g fare için örneğin) fare ağırlığına göre deney grubuna kokain solüsyonu (son 20 mg / kg) tek bir enjeksiyon yönetmek. Kontrol grubuna tuzlu su uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, lokomotor aktivite izleme (konan tipik bir davranış odası içinde 20 dakika boyunca fare yermüttefiki, ilk 15 dk) izlenmektedir. </li><li> Kokain enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında (enjeksiyonu takip eden 0, 1, 2, 4, 8 ve 24 saat) fareler kurban. Önemlisi, referans farenin (0 zaman noktası) Bu gün herhangi bir enjeksiyon almazsınız emin olun. Nedeniyle önemi, bu referans grubunun çoğaltır dahil etmek zorunludur. </li></ol> Nucleus accumbensde 4. Diseksiyon <ol><li> Kokain / tuzlu su enjeksiyonundan sonra uygun bir zamanda fareler izofluran ile anestezi. Izofluran direkt odadan dışarı tahliye edilmelidir. Bu nedenle, işlem, bir kimyasal buhar başlığı içinde yapılmalıdır. </li><li> Arka ayak refleks testi ile anestezi derinliği izlemek. Hayvan tarafından bir geri çekme yanıtı ortaya çıkarmak için pençe sıkıştırın. Bir refleks gösteren, bir hayvan anestezi cerrahi seviyesinde ve bir devlet euthanize değildir. </li><li> Beynin Ekstraksiyon: <ol><li> Dekapitasyon yoluyla fare öldürülür. </li> &lt;li&gt; kafatasının merkezi üzerinde deri çıkarın ve keskin bir makas ile kafatası kesti. </li><li> Omurilik beyin (foramen magnum) girdiği noktada makas yerleştirin ve iki yan keser. </li><li> Aynı noktadan, sagital sütür boyunca uzun bir sagital kesim yapmak. Sola ve sağa koku ampul, klip ulaştıktan sonra. </li><li> Bir forseps, üzerine basın veya beyin zarar vermemeye özen sıkıca kafatasının her yarısını tutup yanına çekerek, dikkatlice kafatası çıkarın. </li><li> Ters bir mikro kaşık spatula ile kranial sinirler kesilmesinin ise beyin çıkarın. </li></ol></li><li> Soğuk ve sertleşmeye 1-2 dakika için bir buz-soğuk çözelti içinde ACSF beyin yerleştirin. </li><li> Rostral parçası Vibratome sahneye, yukarı bakacak şekilde, ACSF beyin çıkarın kağıt havlu ile fazla sıvıyı fitilieyeceklerdir, beyincik ve beyin geri kalanı arasında bir koronal kesim oluşturmak ve beyin tutkal. </li><li> NAC Kesme: <ol&gt; <li> Vibratome dilimleme odasında buz soğuk sıcaklıklarda ACSF çözümler koruyun. Nukleus accumbensde (NAC) kadar 200 mikron en bölümünde açıkça Paxinos ve Franklin Fare Beyin Atlas (bregmaya yaklaşık 1,8 mm anterior göre belirlenmiştir; korpus kallosum, ön komissürün yeri ve şekli şekline dikkat ve ventriküller, aynı zamanda beyin kesitinin genel morfolojisi). Bu noktada, NAC disseke edileceği iki 400 mikron bölümleri oluşturmak. </li><li> Stereoskop altında, dilimlerden NAC bölgeyi incelemek için ince bir bıçak kullanın. NAC tanımı Paxinos ve Franklin fare beyin atlas göre ve uygun doku üzerinde bıçağın dört çabuk geçer tarafından uygun bölümlerde disseke edilebilir. (Şekil 2). </li><li> Hemen NAC bölümler mikrosantrifüj tüp ve mağaza 900 ul Trizol parçalama reaktifi -80 ° C&#39;de RNA ekstra ha kadar yerleştirineylemi. </li></ol></li></ol> 5. RNA Ekstraksiyon ve cDNA Ters Transkripsiyon <ol><li> Çekirdeğini içeren tüpler oda sıcaklığında Trizol liziz reaktif maddesi bölümleri akumbens çözülme ve doku, tamamen homojenize (en az 15-20 kat) altında olana kadar 25 G iğne bağlı 1 ml&#39;lik şırınga ile homojenleştirin. İlk birkaç tur zordur ve iğne ucu girebilir küçük parçalara kırmak amacıyla tüpün duvarına karşı doku itme gerektirir. </li><li> Homojenliği sağlamak için, 1 dakika için 12,000 xg&#39;de QIAshredder küçük spin kolon ve santrifüj içine lizat pipetleyin. </li><li> Pipet yeni mikrosantrfuj tübüne lizat ve üreticinin talimatlarına uygun olarak RNA ekstrakte edin. Kullanılana kadar -80 ° C&#39;de RNA saklayın. </li><li> , RNA konsantrasyonunun ölçülmesi, bir Bioanalyzer veya eşdeğer ekipman kullanarak bütünlüğünü ve kalitesini analiz. R ile cDNA hazırlanması her tur için 100-500 ng RNA kullanınandom heksamer primerleri. </li></ol> 6. Primer Tasarım ve Astar Testi <ol><li> İyi astar seçimi: mRNA QPCR için optimal bir primer çifti için, bu gereksinimleri (Şekil 3) izleyin: <ol><li> 17-28 bazdan daha artık içeren Tasarım astarlar. Onlar mispriming teşvik gibi nükleotid tekrarlar kaçının. </li><li> 56-68 ° C (optimal olarak 60-64 ° C) arasında erime sıcaklığı (Tm) ile tasarım astarlar. Primer çifti olan Tm birbirinden 1 ° C arasında olması gerekir. </li><li> Ürün boyutu ideal 80 ve 150bp arasında olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Genomik DNA, kirletici yükselmesini önlemek için, primerlerden en az biri, bir ekson-ekson bağlantısını kapsamaktadır, ya da amplikon (intron kapsayan), büyük bir intronu içerdiğinden emin olun. </li><li> Astar tasarımını geliştirmek için (örnek için bakınız Tablo 2) Primer3 dayalı güvenilir bir yazılım kullanmak. </li></ol></li><li> Pr Testimers: primerlerin özgünlüğünü ve verimlilik sağlamak amacıyla, bir kontrol QPCR Reaksiyon yapılmalıdır: <ol><li> (Tüm ilgili primer çiftleri için cDNA şablonu ihtiva eden) pozitif bir örneğini kullanabilir ve cDNA titre (örneğin 10 ng ~ bir başlangıç ​​konsantrasyonunda, sekiz üç-kat seyreltme) çift paralel reaksiyonlarda. Reaksiyon için kullanılan çözeltiler içindeki kirlenme kontrol eden herhangi bir şablon kontrol, içerir. </li><li> (- 1 / eğim) -1 10 () x 100, uygun eğim eğrisi gibi olduğu - 3.333 (örneğin, 10 (1 - / 3.333) = 2) (Şekil 4): aşağıdaki formül kullanılarak astar verimi olarak hesaplanır. </li><li> Amplifikasyonun özgüllüğünün belirlenmesi. Spesifik amplifikasyon ise hedef dışı amplifikasyon açık bir sapma fr olarak görünür, amplifiye edilmiş ürünlerin erime eğrilerinin her ortak tek bir önemli zirve ile ortaya konmuşturtek bir büyük zirve om. </li></ol></li></ol> 7. QPCR Analizi <ol><li> Ön amplifikasyon: <ol><li> Kapsamlı QPCR analizi, primer çiftlerinin çok sayıda RNA sınırlı bir miktar paralel sorgulama dayanmaktadır. Bu nedenle, ön amplifikasyon bir adım gereklidir. Bu adımda, cDNA (800 primer çifti kadar) ileride örnek sorgulamak için kullanılacak olan tüm bir primer karışımı ile ön-amplifikasyon 14-18 döngülerine maruz kalmakta. </li><li> Spesifik Hedef Güçlendirmesi (STA) için 50 mcM TE (düşük EDTA) tüm primerler sulandırmak. </li><li> Havuz birlikte 50 uM primerin tüm 1 ul alikotları 800 deneyleri kadar, STA tepki olarak dahil edilmesi için ayarlar. </li><li> Tablo 3 de tarif edildiği gibi. STA için ön karışım hazırlayın ve örnekleri amplifiye gereken numune sayısı% 110 için bir karışımını hazırlayarak hata için izin verir. </li><li> Her numune için Tümbölen 3.75 ul STA ön karışımı. 1.25 ul ekleHer cDNA. </li><li> Vortex 10 saniye boyunca tepkileri ve santrifüj karıştırın. </li><li> Tablo 4 &#39;de gösterildiği gibi, bir termal döngü cihazı ve döngüde STA reaksiyonları yerleştirin. </li></ol></li><li> Ekzonükleaz I (ExoI) tedavisi: <ol><li> Tablo 5&#39;te gösterildiği gibi Ekzo I seyreltin. </li><li> Her 5 ul STA tepki seyreltilmiş ExoI (4 U / ml) 2 ul ekleyin, girdap, 37 ° C&#39;de bir termal döngü içinde (6.000 xg&gt;) aşağı spin ve yer ° C de 30 dakika ve daha sonra 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de. </li><li> Test için uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir son ürünleri. Kullanım TE Tampon (7 ul TSA numuneye 43 ul TE tampon eklemek). </li><li> -20 ° C&#39;de seyreltilmiş STA ürünleri saklamak veya hemen kullanın. </li></ol></li><li> QPCR Primer ve örnek kurulumu: <ol><li> Tablo 6&#39;da gösterildiği gibi. Örnekleri hazırlayın deney için seçilen çipine göre bir karışımı hazırlanmakta ve uygun örnekleri ekleyin. </li><li> Agi20 sn minimum örnek Mix çözümleri oluæturma ve santrifüj (&gt; 6,000 xg) en az 30 sn. Çip yükleme için hazır olana kadar hazırlanmış reaksiyonları 4 ° C sıcaklıkta kısa süreli saklanabilir. </li><li> Tablo 7&#39;de tarif edildiği gibi deneyler hazırlayın. </li><li> Tüm bileşenleri yavaşlamalarını en az 30 saniye boyunca 20 sn ve santrifüj (&gt; 6,000 xg) en az tahlil karışımı çalkalayın. ÖNEMLİ: iyice karıştırın ve santrifüj çip girişlerinin içine pipetle önce tüm örnek ve tahlil çözümleri. Bunun yapılmaması veri kalitesinde bir azalmaya neden olabilir. NOT: Her bir primerin son konsantrasyonu girişindeki 5 uM ve son reaksiyonda 500 nM&#39;dir. </li></ol></li><li> Astarlama ve Dinamik Array IFC (entegre akışkan devre) yongası yükleniyor. IFC çip (fig mikroakışkan odaları basınç altında tutmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı (mineral yağ) için örnekler ve deneyler için girişleri yanı sıra, belirtilen giriş delikleri (akümülatörlerin) var) 4A yeniden. <ol><li> Çip her akümülatörüne kontrol hattı sıvı enjekte. </li><li> Çıkarın ve çip altından mavi koruyucu filmi atın. </li><li> Uygun IFC denetleyicisi içine yerlestirin (kontrolör MX 48.48 Dinamik Dizi IFC veya 96.96 Dinamik Dizi IFC için IFC denetleyici HX), daha sonra 48.48 Dinamik Dizi IFC veya Başbakan (136x) için Başbakan (113x) komut dosyasını çalıştırın Başbakan çip için 96.96 Dinamik Dizi IFC için komut. </li><li> Komut dosyası tamamlandığında, IFC kumandadan Astarlanmış çipi çıkartın. </li><li> Pipet her kontrol Mix 5 ul ve girişlerinde içine her Numune Mix 5 ul. </li><li> IFC denetleyiciye çip dönün. </li><li> IFC kontrolör yazılımı kullanarak, 48.48 Dinamik Dizi IFC için yük Mix (113x) komut dosyasını çalıştırın) veya 96.96 Dinamik Dizi IFC yonga içine örnekleri ve tahlilleri yüklemek için Mix (136x) komut dosyası yüklenemedi. Yük Mix komut dosyası tamamlandığında, yük kaldırmaIFC kumandadan ed çip. </li><li> Erime eğrisi analizi de dahil olmak üzere, (üretici kurallarına göre), yeni bir yonga çalıştırmak oluşturmak, termal döngü çip yükleyin. Termal döngü yazılımı kullanarak, reaksiyon odaları düzgün tanındığından emin olmak için, ve reaksiyon tamamlanma çalışmasına izin. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Kalite güvencesi: Veri kalitesini sağlamak (yukarıda açıklandığı gibi) seyreltme eğrileri ele alarak primerlerin kalitesini doğrulamak için. Amplikonların erime eğrileri görüntüleyerek amplifikasyonun özgüllüğünün Monitör, optimal olarak en yüksek noktalar 29 sıkı bir şekilde hizalanmalıdır. </li><li> Görselleştirme: yüksek verimlilik QPCR ile elde edilen büyük miktarlarda veri görselleştirme için kullanın ve yazılımları ekspresyon renk kodlu yoğunluğu olan, Heatmaps oluşturulur. Buna ek olarak, kaplı saçılım gibi, tek genlerin transkripsiyonel dinamiklerini gösterir. </li><li> Yayın: yayıncılıktagen ifade sonuçları, onun alaka, doğruluk, doğru yorumlama, ve tekrarlanabilirlik sağlamak için QPCR deney için rapor edilmelidir asgari ayrıntılı bilgiyi, kantitatif Real-Time PCR deneyleri yayınlanması için MIQE Yönergeleri takip etmek tavsiye edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling.">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li><li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF-ERBB+signalling:+towards+the+systems+level.">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity:+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage.">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li><li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+addiction.">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li><li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction.">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li><li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence.">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li><li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine.">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li><li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychology+and+neurobiology+of+addiction:+an+incentive-sensitization+view.">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, S91-S117 (2000).</li><li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+an+addiction+memory.">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li><li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction:+from+actions+to+habits+to+compulsion.">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li><li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addicted+human+brain:+insights+from+imaging+studies.">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li><li>Carlezon, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB.">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li><li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine.">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li><li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments.">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li><li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity.">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li><li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction.">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction+and+the+brain:+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence.">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+&amp;+practice+perspectives+/+a+publication+of+the.">The neurobiology of cocaine addiction. Science &amp; practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li><li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation.">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li><li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction.">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li><li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving.">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li><li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+environments,+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system.">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li><li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex.">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).</li><li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex.">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li><li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+wanting:+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior.">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li><li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells.">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Davranışsal paradigmaların ardından beyin dokusundan gen ifadesinin başarılı karakterizasyonu bağlıdır: davranış paradigması sırasında farelerin 1) dikkatli elleçleme; Ilgi doku 2) Hızlı ve hassas diseksiyon; 3) RNA emniyetli önlemler RNA bütünlüğünü sağlamak için; ve 4) primerleri ve deneysel dikkatli planlama düzeni gibi QPCR analiz için hazırlanırken detaylara hassas ve dikkat. Tarif edilen prosedüre amacı, davranış deneyim ile indüklenen transkripsiyon...

Beynin dinamik bir organizasyon bilişsel ve davranışsal esneklik sağlar. Deneyimler beyindeki 3 nöronlar arasındaki bağlantıların yapısı ve gücü değişiklikleri ile kodlanmıştır. Bu &quot;tecrübeye bağımlı plastisite&quot; sinaptik yapı ve mukavemet 4 modifikasyonu için gerekli proteinleri içerir gen ifadesinin spesifik örneklerine indüksiyon sonucudur. Uzun vadeli anıların oluşmasına aracılık gen düzenleyici ağların tanımlanması transkripsiyonel programların egemen unsurlarının tespiti için bellek oluşumunu, yanı sıra hedefler düzenleyen temel ilkeler içgörü sağlayacağı beklentisi ile, moleküler nörobilim merkezi ilkelerinden biridir nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların tedavisi. Transkripsiyonel programlar d önemli olan farklı karakter genleri kodlayan her biri, geçici olarak tanımlanmış dalgalar açılmaksinyal olayı 1,2 sonucu uygulanmasında ifferent aşamaları. Bu kaynaklı genlerin tam bir tamamlayıcı belirlemek ve onların indüksiyon dinamiklerine göre potansiyel fonksiyon içgörü kazanmak şekilde, ayrıntılı bir zamansal zaman ölçeği üzerinde transkripsiyonel dinamiklerini ele nedenle önemlidir. Madde bağımlılığı, beyin 5,6 nöral devrelerinde kötüye kullanılan ilaçların uzun süreli etkileri neden tecrübeye bağımlı plastisite sağlam bir şeklidir. Ilaçlara ilk akut maruz bağımlılık gelişmesinde ve kronik kullanımına geçişe yol açabilir. Bağlamsal bilgi bağımlılık gelişiminde çok önemli bir unsurdur. İlaç-ilişkili çevresel ipuçları uyuşturucu bağımlısı zihninde önem atanır. Ilaç özlem nüksü uyarabilir geçmiş ilaç deneyim bir ilaç istismarı hatırlatan bağlamsal bilgiler hatta uyuşturucu maruz 7,8 kaçınmanın uzun süre takip.Dolayısıyla bağımlılığı büyük klinik meydan - yoksunluk belirtileri 9 yatıştıktan sonra bağımlılarının eğilimi hatta uzun nüks. Kokain Davranışsal sensitizasyon uyuşturucu bağımlılığı mekanizmalarının çalışma yararlı kokain deneyimi basit bir modeldir. Kötüye kullanılan ilaçların kronik olarak maruz kalmak neden olduğu uzun süreli sensitizasyon bu yaygın olarak incelenmiş modelinde kemirgen önce salin enjeksiyonları (karın içinden, IP) alışık olan yeni bir ortamda (kendi lokomotor aktivite kontrol edildiği bir açık alan odası) ; onların etkinliği 10 (Şekil 1) takip edilmektedir, sonra onlar açık alanda odalarına kokain günlük enjeksiyonu yapılır. Bu davranış genellikle bir paradigma sapık oluşumunu gösteren, kokain enjeksiyonları kesilmesini takiben aylık bir süre için muhafaza edilmektedir (8-12 kat başlangıç ​​etkinliği ile elde edilmiş) Hareket davranışında, 11, sağlam bir sensitizasyon sonuçlanırilaç deneyim Asive bellek iz. Doğal bir türün başarısı (örneğin beslenme, cinsiyet) için gerekli davranışları takviye katılan ödül nöral devreler, ilaç ilişkili davranışları 12,13 güçlendirmek için ilaç kötüye tarafından istismar edilmektedir. Kötüye kullanılan ilaçların tecrübesi arttınlır edildiği, moleküler ve hücresel mekanizmalar, başka beyin yapılarında 14 açıklayıcı bir ya da semantik bellek oluşumu altında yatan mekanizmaların benzer görünmektedir. Bu nedenle, davranışsal sensitizasyon modelinin sağlamlığı o deneyim-bağımlı plastisite mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistemi yapar. Nükleus akumbens (NAC) beyin ödül devresinin bir merkezi birleştiricidir ve yoğun bağımlılığı 5,6 gelişmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bağımlılığı oluşumu nukleus accumbensde yeni proteinlerin transkripsiyonu bağlıdır ve sağlamaçıkça yapılandırılmış transkripsiyon programları duction kokain deneyimi 15-19 aşağıdaki NAC görülmektedir. kokain maruz kalma akut transkripsiyonel tepkisi güçlü indüksiyon uyarana uyum ve yeni proteinlerin üretimini yönlendirmek için birden fazla düzeyde çalışması için muhtemel olduğunu ilaç 6,19-22 maruz bırakılarak kaynaklanan yapısal değişiklikler ve elektrofizyolojik sorumludur. Beyinde tecrübeye bağımlı plastisite moleküler mekanizmalarının çalışmasını sağlamak amacıyla, bir protokol davranış manipülasyon beyin doku örnekleri transkripsiyon dinamiklerinin kapsamlı analizi için tarif edilmiştir. Transkripsiyonel analizi için mikro-akışkan dinamik bir dizi kullanarak, kokain davranışsal duyarlılaşma - protokol Citri laboratuarda araştırılmıştır davranış deneyim bağlamında görüntülenmiştir. Açıklanan protokol belli t okuyan bunlarla sınırlı değildiro davranışsal duyarlılaşma bağlamında accumbens nükleusuna, davranış paradigmalar ve beyin bölgelerinin çok sayıda uygulanabilir. Aslında, bu protokol beyin dışında, vücut dokularına tatbik edilebilir, ve deneyimlerin veya organizmanın çeşitli manipülasyon incelenmiştir. Protokol kabaca dört aşamada ayrılır. Birinci aşamada, hayvan davranış paradigma tabi tutulur; İkinci aşamada doku microdissected olduğu; Üçüncü aşamada - mRNA tersine transkripsiyon yapılmış, saflaştırılmış ve problandı ve son aşamada veriler analiz edilir. Transkripsiyonel dinamiklerini okuyan kapsamında, deneyim hassas zamanlama ve tanımı kontrol etmek en önemli deneysel parametreler muhtemelen. Bu nedenle, tercih edilen modeli, bu davranışsal kokaine davranışsal duyarlılaşma, deneyimi sağlanan parametreleri üzerinde kontrol deneyi ile yüksek düzeyde sağlayan bir sistem ile ilgilidirce. Deneyim-bağımlı plastisite veya bellek oluşumu farklı modeller hassas zamanlama sağlamak ve ele Ek davranışsal paradigmalar vardır. Bu modeller korku klima 23, akut çevresel zenginleştirme 24,25, roman nesne keşif 26 ve karanlık yetiştirme 27 aşağıdaki görsel deneyim içerir. Yine, kokain davranışsal sensitizasyon sürekli güçlü davranışsal manipülasyon kokain deneyimi 28 aşağıdaki ay süren oldukça yaygın bellek izleme oluşturma, olduğunu. Beyin çekirdeği accumbensde manuel mikrodiseksiyonu takip kesilir. Hızla hazırlanan beyin dilimleri el ile mikrodisseksiyon davranışsal paradigma ilgili dokuyu çıkarma en güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar ki bizim deneyim olmuştur ve tecrübesi ile, doku sınırları tanınan kolayca belirgin hale gelirler. Seçenek olarak ise, ince dilimler HAZIRLIK olabilirlazer yakalama mikrodiseksiyon takip ed. Bu yöntem son derece ilgi bölgenin sınırlarının çizilmesini tanımlanan sağlar karşın, (böylece kararsız mRNA kaybetme riski) sıkıcı yavaş ve masraflı özel ekipmanları (lazer yakalama kurulumu ile donatılmış bir mikroskop) gerektirir. Burada tanımlanan protokol, yama pipetler, 29 kullanılarak görsel olarak tanımlanmış olan hücrelerin sitoplazması elle aspirasyonu ile, tek hücreli bir transkripsiyonel analizi için adapte edilebilir. Bu çoğu durumda, doku içindeki hücrelerin sadece bir alt popülasyonu, aslında deneyimine yanıt katılan son derece olasıdır, ancak tarif edilen protokolü bir popülasyon ortalama sağladığını belirtmek önemlidir. Bu deneyimi yanıt belirli bir hücre popülasyonları içinde bir seçici bir şekilde transkripsiyonu profile ilgi olduğunu, ancak bu yaklaşımların tartışılması geçerli kapsamı dışındadır. MRNA Saflaştırma için, ters transkripsiyon ve QPCR sorgulama, dokuticari olarak temin edilebilir kitlerin kullanılması ile ve ardından ince iğneler boyunca geçirilmesi ile bozulur (Daha fazla bilgi için, bakınız Tablo 8). Seçim yüksek kaliteli RNA ve alt uygulamaları sağlam sonuçların güvenilir çıkarılmasını sağlamak, bu metodolojiler, deneyim tarafından bilgilendirilir. Protokol kullanılarak dinamik bir dizi yüksek verimli QPCR için tarif edilmiş olmasına rağmen, numuneler son nokta PCR, düşük verimlilik qPCR, gen ifadesi ya da derin mikrodizileri dizileme, gen ekspresyonu için incelenebilir. Yüksek verimli QPCR kullanılarak dinamik bir dizi için tercih mRNA davranış paradigmaların ardından genellikle sınırlayıcı miktarda olan beyin çekirdekleri elde olmasından kaynaklanmaktadır. Dinamik diziler tek bir deneyde paralel örneklerin çok sayıda transkript etkili bir biçimde analiz sağlayan bir platform sağlar. Mikroakışkan sisteminin ilk iktisabı (genellikle kurumsal bir pu sonrarchase), deney çalıştırmak için nispeten ucuzdur. Bu analizden sonra, örneklerin daha da sorgulanması dinamik diziler kalite güvencesi için kapsamlı bir referans sağlayan (mikrodiziler veya RNAseq) tarafından yeni transkript aramak için daha maliyetli platformları kullanarak yapılabilir. Son olarak, veri analizi için, standart yaklaşımlar kullanılmaktadır. Ortaya çıkabilecek sorunları ile ilgili özel işaretçileri protokol metninde ele alınacaktır. Bu protokol birden fazla koşul ve çoğaltır okuyan kendi ilgi sisteminin kapsamlı bir soruşturma ilgilenen araştırmacılar için en uygundur. Protokolü de zaten onlar defalarca sorgulama ilgilenen ilgi 50-500 genlerin, bir alt kümesine (microarray veya RNAseq deneyler aracılığıyla) honlanmış bazı araştırmacılar için en uygun olanıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="453">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Virusol</td>
			<td>Oriek Medical</td>
			<td>J29D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>MINRAD INC</td>
			<td>NDC 60307-110-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>73404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>AB-4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>1355656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Perspex box (30X30cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and video recorder</td>
			<td>Campden Inst</td>
			<td>CMD-80051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Recorder software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>NDS-NMR3-00M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST-14062-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagital Brain slicer with a 0.5mm section</td>
			<td>Brain Tree Scientific</td>
			<td>BS-AL-505S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microspun spatula</td>
			<td>Bochem Instrument GmbH</td>
			<td>3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD Reader</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic array Chip for 96.96gene expression</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive analysis of transcription dynamics from brain samples following behavioral experience

Beyin ve uzun vadeli anıları konsolidasyon deneyimleri kodlama gen transkripsiyonu bağlıdır. Kodlama deneyim spesifik genlerin işlevini belirlenmesi moleküler nörobilim ana hedeflerinden biridir. Ayrıca, belirli davranışları ile tanımlanan genlerin fonksiyonel dernek nöropsikiyatrik bozuklukların temelini anlamak için etkileri vardır. Güçlü transkripsiyon programları indüksiyonu çeşitli davranışsal manipülasyonlar ardından fare beyinlerinde gözlenmiştir. Bazı genetik elemanların farklı davranış manipülasyonlar takip eden ve farklı beyin çekirdeklerinde tekrarlı kullanılmışsa da, transkripsiyon programları genel olarak uyaran uyarılara ve 1,2 incelenmiştir edildiği yapıya benzersizdir. Bu yayında, bir protokol davranışsal manipülasyon yanıt farelerin beyin çekirdeklerine sağlam ve kapsamlı transkripsiyon profilleme için tarif edilmiştir.Protokol Akut kokain deneyimi aşağıdaki akumbens çekirdekte gen ekspresyon dinamiklerin analiz bağlamında gösterilmektedir. In vivo deneyim tanımlanan bir sonraki hedef nöral doku disseke edilir; RNA, ardından arıtma için, çok hedefli genlerin geniş QPCR analizi için transkripsiyonu ve mikroakışkan dizilerin kullanımını ters. Bu protokol, küçük beyin numuneleri hatta tek tek hücreleri gibi kapsamlı analiz başlangıç ​​malzemesi, sınırlı bir miktar (50-500 genlerini adresleme) yönelikse. Protokol çok sayıda örneğin paralel analizi (örneğin, tek hücreler, ilaç aşağıdaki dinamik analizi, viral ya da davranışsal düzensizlikler) için en çok avantajlıdır. Ancak, protokol aynı zamanda mikrodiziler veya RNAseq tarafından tüm genom çalışmalarından önce numunelerin karakterizasyonu ve kalite güvencesi için hizmet, yanı sıra tam-genom çalışmalarından elde edilen verilerin doğrulama olabilir.

Bu protokolü uygulayarak elde edilen sonuçların kalitesi önemlisi, bir dizi parametre bağlıdır. Uygun deneysel planlama deney farelerinde minimal rahatsızlık, neden olur bu test deneyimi (bu örnekte, kokain maruz kalma olduğu) kendi yakın tarihin en dominant deneyim olacak ve bu nedenle sağlam ve belirli transkripsiyon yol açacağı programı. Şekil 1 çekirdeği farelerin disseke ve analiz edilmektedir akkumbens hangi kokain deneyim aşağıdaki zaman noktaları tanımlayarak, kokain dav...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience at JoVE.com

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Introduction to Psychology

Behavior

Unit 1

Motivation and Emotion

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays. 

Video: Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Davranış

Compensatory Limb Use and Behavioral Assessment of Motor Skill Learning Following Sensorimotor Cortex Injury in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. The present protocol describes a skilled motor task for use in mouse models of stroke. The Pasta Matrix Reaching Task functions as a versatile and sensitive behavioral assay that permits experimenters to collect accurate outcome data and manipulate limb use to mimic human clinical phenomena including compensatory strategies (i.e., learned non-use) and focused rehabilitative training. When combined with neuroanatomical tools, this task also permits researchers to explore the mechanisms that support behavioral recovery of function (or lack thereof) following stroke. The task is both simple and affordable to set up and conduct, offering a variety of training and testing options for numerous research questions concerning functional outcome following injury. Though the task has been applied to mouse models of stroke, it may also be beneficial in studies of functional outcome in other upper extremity injury models.

Mouse models have become increasingly popular in studies of behavioral neuroscience. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. This protocol describes the Pasta Matrix Reaching Task, which is a skilled motor task for use in mouse models of stroke.

İskemik İnme bir Fare Modeli Duyusal Cortex Sakatlık sonrasında telafi edici Ekstremite Kullanımı ve Motor Beceri Öğrenme Davranışsal Değerlendirme

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models ...

Transcranial Magnetic Stimulation for Investigating Causal Brain-behavioral Relationships and their Time Course

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily disrupt information processing in a brain region, generating a short-lived &#8220;virtual lesion.&#8221; Stimulation that interferes with task performance indicates that the affected brain region is necessary to perform the task normally. In other words, unlike neuroimaging methods such as functional magnetic resonance imaging (fMRI) that indicate correlations between brain and behavior, TMS can be used to demonstrate causal brain-behavior relations. Furthermore, by varying the duration and onset of the virtual lesion, TMS can also reveal the time course of normal processing. As a result, TMS has become an important tool in cognitive neuroscience. Advantages of the technique over lesion-deficit studies include better spatial-temporal precision of the disruption effect, the ability to use participants as their own control subjects, and the accessibility of participants. Limitations include concurrent auditory and somatosensory stimulation that may influence task performance, limited access to structures more than a few centimeters from the surface of the scalp, and the relatively large space of free parameters that need to be optimized in order for the experiment to work. Experimental designs that give careful consideration to appropriate control conditions help to address these concerns. This article illustrates these issues with TMS results that investigate the spatial and temporal contributions of the left supramarginal gyrus (SMG) to reading.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a technique for non-invasively disrupting neural information processing and measuring its effect on behavior. When TMS interferes with a task, it indicates that the stimulated brain region is necessary for normal task performance, allowing one to systematically relate brain regions to cognitive functions.

Nedensel Beyin-davranış İlişkiler ve Zaman Kursu araştırılması için Transkraniyal Manyetik Uyarım

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the necessary equipment is now available by several commercial companies. This protocol provides a detailed description of a two-way shuttle-box avoidance learning paradigm in rodents (here Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus) in combination with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical electrophysiological in vivo recordings. The detailed protocol is applicable to study multiple aspects of learning behavior and perception in different rodent species.
Site-specific ICMS of auditory cortical circuits as conditioned stimuli here is used as a tool to test the perceptual relevance of specific afferent, efferent and intracortical connections. Distinct activation patterns can be evoked by using different stimulation electrode arrays for local, layer-dependent ICMS or distant ICMS sites. Utilizing behavioral signal detection analysis it can be determined which stimulation strategy is most effective for eliciting a behaviorally detectable and salient signal. Further, parallel multichannel-recordings using different electrode designs (surface electrodes, depth electrodes, etc.) allow for investigating neuronal observables over the time course of such learning processes. It will be discussed how changes of the behavioral design can increase the cognitive complexity (e.g. detection, discrimination, reversal learning).

Shuttle-box avoidance learning is well-established in behavioral neuroscience. This protocol describes how shuttle-box learning in rodents can be combined with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical in vivo recordings as a tool to study multiple aspects of learning and perception.

Algı ve Öğrenme Eğitim bir aracı olarak Elektrofizyolojik Cortex Kayıt ve Stimülasyon ile Servisi-Box Eğitim Kombine

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Aracı Olarak vagus sinir stimülasyonu Extinction Öğrenme İlgili Pathways Plastisitesi tetikleyebilecek

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &#8211; Working Memory (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of working memory in young school-age children. Working memory deficits have been identified in children with language-based learning disabilities, including dyslexia1,2 and language impairment3,4, but it is not clear whether these children exhibit deficits in subcomponents of working memory, such as visuospatial or phonological working memory. The CABC-WM is administered on a desktop computer with a touchscreen interface and was specifically developed to be engaging and motivating for children. Although the long-term goal of the CABC-WM is to provide individualized working memory profiles in children, the present study focuses on the initial success and utility of the CABC-WM for measuring central executive, visuospatial, phonological loop, and binding constructs in children with typical development. Immediate next steps are to administer the CABC-WM to children with specific language impairment, dyslexia, and comorbid specific language impairment and dyslexia.

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &amp;#8211; Working Memory (CABC-WM)

Working memory predicts a significant amount of variance for a variety of cognitive tasks, including speaking, reading, and writing. However, few tools are available to assess working memory in children. We present an innovative, computer-based battery that comprehensively assesses different components of working memory in school-age children.

Çocuklarda Çalışma Belleğinin Değerlendirilmesi: Çocuklar için Kapsamlı Değerlendirme Aküsü - Çalışma Belleği (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of ...

Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, few studies have investigated the long-term effects of injury in rodent models of TBI. Shown here are behavioral measures that are well-established in TBI research for times early after injury, such as two weeks, until two months. Some of these methods have previously been used at later times after injury, up to one year, but by very few laboratories. The methods demonstrated here are a short neurological assessment to test reflexes, a Beam-Balance to test balance, a Beam-Walk to test balance and motor coordination, and a working memory version of the Morris water maze that can be sensitive to deficits in reference memory. Male rats were handled and pre-trained to neurological, balance, and motor coordination tests prior to receiving parasagittal fluid percussion injury (FPI) or sham injury. Rats can be tested on the short neurological assessment (neuroscore), the beam-balance, and the Beam-Walk multiple times, while testing on the water maze can only be done once. This difference is because rats can remember the task, thus confounding the results if repeated testing is attempted in the same animal. When testing from one to three days after injury, significant differences are detected in all three non-cognitive tasks. However, differences in the Beam-Walk task were not detectable at later time points (after 3 months). Deficits were detected at 3 months in the Beam-Balance and at 6 months in the neuroscore. Deficits in working memory were detected out to 12 months after injury, and a deficit in a reference memory first appeared at 12 months. Thus, standard behavioral tests can be useful measures of persistent behavioral deficits after FPI.

The goal of the behavioral tests presented here is to detect functional deficits in rats after traumatic brain injury. Four specific tests are presented that detect deficits in behaviors to reflect the damage to specific brain areas at times extending to one year after injury.

Travmatik beyin hasarı sonra Sıçanlarda algılama davranış açıkları

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper understanding of the neurobiological causes underlying the decision-making problems. A cost-benefit based T-maze task is used for measuring decision making in which rodents choose between a high reward arm (HRA) and a low reward arm (LRA). There are two paradigms of the T-maze decision-making task, one in which the cost is a time delay and the other in which it is physical effort. Both paradigms require a tedious and labor-intensive management of experimental animals, multiple doors, pellet reward, and arm choice recordings. In the current work, we invented an apparatus based on traditional T-maze with full automation for pellet delivery, door management and choice recordings. This automated setup can be used for the evaluation of both delay- and effort-based decision making in rodents. With the protocol described here, our lab investigated the decision-making phenotypes of multiple genetically modified mice. In the representative data, we showed that the mice with ablated medial habenular showed aversions of both delay and effort and tended to choose the immediate and effortless reward. This protocol helps to decrease the variability caused by experimenter intervention and to enhance experiment efficiency. In addition, chronic silicon probe or microelectrode recording, fiber-optic imaging and/or manipulation of neural activity can be easily applied during the decision-making task using the setup described here.

This article introduces an automated T-maze apparatus that we invented, and a protocol based on this apparatus for analyzing delay-based decision making and effort-based decision making in free moving rodents.

Otomatik bir T-maze cihazları ve protokol dayalı karar vermede gecikme ve çaba tabanlı ücretsiz taşıma kemirgenler çözümlemek için

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer&#039;s Disease, Using IntelliCage

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

Otomatik, Alzheimer hastalığının IntelliCage kullanarak, birden çok genetik modellerinde bilişsel işlevler için uzun vadeli davranış tahlil

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...