This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.

NOTA: Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della Hebrew University di Gerusalemme. 1 Preparazione della soluzione ACSF <ol><li> Preparare la soluzione ACSF come descritto nella Tabella 1. Fare 1 L in DDH 2 O (&gt; 18 MW purezza), portando osmolarità a ~ 300 mOsm / L con adeguata aggiunta di acqua o di NaCl. </li></ol> 2 Attrezzature e Camera Set Up L&#39;attrezzatura per il monitoraggio del comportamento motorio indotta dalla cocaina è composto da camere di comportamento (50 x 45 cm) cablati con una fonte di luce interiore, ventilatore e la macchina fotografica (o sensori a infrarossi), e dotato di una scatola di plexiglas interna (30 x 30 cm) in che i topi possono muoversi liberamente, mentre la loro locomozione è monitorato. Il test comportamentali deve essere effettuata tra 1 ora dopo luci per 1 ora prima luci spente, su un normale ciclo luce / buio. Gli animali devono essere formati in modo coerente alla stessa ora ogni giorno. <ol><li&gt; Collegare la fotocamera o il sistema a infrarossi ad un adeguato sistema per il monitoraggio e la registrazione del comportamento motorio dei topi. </li><li> Pulire le camere dopo ogni prova con disinfettante fornito da impianto di mouse e / o la rimozione di odori reagente, al fine di evitare pregiudizi spunto olfattiva e per garantire la corretta disinfezione. </li></ol> IMPORTANTE: Durante la manipolazione i topi essere tranquillo, calmo e attento. 3 Preparazione degli animali <ol><li> Casa 5 C57BL6 topi maschi (6-12 settimane; ~ 25-35 g di peso) per gabbia, in una stanza con una luce di 12 ore / ciclo scuro e libero accesso a cibo e acqua, secondo le norme e requisiti di Animal locale Cura guida e protocolli Comitato. Prima di iniziare l&#39;esperimento, pesare i topi e registrare i dati. La cocaina viene successivamente somministrato in base al peso dei topi. </li><li> Trasferire tutte le gabbie contenenti topi nella comportamentale stanza 30 minuti prima di iniziare la prima prova. </li><li> Abituare tutti itopi utilizzati nell&#39;esperimento di sperimentatore manipolazione, iniezioni e monitoraggio nel setup comportamento. Ciò si ottiene 3 consecutivi iniezioni intraperitoneali giornaliere di 250 microlitri di soluzione salina come descritto di seguito. </li><li> Somministrare un&#39;iniezione intraperitoneale di soluzione fisiologica 250 ml. Subito dopo l&#39;iniezione, posizionare il mouse in una camera di comportamento per monitorare l&#39;attività locomotoria per 15 min. Ripetere questa operazione per 3 giorni consecutivi, alla stessa ora ogni giorno. </li><li> Il quarto giorno, dividere i topi in due gruppi. Preparare una soluzione stock di cocaina a 2 mg / ml in soluzione fisiologica. Somministrare una singola iniezione di soluzione di cocaina (finale 20 mg / kg) al gruppo sperimentale in base al peso del mouse (ad esempio per un 25 g topo - iniettare 250 ml, mentre un 30 g topo riceverà 300 microlitri). Somministrare soluzione salina al gruppo di controllo. Subito dopo l&#39;iniezione, posizionare il mouse per 20 minuti in una camera di comportamento per il monitoraggio delle attività locomotoria (typicalleato, i primi 15 minuti sono monitorati). </li><li> Dopo l&#39;iniezione di cocaina, sacrificare i topi a diversi intervalli di tempo (0, 1, 2, 4, 8 e 24 ore dopo l&#39;iniezione). Soprattutto, assicurarsi che i topi di riferimento (0 virgola tempo) non riceveranno alcuna iniezione in questo giorno. Per la sua importanza, è indispensabile includere repliche del gruppo di riferimento. </li></ol> 4 dissezione del nucleo accumbens <ol><li> Anestetizzare i topi con isoflurano al momento opportuno dopo l&#39;iniezione di cocaina / soluzione salina. L&#39;isoflurano deve essere ventilato direttamente fuori dalla stanza. Pertanto, la procedura deve essere eseguita in una cappa. </li><li> Monitorare la profondità dell&#39;anestesia testando il riflesso del piede posteriore. Pizzica la zampa di ottenere una risposta recesso da parte degli animali. Un animale che mostra un riflesso non è a un livello di anestesia chirurgica e non in uno stato di eutanasia. </li><li> Estrazione del cervello: <ol><li> Euthanize il mouse per decapitazione. </li> &lt;li&gt; Togliere la pelle sopra il centro del cranio e tagliare il cranio con le forbici affilate. </li><li> Inserire le forbici nel punto in cui il midollo spinale entra nel cervello (forame magnum) e fare due tagli laterali. </li><li> Dallo stesso punto, fare un lungo taglio sagittale lungo la sutura sagittale. Giunti al bulbo olfattivo, clip a sinistra ea destra. </li><li> Con una pinza, rimuovere il cranio con attenzione, cogliendo ogni metà del cranio saldamente e tirando di lato, facendo attenzione a non premere sul o danneggiare il cervello. </li><li> Rimuovere il cervello mentre recidere i nervi cranici utilizzando un cucchiaio rovesciato micro spatola. </li></ol></li><li> Mettere il cervello in una soluzione ACSF ghiacciata per 1-2 minuti per raffreddare e indurire. </li><li> Rimuovere cervello dal ACSF, dello stoppino liquido in eccesso con un tovagliolo di carta, di creare un taglio coronale tra il cervelletto e il resto del cervello e incollare il cervello, con la parte rostrale rivolta verso l&#39;alto, sul palco vibratome. </li><li> Taglio del NAc: <ol&gt; <li> Mantenere soluzioni ACSF a temperature gelide nella camera di taglio del vibratome. Sezione a 200 micron fino a quando il nucleo accumbens (NAc) è chiaramente identificato in base alla Paxinos e Franklin mouse cervello Atlas (circa 1,8 mm anteriormente al bregma, prestare attenzione alla forma del corpo calloso, la posizione e la forma della commessura anteriore e i ventricoli, così come la morfologia complessiva della sezione cervello). A questo punto, creare due 400 micron sezioni, da cui il NAc verrà sezionato. </li><li> Sotto uno stereoscopio, usare una lama di sezionare l&#39;area NAc fuori dalle fette. La definizione del NAc corrisponde alle Paxinos e Franklin atlante cervello di topo, e potrebbe essere convenientemente sezionato in apposite sezioni da quattro passaggi veloci della lama sul tessuto. (Figura 2). </li><li> Posizionare le sezioni NAc immediatamente in 900 microlitri Trizol reagente di lisi in una provetta e conservare a -80 ° C fino a RNA estrazione. </li></ol></li></ol> 5. RNA Estrazione e cDNA Reverse Transcription <ol><li> Scongelare le provette contenenti nucleo accumbens sezioni Trizol lisi reagente a temperatura ambiente ed omogeneizzare il lisato con una siringa da 1 ml connesso al 25 ago G finché il tessuto è interamente omogeneizzato (almeno 15-20 volte). I primi colpi sono difficili, e richiedono spingendo il tessuto contro la parete del tubo in modo da rompere a piccoli pezzi che potrebbero entrare la punta dell&#39;ago. </li><li> Per garantire omogeneizzazione, pipettare il lisato in una mini colonna di spin QIAshredder e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. </li><li> Pipettare il lisato in una nuova provetta e estrarre l&#39;RNA secondo le istruzioni del produttore. Conservare l&#39;RNA a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA, analizzare l&#39;integrità e la qualità utilizzando un Bioanalyzer o apparecchiatura equivalente. Utilizzare 100-500 ng di RNA per ogni turno di preparazione cDNA con rAndom primer esameriche. </li></ol> 6. Primer Progettazione e Testing Primer <ol><li> La scelta di buoni primer: Per una coppia di primer ottimale per qPCR di trascritti di mRNA, seguire questi requisiti (Figura 3): <ol><li> Primer design non più di 17-28, contenenti basi. Evitare ripetizioni nucleotidiche in quanto promuovono mispriming. </li><li> Primer design con temperatura di fusione (Tm) tra 56-68 ° C (ottimale 60-64 ° C). La T m all&#39;interno della coppia di primer dovrebbe essere entro 1 ° C di ogni altra. </li><li> Essere consapevoli del fatto che le dimensioni del prodotto dovrebbe idealmente essere compresa tra 80 e 150bp. </li><li> Assicurarsi che almeno uno dei primer si estende su una giunzione esone-esone, o all&#39;amplicon contiene una grande introne (introne-spanning), al fine di evitare l&#39;amplificazione dei contaminanti di DNA genomico. </li><li> Utilizzare un software affidabile basata su Primer3 (per esempio vedi tabella 2), al fine di migliorare la progettazione primer. </li></ol></li><li> Test del prIMers: Al fine di garantire la specificità e l&#39;efficienza dei primer, una reazione qPCR controllo devono essere eseguite: <ol><li> Utilizzare un campione positivo (contenente cDNA modello per tutte le coppie di primer rilevanti) e titolare del cDNA (ad esempio otto diluizioni tre volte, passando da una concentrazione iniziale di ~ 10 ng) in reazioni parallele duplicati. Include un controllo senza mascherina, che controlla per contaminazione all&#39;interno delle soluzioni utilizzate per la reazione. </li><li> Calcola efficienza Primer utilizzando la formula: (10 (- 1 / pendenza) -1) × 100, tale che la curva della pendenza ottimale è - 3,333 (cioè 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4). </li><li> Determinare la specificità dell&#39;amplificazione. L&#39;amplificazione specifica è dimostrato da un unico picco significativo comune a tutte le curve di fusione dei prodotti amplificati, mentre fuori porta amplificazione apparirebbe come una deviazione evidente from l&#39;unico grande picco. </li></ol></li></ol> 7 Analisi qPCR <ol><li> Pre-amplificazione: <ol><li> Analisi completa qPCR si riferiscono interrogazione parallela di limitare le quantità di RNA con un gran numero di coppie di primer. Pertanto, una fase di pre-amplificazione è essenziale. In questo passaggio, il cDNA subisce 14-18 cicli di pre-amplificazione con una miscela di tutti i primers che verranno utilizzati per interrogare il campione in futuro (fino a 800 coppie di primer). </li><li> Diluire tutti i primer di TE (basso EDTA) a 50 micron per specifica per un determinato Amplification (STA). </li><li> Pool insieme 1 microlitri aliquote di tutti primer 50 micron imposta da includere nella reazione STA, fino a 800 test. </li><li> Preparare pre-mix e campioni per STA come descritto nella Tabella 3. Consentire errore preparando miscela per il 110% del numero di campioni che devono essere amplificato. </li><li> Aliquota 3,75 ml STA pre-mix per ogni campione. Aggiungere 1,25 mldi cDNA a ciascuno. </li><li> Vortex per miscelare le reazioni e centrifugare per 10 sec. </li><li> Posizionare le reazioni STA in un termociclatore e il ciclo come indicato in Tabella 4. </li></ol></li><li> Exonuclease I (ExoI) trattamento: <ol><li> Diluire il Exo io, come indicato nella tabella 5. </li><li> Aggiungere 2 ml di ExoI diluito (4 U / ml) per ogni reazione STA 5 microlitri, vortice, spin down (&gt; 6.000 xg) e posto in un termociclatore a 37 ° C per 30 min e poi a 80 ° C per 15 min. </li><li> Diluire i prodotti finali ad una concentrazione adeguata per il test. Usa TE Buffer (aggiungere 43 microlitri di buffer TE al campione TSA 7 ml). </li><li> Conservare i prodotti STA diluiti a -20 ° C o usare immediatamente. </li></ol></li><li> Primer e la configurazione di esempio per qPCR: <ol><li> Preparare campioni come mostrato in Tabella 6. Preparare miscela secondo il chip scelto per l&#39;esperimento, e aggiungere campioni come appropriato. </li><li> Agitate le soluzioni Mescolare il campione per un minimo di 20 secondi e centrifugare (&gt; 6.000 xg) per almeno 30 sec. Reazioni preparati possono essere conservati per brevi periodi a 4 ° C fino al chip è pronto per il caricamento. </li><li> Preparare i saggi come descritto nella Tabella 7. </li><li> Agitare la Assay Mix per un minimo di 20 secondi e centrifugare (&gt; 6.000 xg) per almeno 30 secondi a girare giù tutti i componenti. IMPORTANTE: Vortex e centrifugare a fondo tutte le soluzioni campione e test prima di pipettaggio nelle insenature di chip. In caso contrario si potrebbe causare una diminuzione della qualità dei dati. NOTA: La concentrazione finale di ogni primer è 5 micron in ingresso e 500 nM nella reazione finale. </li></ol></li><li> Adescamento e caricamento Array dinamico IFC (circuito fluidico integrato) chip. Il chip IFC ha ingressi per campioni e analisi, così come ingressi specificati (accumulatori) per il fluido di linea di controllo (olio minerale) utilizzati per pressurizzare le camere di microfluidica (Figure 4A). <ol><li> Iniettare liquido linea di controllo in ogni accumulatore sul chip. </li><li> Rimuovere ed eliminare la pellicola protettiva azzurra dal fondo del chip. </li><li> Posizionare il chip nel controller IFC appropriata (Controller MX per il 48.48 Dinamica IFC Array o il controller HX IFC per il 96,96 Array Dinamico IFC), quindi eseguire lo script Prime (113x) per il 48.48 Dinamica IFC Array o il primo (136x) script per il 96,96 matrice dinamica IFC per primo il chip. </li><li> Quando lo script ha finito, rimuovere il chip innescata dal controller IFC. </li><li> Pipettare 5 ml di ogni Assay Mix e 5 ml di ogni Mescolare il campione nelle loro insenature. </li><li> Ritorna il chip al controller IFC. </li><li> Utilizzando il software del controller IFC, eseguire il carico Mix (113x) script per il 48.48 Array Dinamico IFC) o caricare Mix (136x) script per il 96,96 Array dinamico IFC per caricare i campioni e saggi nel chip. Quando lo script di Load Mix ha finito, rimuovere il caricoEd circuito integrato dal controller IFC. </li><li> Caricare il chip sulla termociclatore, creare una nuova corsa circuito integrato (secondo le linee guida del produttore), inclusa l&#39;analisi della curva di melting. Utilizzando il software termociclatore, assicurarsi che le camere di reazione vengono riconosciuti correttamente, e permettono la reazione di eseguire fino al completamento. </li></ol></li></ol> Analisi dei dati 8. <ol><li> Garanzia di qualità: Al fine di garantire la qualità dei dati, verificare la qualità dei primer affrontando curve di diluizione (come descritto sopra). Monitorare la specificità dell&#39;amplificazione visualizzando le curve di melting degli ampliconi, i picchi di quali dovrebbero essere strettamente allineati in modo ottimale 29. </li><li> Visualizzazione: Per la visualizzazione di grandi quantità di dati ottenuti da high-throughput qPCR, uso di software generato heatmaps, in cui l&#39;espressione è color-coded per intensità. Inoltre, potrai vedere le dinamiche trascrizionali di geni singoli come grafici a dispersione allineati. </li><li> Pubblicazione: In publishingi risultati di espressione genica, si consiglia di seguire le linee guida MIQE per la pubblicazione dei quantitativi in ​​tempo reale PCR esperimenti, dettagliando le informazioni minime che devono essere segnalati per un esperimento qPCR per garantire la sua rilevanza, accuratezza, la corretta interpretazione e la riproducibilità. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells.">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Caratterizzazione di successo di espressione genica da tessuto cerebrale a seguito paradigmi comportamentali dipende da: 1) la gestione attenta dei topi durante il paradigma comportamentale; 2) dissezione rapida e precisa del tessuto di interesse; 3) misure di RNA-safe per assicurare l&#39;integrità dell&#39;RNA; e 4) Un&#39;attenta pianificazione di primer e il layout sperimentale, così come la precisione e l&#39;attenzione al dettaglio nella preparazione per l&#39;analisi qPCR. Lo scopo ...

Organizzazione dinamica del cervello permette flessibilità cognitiva e comportamentale. Esperienze sono codificati mediante modifiche della struttura e la forza delle connessioni tra i neuroni nel cervello 3. Questa &quot;plasticità esperienza-dipendente&quot; è il risultato di induzione di specifici pattern di espressione genica che fornisce le proteine ​​necessarie per la modifica della struttura sinaptica e forza 4. L&#39;identificazione di reti di regolazione genica mediare la formazione della memoria a lungo termine è un principio centrale della neuroscienza molecolare, con l&#39;aspettativa che l&#39;identificazione degli elementi dominanti di programmi trascrizionali sarà approfondire la conoscenza dei principi fondamentali che regolano la formazione della memoria, così come obiettivi per trattamento dei neurodegenerative e disturbi neuropsichiatrici. Programmi di trascrizione si svolgono in onde temporalmente definiti, ognuno dei quali codificano geni di carattere diverso, che sono importanti per dfasi ifferent in attuazione dei risultati della manifestazione di segnalazione 1,2. È quindi importante affrontare dinamiche trascrizionali su una scala temporale temporale dettagliata, in modo da identificare la serie completa di geni indotti, e ottenere informazioni sui loro funzione potenziale secondo la dinamica del loro induzione. La tossicodipendenza è una forma solida di plasticità esperienza-dipendente causata dagli effetti di lunga durata delle sostanze d&#39;abuso sui circuiti neurali nel cervello 5,6. L&#39;esposizione iniziale, acuta ai farmaci può portare allo sviluppo di dipendenza e la transizione verso l&#39;uso cronico. Informazione contestuale è un elemento cruciale nello sviluppo della dipendenza. Stimoli ambientali Drug-associati vengono assegnati notevole importanza nella mente dei tossicodipendenti. Informazioni contestuali ricordando un tossicodipendente di esperienza con la droga passato può indurre ricaduta al craving anche dopo lunghi periodi di astinenza da esposizione al farmaco 7,8.Di qui la grande sfida clinica nella dipendenza - la propensione dei tossicodipendenti della ricaduta anche molto tempo dopo che i sintomi di astinenza sono calmati 9. Sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è un semplice modello di esperienza cocaina utile nello studio dei meccanismi di tossicodipendenza. In questo modello ampiamente studiato per la sensibilizzazione di lunga durata indotta da esposizione cronica a sostanze d&#39;abuso, roditori sono abituati prima a iniezioni di soluzione salina (intraperitoneale; IP) in un ambiente romanzo (una camera campo aperto in cui viene monitorata la loro attività locomotoria) ; poi, ricevono iniezioni giornaliere di cocaina nelle camere a campo aperto mentre la loro attività viene monitorata 10 (Figura 1). Questo paradigma comportamentale si traduce in genere in un robusto sensibilizzazione del comportamento locomotorio (8-12 volte superiori l&#39;attività di base) 11, che viene mantenuto per un periodo di mesi dopo la cessazione delle iniezioni di cocaina, dimostrando la formazione di un pervtraccia di memoria asive di esperienza con la droga. I circuiti neurali di ricompensa, naturalmente coinvolta nel rafforzare comportamenti essenziali per il successo di una specie (ad esempio, l&#39;alimentazione, il sesso), viene sfruttata da sostanze d&#39;abuso di rinforzare i comportamenti-droga associata 12,13. I meccanismi molecolari e cellulari con cui l&#39;esperienza delle droghe d&#39;abuso è esaltata sembrano essere simili ai meccanismi alla base della formazione dei ricordi dichiarativi o semantiche in altre strutture cerebrali 14. Pertanto, la robustezza del modello comportamentale di sensibilizzazione rende un sistema modello interessante per studiare i meccanismi di plasticità esperienza-dipendente. Il nucleus accumbens (NAC) è un integratore centrale dei circuiti di ricompensa del cervello, ed è stato ampiamente associato con lo sviluppo di dipendenza 5,6. La formazione di dipendenza dipende trascrizione di nuove proteine ​​nel nucleo accumbens e robustaproduzione di programmi di trascrizione chiaramente strutturati si osserva nel NAc seguente esperienza cocaina 15-19. La risposta trascrizionale acuta all&#39;esposizione cocaina è probabile per funzionare a più livelli per adattarsi alla forte stimolo induzione e per dirigere la produzione di nuove proteine ​​che sono responsabili per i cambiamenti strutturali ed elettrofisiologiche indotte da esposizione al farmaco 6,19-22. Al fine di promuovere lo studio dei meccanismi molecolari della plasticità esperienza-dipendente nel cervello, un protocollo è descritto per l&#39;analisi completa della dinamica di trascrizione in campioni di tessuto cerebrale a seguito di manipolazione comportamentale. Il protocollo è illustrato nel contesto dell&#39;esperienza comportamentale studiata in laboratorio Citri - sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, utilizzando matrici dinamiche microfluidici per analisi trascrizionale. Il protocollo descritto non è ovviamente limitato a studiare tegli nucleo accumbens nel contesto della sensibilizzazione comportamentale, ma potrebbe essere applicata ad un gran numero di paradigmi comportamentali e regioni del cervello. In realtà, questo protocollo potrebbe essere applicato a tessuti del corpo al di fuori del cervello, e una varietà di esperienze o manipolazioni dell&#39;organismo studiato. Il protocollo è divisa in quattro fasi. Nella prima fase, l&#39;animale è sottoposto al paradigma comportamentale; nella seconda fase il tessuto è microdissezione; nella terza fase - mRNA viene purificato, retrotrascritto e sondato, e nella fase finale i dati vengono analizzati. Nel contesto di studiare le dinamiche trascrizionali, la tempistica precisa e definizione di esperienza sono probabilmente i più importanti parametri sperimentali per il controllo. Per questo motivo, il nostro modello comportamentale di scelta è quella di sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, un sistema che permette elevato livello di controllo sperimentatore sui parametri del experience. Paradigmi comportamentali aggiuntivi che consentono tempi precisi e affrontano diversi modelli di plasticità esperienza-dipendente o di formazione della memoria sono disponibili. Questi modelli includono paura condizionata 23, arricchimento ambientale acuta 24,25, romanzo esplorazione oggetto 26 e l&#39;esperienza visiva in seguito allevamento buio 27. Eppure, sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è una manipolazione comportamentale costantemente robusta, creando una traccia di memoria altamente pervasivo che dura da mesi successivi esperienza cocaina 28. Il cervello è sezionato, seguita da microdissezione manuale nucleo accumbens. E &#39;stata la nostra esperienza che microdissezione manuale da fettine di cervello rapidamente preparati fornisce il metodo più affidabile e rapida estrazione del tessuto relativo al paradigma comportamentale, e con l&#39;esperienza, i confini del tessuto diventato evidente e facilmente riconoscibile. In alternativa, fette sottili potrebbero essere preparEd, seguito da laser-capture microdissezione. Anche se questo metodo consente altamente definito delineazione della regione di interesse, è lento (rischiando così la perdita di mRNA labile), noioso e richiede costose attrezzature dedicate (un microscopio dotato di una messa a punto laser-capture). Il protocollo qui definita potrebbe anche essere adattato a cella singola analisi trascrizionale, mediante aspirazione manuale del citoplasma delle cellule individuati visivamente utilizzando pipette di patch 29. È importante notare che il protocollo descritto fornisce una media della popolazione, mentre è altamente probabile che nella maggior parte dei casi, solo una sottopopolazione di cellule all&#39;interno del tessuto sono effettivamente coinvolti nella risposta all&#39;esperienza. E &#39;di interesse al profilo trascrizione in maniera selettiva all&#39;interno di specifiche popolazioni cellulari che rispondono all&#39;esperienza, ma la discussione di questi approcci è oltre l&#39;ambito corrente. Per la purificazione di mRNA, reverse-trascrizione e qPCR interrogazione, il tessutoè interrotta da passare attraverso aghi sottili, seguita da l&#39;utilizzo di kit disponibili in commercio (per ulteriori informazioni, vedere Tabella 8). La scelta è informato da esperienza con queste metodologie, che garantiscono l&#39;estrazione affidabile di RNA di alta qualità e robusti risultati di applicazioni a valle. Mentre il protocollo è descritto per high-throughput qPCR utilizzando array dinamici, i campioni possono essere sondati per l&#39;espressione genica utilizzando end-point PCR, a bassa velocità qPCR, gene microarray di espressione o di sequenziamento profondo. La preferenza per high throughput qPCR utilizzando matrici dinamiche è dovuto al fatto che il mRNA ottenuto da nuclei cerebrali seguente paradigmi comportamentali è spesso di quantità limitanti. Gli array dinamici forniscono una piattaforma che consente efficiente un&#39;analisi completa dei trascritti da un gran numero di campioni in parallelo in un singolo esperimento. Dopo l&#39;acquisizione iniziale del sistema microfluidica (comunemente un pu istituzionalerchase), gli esperimenti sono relativamente poco costoso per funzionare. A seguito di questa analisi, un&#39;ulteriore interrogazione dei campioni può essere eseguita utilizzando piattaforme più costose per la ricerca di nuove trascrizioni (di microarrays o RNAseq) con gli array dinamici fornendo un riferimento completo per la garanzia della qualità. Infine, per l&#39;analisi dei dati, approcci standard sono utilizzati. Indicazioni specifiche riguardanti questioni che potrebbero sorgere saranno discusse nel testo del protocollo. Questo protocollo è più appropriato per i ricercatori interessati a un&#39;indagine approfondita del loro sistema di interesse, studiando più condizioni e replicati. Il protocollo è più adatto per gli investigatori che hanno già affinato in (attraverso microarray o RNAseq esperimenti) su un sottoinsieme di 50-500 geni di interesse, che sono interessati a interrogare ripetutamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="453">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Virusol</td>
			<td>Oriek Medical</td>
			<td>J29D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>MINRAD INC</td>
			<td>NDC 60307-110-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>73404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>AB-4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>1355656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Perspex box (30X30cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and video recorder</td>
			<td>Campden Inst</td>
			<td>CMD-80051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Recorder software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>NDS-NMR3-00M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST-14062-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagital Brain slicer with a 0.5mm section</td>
			<td>Brain Tree Scientific</td>
			<td>BS-AL-505S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microspun spatula</td>
			<td>Bochem Instrument GmbH</td>
			<td>3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD Reader</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic array Chip for 96.96gene expression</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive analysis of transcription dynamics from brain samples following behavioral experience

La codifica delle esperienze nel cervello e il consolidamento della memoria a lungo termine dipendono dalla trascrizione genica. Identificare la funzione di geni specifici in un&#39;esperienza di codifica è uno dei principali obiettivi delle neuroscienze molecolare. Inoltre, l&#39;associazione funzionale di geni definiti con comportamenti specifici ha implicazioni per la comprensione base dei disturbi neuropsichiatrici. Induzione di programmi di trascrizione robusti è stato osservato nel cervello dei topi seguenti varie manipolazioni comportamentali. Mentre alcuni elementi genetici sono utilizzati ripetutamente seguendo diverse manipolazioni comportamentali e in diversi nuclei cerebrali, programmi trascrizionali sono complessivamente unica agli stimoli che inducono e la struttura in cui sono studiati 1,2. In questa pubblicazione, un protocollo è descritto per robusta e completa profilatura trascrizionale da nuclei cerebrali di topi in risposta alla manipolazione comportamentale. Ilprotocollo è dimostrata nel contesto di analisi delle dinamiche di espressione genica nel nucleo accumbens seguente esperienza cocaina acuta. A seguito di un definito nell&#39;esperienza vivo, il tessuto neurale bersaglio è sezionato; seguita da purificazione dell&#39;RNA, trascrizione inversa e l&#39;utilizzo di array microfluidica per l&#39;esauriente analisi qPCR di molteplici geni bersaglio. Questo protocollo è orientato verso un&#39;analisi completa (indirizzamento 50-500 geni) di limitare le quantità di materiale di partenza, come ad esempio piccoli campioni di cervello o anche singole cellule. Il protocollo è più vantaggiosa per l&#39;analisi in parallelo di più campioni (ad esempio, singole cellule, analisi dinamica seguendo farmaceutica, virale o perturbazioni comportamentali). Tuttavia, il protocollo potrebbe anche servire per la caratterizzazione e garanzia di qualità dei campioni prima di studi intero genoma da microarray o RNAseq, nonché la validazione dei dati ottenuti da studi intero genoma.

La qualità dei risultati ottenuti applicando questo protocollo dipende essenzialmente da una serie di parametri. Pianificazione sperimentale corretta comporterà minimo disturbo ai topi sperimentali, tale che l&#39;esperienza testato (in questo esempio, che l&#39;esposizione alla cocaina) sarà l&#39;esperienza più dominante nella loro storia recente, e quindi si tradurrà in una trascrizionale robusto e specifico programma. Figura 1 descrive il piano sperimentale per la sensibilizzazione comportament...

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Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Analisi completa di Trascrizione Dynamics da campioni di cervello seguito Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

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11.5K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays. 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Ricerca

Comportamento

Transcranial Magnetic Stimulation for Investigating Causal Brain-behavioral Relationships and their Time Course

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily disrupt information processing in a brain region, generating a short-lived &#8220;virtual lesion.&#8221; Stimulation that interferes with task performance indicates that the affected brain region is necessary to perform the task normally. In other words, unlike neuroimaging methods such as functional magnetic resonance imaging (fMRI) that indicate correlations between brain and behavior, TMS can be used to demonstrate causal brain-behavior relations. Furthermore, by varying the duration and onset of the virtual lesion, TMS can also reveal the time course of normal processing. As a result, TMS has become an important tool in cognitive neuroscience. Advantages of the technique over lesion-deficit studies include better spatial-temporal precision of the disruption effect, the ability to use participants as their own control subjects, and the accessibility of participants. Limitations include concurrent auditory and somatosensory stimulation that may influence task performance, limited access to structures more than a few centimeters from the surface of the scalp, and the relatively large space of free parameters that need to be optimized in order for the experiment to work. Experimental designs that give careful consideration to appropriate control conditions help to address these concerns. This article illustrates these issues with TMS results that investigate the spatial and temporal contributions of the left supramarginal gyrus (SMG) to reading.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a technique for non-invasively disrupting neural information processing and measuring its effect on behavior. When TMS interferes with a task, it indicates that the stimulated brain region is necessary for normal task performance, allowing one to systematically relate brain regions to cognitive functions.

Stimolazione Magnetica Transcranica per indagare le relazioni causali Brain-comportamentali e la loro Corso di Tempo

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the necessary equipment is now available by several commercial companies. This protocol provides a detailed description of a two-way shuttle-box avoidance learning paradigm in rodents (here Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus) in combination with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical electrophysiological in vivo recordings. The detailed protocol is applicable to study multiple aspects of learning behavior and perception in different rodent species.
Site-specific ICMS of auditory cortical circuits as conditioned stimuli here is used as a tool to test the perceptual relevance of specific afferent, efferent and intracortical connections. Distinct activation patterns can be evoked by using different stimulation electrode arrays for local, layer-dependent ICMS or distant ICMS sites. Utilizing behavioral signal detection analysis it can be determined which stimulation strategy is most effective for eliciting a behaviorally detectable and salient signal. Further, parallel multichannel-recordings using different electrode designs (surface electrodes, depth electrodes, etc.) allow for investigating neuronal observables over the time course of such learning processes. It will be discussed how changes of the behavioral design can increase the cognitive complexity (e.g. detection, discrimination, reversal learning).

Shuttle-box avoidance learning is well-established in behavioral neuroscience. This protocol describes how shuttle-box learning in rodents can be combined with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical in vivo recordings as a tool to study multiple aspects of learning and perception.

Combinato Shuttle-Box Training con elettrofisiologiche Cortex registrazione e stimolazione come strumento per studiare percezione e apprendimento

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità Percorsi rilevanti per l&#39;apprendimento Extinction

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &#8211; Working Memory (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of working memory in young school-age children. Working memory deficits have been identified in children with language-based learning disabilities, including dyslexia1,2 and language impairment3,4, but it is not clear whether these children exhibit deficits in subcomponents of working memory, such as visuospatial or phonological working memory. The CABC-WM is administered on a desktop computer with a touchscreen interface and was specifically developed to be engaging and motivating for children. Although the long-term goal of the CABC-WM is to provide individualized working memory profiles in children, the present study focuses on the initial success and utility of the CABC-WM for measuring central executive, visuospatial, phonological loop, and binding constructs in children with typical development. Immediate next steps are to administer the CABC-WM to children with specific language impairment, dyslexia, and comorbid specific language impairment and dyslexia.

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &amp;#8211; Working Memory (CABC-WM)

Working memory predicts a significant amount of variance for a variety of cognitive tasks, including speaking, reading, and writing. However, few tools are available to assess working memory in children. We present an innovative, computer-based battery that comprehensively assesses different components of working memory in school-age children.

Valutazione della memoria di lavoro nei bambini: la batteria di valutazione completa per i bambini - memoria di lavoro (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of ...

Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, few studies have investigated the long-term effects of injury in rodent models of TBI. Shown here are behavioral measures that are well-established in TBI research for times early after injury, such as two weeks, until two months. Some of these methods have previously been used at later times after injury, up to one year, but by very few laboratories. The methods demonstrated here are a short neurological assessment to test reflexes, a Beam-Balance to test balance, a Beam-Walk to test balance and motor coordination, and a working memory version of the Morris water maze that can be sensitive to deficits in reference memory. Male rats were handled and pre-trained to neurological, balance, and motor coordination tests prior to receiving parasagittal fluid percussion injury (FPI) or sham injury. Rats can be tested on the short neurological assessment (neuroscore), the beam-balance, and the Beam-Walk multiple times, while testing on the water maze can only be done once. This difference is because rats can remember the task, thus confounding the results if repeated testing is attempted in the same animal. When testing from one to three days after injury, significant differences are detected in all three non-cognitive tasks. However, differences in the Beam-Walk task were not detectable at later time points (after 3 months). Deficits were detected at 3 months in the Beam-Balance and at 6 months in the neuroscore. Deficits in working memory were detected out to 12 months after injury, and a deficit in a reference memory first appeared at 12 months. Thus, standard behavioral tests can be useful measures of persistent behavioral deficits after FPI.

The goal of the behavioral tests presented here is to detect functional deficits in rats after traumatic brain injury. Four specific tests are presented that detect deficits in behaviors to reflect the damage to specific brain areas at times extending to one year after injury.

Rilevare i deficit comportamentistici in ratti dopo la ferita di cervello traumatica

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper understanding of the neurobiological causes underlying the decision-making problems. A cost-benefit based T-maze task is used for measuring decision making in which rodents choose between a high reward arm (HRA) and a low reward arm (LRA). There are two paradigms of the T-maze decision-making task, one in which the cost is a time delay and the other in which it is physical effort. Both paradigms require a tedious and labor-intensive management of experimental animals, multiple doors, pellet reward, and arm choice recordings. In the current work, we invented an apparatus based on traditional T-maze with full automation for pellet delivery, door management and choice recordings. This automated setup can be used for the evaluation of both delay- and effort-based decision making in rodents. With the protocol described here, our lab investigated the decision-making phenotypes of multiple genetically modified mice. In the representative data, we showed that the mice with ablated medial habenular showed aversions of both delay and effort and tended to choose the immediate and effortless reward. This protocol helps to decrease the variability caused by experimenter intervention and to enhance experiment efficiency. In addition, chronic silicon probe or microelectrode recording, fiber-optic imaging and/or manipulation of neural activity can be easily applied during the decision-making task using the setup described here.

This article introduces an automated T-maze apparatus that we invented, and a protocol based on this apparatus for analyzing delay-based decision making and effort-based decision making in free moving rodents.

Un t-labirinto automatizzato basato apparato e protocollo per l'analisi basate su ritardo e sforzo decisionale nei roditori in movimento libero

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer&#039;s Disease, Using IntelliCage

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

Automatizzato, a lungo termine l'analisi comportamentale per funzioni Cognitive in più modelli di genetici del morbo di Alzheimer, utilizzando IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...

Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various physiological or pathological changes. The object location task (OLT) and the novel object recognition task (NORT) are two effective behavioral tasks commonly used to reveal the function and relative health of specific brain regions involved in memory. While both of these tests exploit the inherent preference of mice for the novelty to reveal memory for previously encountered objects, the OLT primarily evaluates spatial learning, which relies heavily on hippocampal activity. The NORT, in contrast, evaluates non-spatial learning of object identity, which relies on multiple brain regions. Both tasks require an open-field-testing arena, objects with equivalent intrinsic value to mice, appropriate environmental cues, and video recording equipment and the software. Commercially available systems, while convenient, can be costly. This manuscript details a simple, cost-effective method for building the arenas and setting up the equipment necessary to perform the OLT and NORT. Furthermore, the manuscript describes an efficient testing protocol that incorporates both OLT and NORT and provides typical methods for data acquisition and analysis, as well as representative results. Successful completion of these tests can provide valuable insight into the memory function of various mouse model systems and appraise the underlying neural regions that support these functions.

Here we provide a protocol which includes comprehensive instructions for the economical establishment of murine object location and novel object recognition behavioral testing, including the design, cost, and construction of required equipment as well as execution of behavioral testing, data collection, and analysis.