Bu çalışma Psikiyatri Max Planck Enstitüsü ve Avrupa Birliği Marie Curie İlk Eğitim Ağı (NINA Sözleşme 238.665) tarafından finanse edildi.

1. Erken Yaşam Sıkıntı ile Programlama Anne ayırma (MS) zamanlanmış-hamile C57BL/6N farelerde (doğum günü doğum sonrası günlük 0 (P0)) tarafından teslim Yavrularda erken yaşam stresinin (ELS) ikna etmek için yapılır. <ol><li> Bireysel yavrularına P1-10 3 saat için günlük (ısıtma yastığı ile) temiz kafeslere yerleştirilir. </li><li> Kontrol (non-ELS) yavru boyunca anne yuvada bozulmadan kalır. </li><li> Pups onlar standart laboratuvar hayvan barınağı koşullarında cinsiyet uyumlu gruplara (kafes başına 3-5 fareler) yerleştirilmiştir hangi zaman sonra (P21) sütten kadar anneleri ile birlikte tutulur. </li></ol> 2. Beyin Dokusu izolasyonu ve Diseksiyon <ol><li> . Fareler servikal dislokasyon Not istenilen yaşta öldürüldü: Bu protokol bir stres paradigma içerir, çünkü anestezi stres hormonları normal fizyolojik düzenleme girişimi önlemek için, servikal dislokasyon önce verilir. Skulls açtı ve olanbeyinleri -80 ° C&#39;de muhafaza edilmeden önce, izo-pentan-kuru buz batırılarak dikkatlice çıkarılır ve derhal ek dondurulur </li><li> Beyinler (10 mikron kalınlığında) cryosectioned vardır; bölümleri SuperFrost cam slaytlar üzerine monte edilir ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilir PVN - - rostral PVN, bregma düzeyinde başlayan bölümlerde toplamak bir standart fare stereotaksik atlas Referans (örneğin Paxinos 6) anatomik hassas doğrulamak ve ilgi bölgesi dahil (paraventriküler nükleus nöronların örneğin sağlamak için kullanılır -0,75 için -0,85). </li><li> Bölümler farklı beyin yapılarının tespiti kolaylaştırmak için cresyl violet ile boyandı edilir. Ilgi bölgelerin delgeçler (0.8 mm) (örn. PVN) loco mikrodiseksiyon olarak elde edilir. </li></ol> 3. Beyin zımba ile Nükleik Asit Ekstraksiyon Aynı anda küçük Nöroanatomik tanımlı beyin Tescil DNA ve RNA ayıklanması için optimize edilmiş bir protokolbisülfit ve gen ifadesi analizler için iyonları 7 tarif edilmektedir. Not: RNA GTC-Tampon DNA daha az istikrarlı olduğunu düşünecek olursak, RNA ilk işleme öneririz. DNA saflaştırılması için kullanılan Homojenat ve bu süre içinde oda sıcaklığında (RT) tutulabilir. <ol><li> Guadinyum tiyosiyanat (GTC) tamponu (4.5 M guadinyum tiyosiyanat,% 2 N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M, beta-merkaptoetanol,% 0.2 köpük önleyici bir 400 ul bir pipet ve zımbaların vortexer kullanılarak homojenize A) oda sıcaklığında, bir derialtı enjektörünün (29G) (Şekil 2) ile birkaç kez geçtikten. </li><li> Eşit parçaya bölünür Lizat; RNA ve DNA hem de özellikle deneysel gereksinimlerine bağlı olarak, ayrı ayrı aynı anda veya ekstre edilebilir. </li><li> Izoamil (24:1) ile Lizat: RNA saflaştırılması için NaOAc ile 1/10 hacim, 1 hacim AquaPhenol (Appligene) (pH 4) ve kloroform ile 1/2 hacim ekleyin. Gayretle her adımdan sonra Vortex veaequous faz% 70 EtOH eşit hacimde ilave;. 10 dak, santrifüj (4 azından 10.000 g&#39;de 20 dakika ° C) buz üzerinde inkübe </li><li> Bir RNA spin kolon (Macherey-Nagel örneğin Nucleospin RNA II) karışımı aktarın ve on-sütun DNaz-sindirim ve yıkama adımları (imalatçının protokolü takip) gerçekleştirmek; 25 ul H 2 O da Zehir RNA </li><li> DNA saflaştırılması için Qiagen DNeasy Kan ve Doku Kit optimize bir protokol kullanılır. Tampon AL eşit hacimleri ve% 100 EtOH, bir Spin Sütun santrifüj yükü (RT 10.000 gr az 1 dk) ile Lizat ve akış yoluyla atmak dengeye. </li><li> Sütun 5 ul RNAse (1 mg / ml) içeren 500 ul Tampon AW1 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Spin (10.000 gr az 1 dakika, RT) ve flow-through atın. </li><li> 500 ul Tampon AW2 ile sütun yıkayın, flow-through ve spin-kuru boş bir sütun (15.000 gr az 1 dk) atın. </li><li> Ekle önceden ısıtılmış (70 ° C) 70 az Tampon AE ve 10 dakika süreyle inkübe kolon ° C. (1 dakika santrifüj Zehir10.000 g), flow-through yeniden uygulamak ve santrifüj adımı tekrarlayın. </li></ol> DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Tipik bir PVN yumruk verimleri ~ 600 ng DNA ve RNA ~ 400 ng. Kantitatif PCR (qPCR) tarafından gen ifadesi analizi için, tipik olarak ters transkripsiyon reaksiyonunda RNA ~ 100 ng kullanımı. 4. Bisülfit Dönüşüm Sodyum bisülfit uracils olmayan metillenmiş sitozinleri dönüştürmek için kullanılmıştır. Buna karşılık, metillenmiş sitozinleri dönüşüm korunmaktadır. Bu nedenle, bisülfit PCR-amplikon nihai sekanslama tespit edilir tüm sitozinleri metillenmiş sitozinleri temsil eder. Bisülfit dönüşüm PCR analizinde sınırlayıcı bir faktör olabilir önemli DNA bozulması neden olur. , Sitozin dönüşüm maksimize DNA parçalanması azaltmak ve daha düşük sıcaklıklarda bile tek iplikli DNA korumak Optimize reaksiyon şartları kullanılarak elde edilebilirQiagen Kullanıcı EpiTect Bisülfit Kit. Elimizdeki ~ micropunches arındırılan DNA 200 ng bisülfit reaksiyonu için başlangıç ​​malzemelerinin örneği bir miktarda bulunur. Dönüşüm reaksiyonu verimini farklılıklar önlemek için, şablon DNA miktarının bir deney boyunca işlenen tüm örnekleri arasında sabit tutulmalıdır. Buna ek olarak, sırası non-dönüştürülmüş non-larını oranı inceleyerek dönüşüm etkinlik için gereken incelemiş okur. Bu oran% 98 fazla olmalıdır. Daha düşük değerler eksik veya yetersiz bisülfit dönüşüm gösterir ve altta yatan dizileri analize dahil edilmelidir. 5.. Bisülfit PCR <ol><li> Metil Primer Express yazılımı (; Tasarım bisülfit bisülfit dönüştürülür DNA (bakınız tartışma) özgü primerler sıralama <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Tr / ABD / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602.121) bu yardım ve pilot deneylerde optimal tavlama sıcaklıkları belirlemek için yardımcı olacaktır. </li><li> Aşağıdaki gibi PCR-Master-Mix (bir reaksiyon için) hazırlayın: 2.5 ul 10x PCR buffer 0.5 ul 10 mM dNTP 1 ileri ul 10 uM astar 1 ul 10 uM ters astar 0.125 ul Qiagen HotStart Taq Artı H 2 O ile 23 ul kadar doldurmak </li><li> Reaksiyon için 2 ul bisülfit ile tedavi edilen DNA ekleme. </li><li> Aşağıdaki koşullar kullanılarak amplifiye: 1 döngü 6 dakika 95 ° C 1 dakika 95 ° C&#39;de 45-50 döngüleri, optimal tavlama sıcaklığında 1 dakika, 1 dakika 72 ° C 1 döngüsü 5 dakika 72 ° C </li></ol> Amplikon büyüklüğü doğrulamak ve ticari olarak satılan bir temizleme PCR kiti (kullanılarak takip eden bağlama için geri kalan PCR reaksiyonu arındırmak için agaroz jel elektroforezi ile PCR ürün 7 ul analiz örneğin Macherey-Najel Nucleospin) ayıklayın. Ek istenmeyen bir PCR ürünleri elde edilmektedir durumda, jel saflaştırması tavsiye edilir. 6. Bisülfit Sıralama Tek bir klon okumaları dayandırılamaz Yüksek çözünürlüklü DNA metilasyon profilleri DNA metilasyon küçük değişiklikleri tespit ve tedavi (çevresel programlama) cevap veren düzenleyici bölgeler tanımlayabilir. Bisülfit sıralama işlemi üç ardışık çalışma adımları içermektedir. İlk olarak, önceden bisülfit PCR ile elde edilen PCR ürünleri, bir vektör içine bağlandı ve bakteriler dönüştürülür. İkincisi, tek klonlarından koloni PCR eklemek doğru boyutunu belirlemek için kullanılır. Üçüncü olarak, pozitif koloni PCR temizlenir ve Big-Boya dizi reaksiyona tabi tutulur. Temiz bir şekilde adım takiben, ürünlerin bir kılcal sıralayıcı elektroforezinde edilir. 6.1 Ligasyonu ve Dönüşüm Not: Biz rutin pGEM-T vektör cl kullanınoning kiti (Promega). Deneyimlerimize göre, klonlama verimliliği bağlandı edilecek ekleme doğruluğuna bağlıdır. Rekombinant klonların düşük sayılar art arda elde edilmesi halinde Farklı vektörler test edilmelidir. <ol><li> Ligasyon reaksiyonu ayarlayın: 5 ul 2x Ligasyonu Tampon 1 ul pGEM-T vektörü 1 T4-Ligaz ul 3 ul temizlenmiş PCR ürünü </li><li> 4 gece boyunca pipetleme ve inkübe tarafından tepki karıştırın ° C Not: Ligation aynı zamanda da oda sıcaklığında 1 saat boyunca gerçekleştirilebilir. 4 gece boyunca ligasyon, rekombinant klonların sayısını arttırmak için ° C tercih edilir. </li><li> Clean-up etanol yağış tarafından ligasyon ürünler: <ol class="lalpha"><li> 1 ul glikojen, 1 ul 3M NaAc ve sıvı azot içinde 1 dakika süreyle reaksiyona ligasyon ve çökelti 25 ul% 100 EtOH ekleyin. </li><li> Santrifüj (4 azından 30 dakika süreyle 15,0000 g ° C) ve süpernatant atılır. </li><li> 300 ul ile yıkayın% 70 EtOH ve santrifüj (4 azından 20 dakika süreyle 15.000 g ° C), RT (10 dakika) ve kuru süpernatan pelet atılır. </li><li> 10 ul H 2 O da Pastör pipetiyle pelet </li></ol></li></ol> Electrocompetent bakterilerde ligasyon ürün 6,2 Dönüşümü <ol><li> Buz üzerinde buz ve electrocompetent DH5α bakterilerin çözülme kısım üzerine ğutma elektroporasyon küvetler (1 mm genişlik). </li><li> Ligasyonu ürün temizledik 10 ul (yukarıya bakınız) 45 ul DH5α bakteri ekleyin ve küvet transfer. </li><li> 1.5 kV, 200 Ω, 15 uF bakteri Dönüşüm ve doğrudan darbe doğumdan sonra önceden ısıtılmış orta SOB 1 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle bakteri kurtarmak IPTG / X-Gal ile kaplanmış / ampisilin plakaları üzerine LB süspansiyon 100 ul yayılır. </li><li> 37 &#39;de bir gece plakaları ° C&#39;de inkübe </li></ol> 6.3 Colony PCR Not: Tek klonlarından Colony PCR ekler sağlamak için yapılırtahmin büyüklüğü. Mavi / beyaz tarama, ligasyon, oligomerik primer çiftlerinin birleşme veya kesildi PCR ürünleri sırasında istenmeyen rekombinasyon olayları Gecikmeli renk gelişimi Aksi taktirde hatalı sıralama sonuçlara yol açabilir. Biz rutin olarak klonlanmış ekler yükseltmek için T7 ve SP6 primerleri kullanmak; yaklaşık 150 bp ek vektör dizileri bu yaklaşımın sonuçları. T7 primerin bir sonraki adımda sekanslama reaksiyonda kullanılır. <ol><li> 96-plaka koloni PCR ayarlayın. Bir reaksiyon kullanın: 3 ul 2.5 mM MgCl2 2.5 ul 10x Taq tampon 1.5 ul 10 mM dNTP 2 ul 2.5 mM T7 astar 2 ul 2.5 mM SP6 astar 1 ul Fermentas Taq Polimeraz H 2 O ile 25 ul kadar doldurmak </li><li> / Kuyu ana karışımı içine her oyuğa 96-kuyulu plakanın 25 ul dağıtın. </li><li> PCR içine pipet ve daldırma ile plaka pozitif (beyaz) klon seçin. </li><li> Fol kullanarak Amplifyiyice silinir koşulları: 95 1 döngü 4 dk ° C 94 az 10 döngü 30 saniye ° C, 56 at 30 s 72 ° C ve 30 ° C&#39;de s 94 at 30 döngü 30 saniye ° C, 48 at 30 s 72 ° C ve 30 ° C&#39;de s 72 de 1 döngüsü 5 dak ° C </li><li> Bir jelde koloni PCR 5 ul yükleyin ve sağ ekleme boyutunu içeren reaksiyonlarının belirlenmesi. </li><li> İstenen amplikonlar içeren Colony PCR uygun ticari kit (Machery Nagel Nucleofast) kullanılarak temizlenir. </li></ol> 6.4 Big-Boya terminatör reaksiyon ve sıralama <ol><li> Big-Boya reaksiyon için Master karışımı hazırlayın. Bir reaksiyon kullanın: 1 ul H2O 0.5 ul Big-Dye reaktif 1.5 ul Sıralama tampon </li><li> Her iyi temizlenmiş koloni PCR ürün 2 ul ekleyin ve aşağıdaki parametreleri ile bir termalcycler üzerine tepki çalıştırmak için, ul / iyi bir 96-plakanın her kuyuya 3 dağıtın: 96 at 10 sn 35 ° C döngüleri, 5 s 50 at 60 ° C&#39;de ve 4 dakika ° C </li><li> Big-Boya reaksiyon ticari kit (Millipore Montage 96 Temizlik-Up Kit Sıralama) kullanılarak temizlenir ve kılcal bir sequencer (örneğin ABI 3100 DNA) işlenir. </li><li> Diziler BIQ Analyzer (analiz edilir <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) veya online araç Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) İncelenen DNA bölgesi (Şekil 4) metilasyon paterni türetmek için. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar AVP ifade ve metilasyon durumu hakkında ELS etkisi hakkında fikir edinmek için, C57BL/6N fareler yukarıda açıklanan iş akışına uygun olarak işlendi. Kısaca, C57BL/6N farelerin bir grup olduğu sKontrol grubu ellenmeden bırakılmaktadır iken ELS&#39;ye ubjected. Tek bir zımba ile PVN ve supraoptik çekirdeğin (SON) delikli edildi ve DNA ve RNA eşzamanlı olarak izole edilmiştir. RNA ters transkripsiyonu edildi ve AVP transkriptlerin seviyeleri qPCR analizi ve HPRT ve GAPDH temizlik genlerinin ifadesi için normalize ile ölçüldü. DNA avp artırıcı (Şekil 4a) ve PCR ürünleri için spesifik primerlerin ile amplifiye, bisülfit, işlemden geçirilmiş klonlanmış ve dizilenmisti.r. Her bir fare / PCR en az 20 rekombinant klonlar PCR amplikon (Şekil 4b) içerdiği CpG&#39;ler için metilasyon frekansları belirlemek için analiz edilmiştir. Kontrollere göre, ELS epigenetik erken yaşam deneyimleri ile bu düzenleyici bölgenin işaretleme düşündüren AVP zenginleştiricinin CpG10, CpG12, CpG13 ve Cpg14 (p &lt;0.05, n = 6-8 hayvanlar) de önemli bir hipometilasyonu bağlı. Of PVN, metilasyon aksineAVP arttırıcı epigenetik işaretlemesi (Şekil 4c) OĞLU gösteren doku özgüllüğü ELS etkilenmedi. CpG10 ve AVP gen ekspresyonu kontrol hayvanlarında az DNA metilasyon durumunun analizi (n = 6) AVP gen ekspresyonu (Şekil 4d) ince ayar DNA metilasyon bir role işaret eden bir negatif korelasyon gösterdiği. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Şekil 1. Micropunches kontrol ve erken yaşam vurguladı farelerin diseke beyinleri elde edilmektedir. Bisülfit tedavi edilen DNA amplifiye edilir ve saflaştırılmış ürün beyaz / mavi seçimi tarafından rekombinant klonlarının uygun bir vektör içinde klonlanmış izin tanımlama iken DNA ve RNA izolasyonu takiben, gen ekspresyonunun QRT-PCR ile belirlenir. Doğru uç boyutları ile doğrulanırönce bir kapiller sıralayıcı Big-Boya reaksiyonu ve işlemlerden geçirmek için koloni PCR. Metilasyon desen uygun yazılım araçları tarafından görüntülenmiştir vardır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Şekil 2. DNA / RNA ekstraksiyonu bisülfit sıralama için Timeline. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Şekil 3. DNA ve RNA eş zamanlı olarak çıkarılması için Akışı. Paraventricularis hipotalamik nükleus, beyin bölgesini ifade küçücük bir avp gen, bir yumruk bir şırınga (29G) geçerek, 400 ul GTA tampon yerleştirilir kesintiye kadar vortekslenmiş ve daha homojen hale getirilir. Homojenat sonra RNA ve DNA saflaştırılması için ayrılır. Bölünmüş 1:1 olduğu veya bağlı olarak farklı oranlarda olabilirÖzellikle deneysel soru. Homojenat birkaç saat içinde işlenmelidir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Şekil 4. 6 haftalık kontrolü ve ELS hayvanlarda AVP lokustaki CpG metilasyonu. (A) ve AvP oksitosin genler yönelik kuyruk-kuyruk Şema ve intergenik bölgesi (IGR) ile ayrılır. Ekzon açık (numaralı) kutuları tasvir ediliyor. CpG kalıntı dağılımı gösterilir ve boyut ve CpG14 için CpG 10 içeren ilgili PCR amplikon pozisyonu kalın bir çizgi ile işaretlenir. (B) kontrolü ve ELS hayvanlarda PVN in AvP artırıcı madde metilasyon (n = 6-8). Kontrolü ve ELS hayvanlarda SON (n = 8-10) içinde AvP artırıcı madde (C) metilasyon. (D) avp gen ekspresyonu korelasyonCpG10 de metilasyon (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility.">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li><li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis:+Early+life+decides.">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li><li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li><li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress.">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li><li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockm&#252;hl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+learn+from+stress:+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression.">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , (2008).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314 (2011).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation.">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Epigenetik programlama giderek önemli bir mekanizma altta yatan sağlık ve hastalık olarak kabul edilmektedir. Burada micropunches ve bisülfit sıralanması yoluyla DNA metilasyon profilleri elde etmek için sonraki adımları DNA ve RNA aynı anda izolasyonu için zarif bir yöntem sunuyoruz. Optimize bir iş akışı çevresel uyaranlara yanıt olarak beyindeki epigenetik programlama rahat analiz sağlar. Ayrıca bu yaklaşım hem aynı örnek analiz edilir, DNA metilasyon ve gen ekspresyonu arasındaki fonksiyonel ilişkinin araştırılması kolaylaştırır. Son olarak, deney için gerekli hayvan sayısı önemli ölçüde düşürülebilir. Sunulan iş akışı yaparken bazı önlemler ve kurallara uyulmalıdır. Metilasyon ve ifade desen bir hücre ve doku spesifik bir şekilde değişebilir yana olağanüstü karmaşıklığı ve beyin heterojenliği göz önüne alındığında ve bu derece taşıyorönemli olduğu micropunching standart bir tarzda gerçekleştirilir. Noktasında bir olgu olarak, AVP epigenetik programlama paravaventriuclar tespit edilir, ancak supraoptik çekirdeğinde (Şekil 4b-d), iki avp hipotalamus 4 bölgeleri ifade. Bu bağlamda, aynı doku delikli DNA ve RNA mevcudiyeti RNA belirli doku spesifik bir işaretleyici gen ifadesi doğru alanı delikli olduğunu teyit, bazı durumlarda da kullanılabilmektedir olarak avantajlıdır. Micropunching hücresel heterojenite azaltabilir rağmen, bu yaklaşım tek hücre tipleri veya popülasyonlarının izolasyon neden olmadığını akılda tutulmalıdır. Ek saflaştırma adımları bu konu ele düşünülebilir. PCR amplifikasyonu için aşağıdaki bisülfit tedavisi için uygun primer tasarımı sekanslama bisülfit esastır. Uzunluğu 400 bp aşan PCR ürünleri b DNA&#39;nın bozulması nedeniyle sorunlu olabilirisulfite tedavi. Ayrıca, yalnızca, birkaç bozulmadan şablon amplifikasyon sürece katkıda bulunuyor ise iç içe PCR yanlı sonuçlar verir not edilmelidir. Modifiye amplikon için spesifik olan primer çiftleri olarak tasarlanmış olması gerekir; bunların sekansları metilasyon-yanlı amplifikasyon önlemek için CpG dinucleotides içermemelidir. Buna ek olarak, primerler değiştirilmemiş ya da tam olarak dönüştürülür DNA amplifikasyon önlemek için non-CpG sitozinleri içermelidir. Bazı şablonlar Amplifikasyon Sıcak-start PCR iletken yararlanabilir. Değerli örneklerin deneysel bozulmasını önlemek için şekilde, her durumda, primer çiftleri uygunluğu Pilot deneylerde kontrol edilmelidir. Güvenilir bir şekilde ve tam bir allel spesifik şekilde 8 tek CpG kalıntılarının metilasyon tespit edebilmektedir olarak bisülfit sıralama siteye özgü metilasyon analizi için standart bir yöntem temsil eder. PCR ürününün doğrudan sıralama karışık metilasyon o olarak tavsiye edilmezfa CpG kalıntı ilgili yerinde metilasyon miktarının önleyebilir Elektroforegramda bir C / T çift tepe gibi görünecektir. Bu nedenle bir ara klonlama adımı yapılır ve birkaç klonlar metilasyon kapsamını belirlemek için (~ 20-30) dizilerek. Pyrosequencing DNA metilasyon ölçmek için alternatif bir yöntem temsil eder. Ayrıca, bisülfit dönüştürme ve bisülfit PCR fakat bunun yerine klonlama ve amplikon bir CpG kalıntı metilasyon durumu kolaylıkla belirlenebilir bir C / T, tek nükleotid polimorfizm olarak okunur doğrudan bir pyrosequencing tepkimeye tabi tutulur ve sekanslama kullanmaktadır. Her iki yöntem de metilasyon 9 benzer düzeylerde saptamak ancak klonlama adım atlanabilir yana pyrosequencing daha fazla zaman verimlidir. Bununla birlikte, şablon bağlı olarak, sadece 40-100 nükleotidleri farklı sekanslama astar ile pyrosequencing birkaç tur gereklidir, böylece bir kerede dizisi yapılabilir. Bu THA göz önüne alındığında, kritik bir sınırlama yokturDNA t yüksek miktarda (reaksiyon başına yaklaşık 1 mikrogram) küçük beyin dokusu yumruklar edinilebilir tutarları aşan öngörülebilir, hangi gereklidir. Böylece pyrosequencing tarafından birkaç kilobases aralığında bölgeler ilk tarama tek bir klon okuma olarak az uygundur görünür. Bununla birlikte, faiz pyrosequencing küçük bir bölgenin tespiti üzerine takip düşünülmelidir. Toplu olarak, yukarıda tarif edilen protokol epigenetik değişiklikler için beyin micropunches hızla ve düşük maliyetli bir analiz için doğru, verimli ve akıcı bir yaklaşım sağlar. Çoklu örnekleri, tek bir çalıştırma işlenir ve ara ölçekli denemeler örnekler çalıştırırken yöntemler uygundur edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td> Bisülfit Kit Epitect </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Özü </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T klonlama kiti vektör </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sıralama Temizlik-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq Polimeraz </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq Polimeraz </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

Diyet maruz kalmak, hayatın 1,2 duyarlı pencereleri sırasında ilaçlar ve erken yaşam sıkıntı fizyolojik ve davranışsal fenotipleri ekran katkıda gen ekspresyonu kalıcı değişikliklere yol açabilir. Bu tür çevresel programlama metabolik, kardiyovasküler ve ruhsal hastalıklar 3,4 duyarlılığı artırmak olasıdır. DNA metilasyon ve histon modifikasyonları gen-çevre diyalog arabuluculuk önemli süreçler olarak kabul edilir ve çevresel programlama 5 underlay da görünür. Memelilerde, DNA metilasyon tipik CpG dinucleotides bağlamında sitosin ve 5-pozisyonunda bir metil grubu ile kovalent ek içerir. CpG metilasyonu bu hücresel heterojenite yüksek olduğu ve doku miktarı sınırlı beyin ayrık, küçük bölgelere çalışmak için bir meydan okuma yapan bir yüksek doku ve hücre-spesifik bir şekilde oluşur. Dahası, because gen ekspresyonu ve metilasyon olayları yakından bağlantılıdır, artan değer aynı örnek iki parametreleri karşılaştırılarak elde edilebilir. Burada, beyinde epigenetik programlama soruşturma için bir adım-adım protokolü (Şekil 1) amaçlıdır yaşamın erken sıkıntının &#39;anneden ayrılma&#39; paradigması kullanılarak sunulmaktadır. Protokolü, böylece aynı örnek DNA metilasyonu ve gen ifadesi analizleri sağlayan DNA ve RNA eşzamanlı olarak izole edilebileceği farklı şekilde yaşlı fare beyinlerinden micropunches hazırlanmasını açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain at JoVE.com

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Psychiatry. Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Video: Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Nörobilim

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...