We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1. Manuel Düsünce Modeli Üretimi Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Chimera özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Tek amacı yerine nesnelerin hacim şeklinde görüntüleme, geometrik ölçümleri yapmak için bir geometrik model (örneğin, bir top ve çubuk modeli) oluşturmak için, bu yaklaşımı kullanarak. <ol><li> Manuel soyutlanmış model üretimi için uygun bir programa veri hacmi aktarın. <ol><li> Dosya&gt; Aç Haritası Dosya Aç iletişim kutusunu kadar çekin. Istenen haritanın dosya konumuna gidin. </li><li> Farklı render stilleri ile verileri görüntülemek için Volume Viewer (Araçlar&gt; Ses Verileri&gt; Volume Viewer) seçin ve Özellikler&gt; Ekran Stil yukarı çekin. </li><li> Volume Viewer histogramı dikey çubuğunu sürükleyerek ekran için eşik ayarlayınpenceresi. </li></ol></li><li> 3D hacim gezinin (örneğin, dilim dilim) segmentasyon için ilgi alanı seçin ve gerekirse daha küçük alt-hacmini kırpmak için. <ol><li> Volume Viewer iletişim, Axis &#39;i tıklatın, sonra da X, Y, Z veya seçin. </li><li> Volume Viewer iletişim kutusunda,&gt; Planes Özellikler seçeneğini seçin. Soldaki kutuda numaraya karşılık gelen uçağı görüntülemek için Derinlik ayarlamak için One tıklayın ve tüm uçakları görüntülemek için Tümü öğesini tıklatın. </li><li> Volume Viewer iletişim kutusunda seçin Özellikler&gt; Altbölgesi seçimi. <ol><li> Tıklayın ve ilgi bölgenin çevresinde dikdörtgen bir kutu oluşturmak için sürükleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Ilgilenilen özellik işaretleri de yerleştirin ve modeli tamamlanana kadar (genellikle program tarafından otomatik olarak yapılır) uygun bağlayıcılar ile bağlayın. <ol><li> Volume Viewer menü çubuğunda, Araçlar&gt;Ses Tracer iletişim Ses Tracer iletişim kutusunu açmak için. Ses Tracer iletişim kutusunda,&gt; Yeni Marker Set dosya seçin. </li><li> Ses Tracer iletişim kutusunda, veri uçaklar Mouse&gt; yüksek kalite Yer belirteçleri, Yer belirteçleri kontrol ettirin ve işaretçileri yeniden boyutlandırma, Bağlantı yeni bir işaretleyici seçilen işaretleyici ve Bağlantı ardışık işaretçileri seçilir. </li><li> Marker Renk örneğini tıklatın ve bir renk seçin. Bağlantı rengi için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Işaretleyici ve bağlantı model yapı elemanları için yarıçaplarından girin. </li><li> Ses Tracer Penceresinde, [sağ] fare düğmesini kullanarak Yer belirteçleri seçin ve belirteçler ve bağlantılar için yarıçapları yerleştirin. </li><li> Sağ işaretçileri koyan başlamak için hacim verilerine tıklayın. İşaretleyiciler otomatik olarak bağlanacaktır. </li><li> Ses Tracer iletişim kutusunda, Dosya&gt; Geçerli işaretleyici kümesini kaydedin, ardından&gt; Kapat işaretleyici seti Dosya. </li></ol></li&gt; <li> Ilgi istenilen ikinci özelliği haline bir model oluşturmaya başlamak için yeni bir belirteç kümesi (Adım 1.3.1) açın. Özellikleri farklılıkları vurgulamak için işaretleyici setleri arasındaki kontrast renkler yararlanın. </li></ol> İlgi Özellikleri 2. Manuel Takip Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Amira özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Nüfus yoğunluğu nispeten küçük ve özellik çıkarımı doğruluğu çok önemlidir zaman, manuel izleme gibi zaman alıcı bir yaklaşımdır bu yaklaşımı kullanın. <ol><li> Manuel izleme seçenekleri ile bir programa İthalat hacmi verileri. Bu yeteneği ile yazılım genellikle en azından temel bir fırça aracı sunuyoruz. <ol><li> Büyük hacimler veya tomogramları (örneğin, 16-bit 2.048 x 2.048 veya daha büyük rec veya imod içinde mrc oluşturulan tomografi): Seç Open Data&gt; filename.rec&gt; Format sağ tıklayın ...&gt; LargeDiskData olarak Raw seçin </i&gt;&gt; Tamam&gt; Yük. Tamam&gt; başlık bilgisinden uygun Ham Veri Parametreleri seçin. Yeni gibi açar ve katılım <a href="http://filename.am/">filename.am</a> aşağıdaki adımlarda kullanılmak için bir dosya. </li><li> Küçük 3D görüntü yığını dosyalar (örneğin, 3D .tif veya mrc veya REC): Açık Veri&gt; seçin filename.tif veya filename.mrc. Geçiş Kaydet Sağ Tıklama&gt; <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Bir hata üretilen veya program yanıt vermiyorsa ise, dosya çok büyük olabilir ve Adım 2.1.1 izleyerek açılabilir. </li></ol></li><li> Segmentasyon için bir 3D alt birimini seçmek için dilimler gezinmek ve daha sonra bu ilgi alanında kırpmak. <ol><li> 3D Görüntüleyici penceresinde, resim dosyasını açmak için Orthoslice seçin. Dilimleri arasında gezinmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın. </li><li> &gt; Havuz pencerede dosya adı geçiş, LargeDiskData olarak açılan büyük veri kırpmak için sağ&gt; LatticeAccess tıklatın. Enter istenen kutusu boyutu&gt; uygulayın. Yeni dosyayı kaydedin. </li></ol></li><li> Segmentasyon dosyası oluşturun. <ol><li> Sağ&gt; Etiketleme&gt; labelField tıklayınız&gt; Pool penceresinde dosyayı geçiş. Yeni bir dosya oluşturulur ve otomatik Segmentasyon Editör sekmesinde yüklenecektir. </li></ol></li><li> Ilgi ilk özelliği sınırını Trace, sonra elle veya kullanılan yazılım belirli bir komut kullanarak iz doldurun. Tüm dilimlerde ilgi özelliğini izleyin ve manuel izleme segmentasyonu tekrarlayın. Amira kullanarak aşağıdaki komutları kullanın: <ol><li> Boya Fırçası aracını kullanmak için, istediğiniz gibi, daha sonra ilgi özelliğinin sınırını izlemek için fare işaretçisi kullanabilirsiniz fırça boyutunu değiştirmek. </li><li> Kısayol &quot;f&quot; ile takip alanını doldurun. Artı sembolü, ya kısayol &quot;a&quot; ile butonuna tıklayarak seçimini ekle. Gerekirse, basın &quot;u&quot; geri almak için, ve çıkarma ya da silmek için &quot;s&quot;. </li></ol&gt; </li><li> Görselleştirme ve temel kalitatif veya yazılım kullanım kılavuzu talimat başına kantitatif analiz için yüzey render oluşturmak. <ol><li> Object Pool sekmesinde, sağ&gt; SurfaceGen tıklayın&gt; Pool pencerede dosya-labels.am geçiş. </li><li> Uygula&gt; İstediğiniz Yüzey özelliklerini seçin. Yeni bir dosya filename.surf Havuz oluşturulur. </li><li> &gt; Sağ tıklayın&gt; Havuz pencerede filename.surf geçiş, SurfaceView segmentli hacmini görselleştirmek için. </li><li> Taşımak, döndürmek ve 3D hacmindeki yakınlaştırmak için 3dviewer penceresinde araçlarını kullanın. </li></ol></li><li> Tam yoğunlukları ayıklayın ve bu hacim veya yüzey alanı olarak ölçülerini belirlemek. Daha gelişmiş görüntüleme, analiz ve simülasyon için diğer programlara ihracat. <ol><li> 3dviewer penceresinde, uygun seçeneği (2D uzunluğu ve 2D açısını ölçümler için tek bir 2D düzlemde, 3D uzunluğu ve 3D Açısı seçin&gt; Ölçü aracını tıklayın3D birimde ölçümler için). </li><li> İstenilen uzunluk, mesafe ve açıları ölçmek için örgü yüzey tıklayın. Değerler Properties penceresinde listelenir. </li></ol></li></ol> 3. Otomatik Yoğunluk tabanlı Segmentasyon Not: metodolojisinin detayları aşağıda açıklanan Amira özeldir, ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. <ol><li> Ilgi yoğunluklarını çekilme kontrast, canlılık, ya crowdedness herhangi çeşitli veri setleri bu yaklaşımı kullanın. </li><li> Otomatik segmentasyon için eşikleme, sihirli değnek, ya da diğer yoğunluk tabanlı araçlar ile donatılmış bir programa İthalat hacmi verileri. Manuel izleme için yönlerde 2.1-2.1.2 özetlenen adımları izleyin. </li><li> Dilimleri arasında gezinmek ve segmentasyon için alanı seçin. Gerekirse, segmentasyon için küçük bir 3D alt hacme mostra. Manuel izleme için yönlerde 2.2-2.2.2 özetlenen adımları izleyin. </li><li> Yoğunluğunu seçmekBir ilgi bir özellik, genellikle tıklayarak veya özelliği bir işareti veya çapa noktasını koyarak. Yazılım izin veriyorsa, özelliğin piksel yoğunluğunu kapsayan bir sayı aralığı girin ve istediğiniz gibi bu toleransı ayarlamak. Özelliği ait yoğunlukları Çapa&#39;nın piksel veya tolerans değeri yoğunluğuna göre alınacaktır. Amira kullanırken aşağıdaki komutları kullanın. <ol><li> Ayırt marjları ile özellikler için Magic Wand Tool kullanın. <ol><li> Ilgi alanı tıklatın, ardından özellik tam vurgulanır, böylece değerlerin doğru aralığı yakalamak için Ekran ve Gizlemenin sürgüyü ayarlayın. Kısayol &quot;a&quot; ile seçimi ekleyin. </li></ol></li><li> Açıkça ayırt kenar boşluğu olmadan özellikler için Eşik Aracı&#39;nı kullanın. </li><li> Eşik simgesini seçin. Sadece ilgi özellikleri maskeli böylece arzu aralığında yoğunluğunu ayarlamak için kaydırma çubuğunu ayarlayın. Seç düğmesine tıklayın, ardından kısayol ile seçim eklemek220, bir &quot;. </li><li> Bölüm tüm hacim için, seçim eklemeden önce tüm dilim seçin. </li><li> Adaları ve / veya Segmentasyon&gt; Smooth etiketleri&gt; gürültü seçin Kesimlemeyi Kaldırmak için. </li></ol></li><li> Manuel izleme bölümünde 2.6-2.6.2 açıklandığı gibi görselleştirme ve nitel analizler için bir yüzey oluşturur. İstenirse, yeterli 3D ekran, kantitatif analiz ve simülasyonlar için diğer programlara ihracat. </li></ol> 4. Özel tasarlanmış Otomatik Segmentasyon Not: Büyük bir birimden kesin bir yoğunluk model oluşturmak için yeteneği bilgisayar bilimi arka plan tecrübe gerektirir, ama sağlayan otomatik segmentasyon için özelleştirilmiş komut dosyaları oluşturmak için bu yaklaşımı kullanın. <ol><li> Araçlar (MATLAB 27 Shape-denetimli Bölümlemenin Özel Örnek) <ol><li> Görüntü ön-işleme: gerçekleştirin de-noising, arka plan çıkarma ve görüntü geliştirmeAşağıdaki hattını kullanarak: <ol><li> Imread komutunu kullanarak görüntüyü yükleyin. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; im = imread $ image_path analiz edilecek görüntünün konumu ($ image_path). </li></ol></li><li> Görüntü İşleme Araç kutusundan, bir tahmini veya bilinen Gürültü-güç-sinyal oranı (NSR) kullanılarak Wiener Filtre diyoruz. </li><li> Önce işlenen görüntüsünde, daha sonra, arka plan katmanı tahmin etmek imopen görüntü açma işlevini çağırmak farklı bir maske olarak sonucu ayrılamadı. <ol><li> Komut satırı girin:. &gt;&gt; Plan = imopen (im strel ($ shape_string $ boyutu)), bu yöntemde, $ shape_string boyutu analiz cihazı tarafından verilen değişken $ &#39;disk&#39; eşittir, yani &gt;&gt; background = imopen (im strel (&#39;Disk&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Arka plan ile filtre görüntü çıkarın. <ol><li> &gt;&gt; IM2 = - im: komut satırında girinarka plan </li></ol></li><li> Sonuçlarının kalitesine bağlı olarak, birlikte ya da Görüntü İşleme Toolbox fonksiyon imadjust kullanılarak çağrılabilir uyarlanabilir Otsu yöntemiyle 28 olmadan, görüntü normalleştirme gerçekleştirin. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; IM3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Normalize görüntü kırpma ilgi bölgeleri sınırlayan, segmentasyon ilgi özelliklerini hazırlayın. <ol><li> Imtool komutunu kullanarak, kırpılmış için ilgi bölgeyi keşfetmek ve komuta koordinatları sağlar: vektör [x1 y1 x2 y2] tekabül &gt;&gt; im3_crop = imcrop (IM3, [x1 y1 x2 y2]), kare bölge kırpılmış olarak. </li></ol></li></ol></li><li> (Ilgi özellikleri arasında 2D görüntü lineer izlerini) nesnelerin her biri farklı bir kategori için belirli örnekler vererek algoritma eğitin: tanıma / Denetimli şekil sınıflandırma şekil. <ol><li> VLFEAT 29 API başarıyla yüklendiğini kontrol edin ve daha derinlemesine dokümantasyon için VLFEAT sitesini ziyaret edin. </li><li> Komut satırında girin: &gt;&gt; [AĞACI, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) $ K kullanılacak kümenin numarasını veya gözlemci içine verileri düzenlemek istediği sınıfların sayısını, ve $ NLEAVES yaprak kümeleri istenen sayıda yani bir &gt;&gt; [AĞACI, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4.100) </li><li> VLFeat için girdi olarak elle segmente özelliklerini kullanın. NOT: Bu açık kaynak C tabanlı kütüphane veri setleri için iyi çalışmak için seçilen yöntemin türüne bağlı olarak piksel yama, yama kümeleme ve küme merkezi konumlandırma yapacak. Kullanılabilir seçenekler tabanlı texton için k-ortalama kümeleme aralığı 30 yaklaşımlar ve çıkış özellikleri verilen örnekli dayalı istenilen tanımlayan bir sayısal dizidir. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentasyon: Bu fu kullanınLly rağmen hesaplama pahalı, otomatik, ileri görselleştirme ve analiz için ayrı ayrı haritalar olarak yazılmış olacaktır aynı anda nesnelerin segmenti birden fazla sınıflar, yaklaşım. <ol><li> Önce oluşturulan rakamı dizisi (model) yükleyin. </li><li> Bir girdi olarak bölütlenecek model ve görüntü kullanılarak, VLFeat içinde destek vektör makinesi (SVM) işlevini çağırın. <ol><li> Komut satırında, girin: &gt;&gt; x orijinal görüntü im2_crop kırpılmış ve y nesnel görüntü, elle segmente edilmiş görüntü olduğunu = vl_svmtrain (x, y, 0.1), [b, w]. Kümeleme tarafından oluşturulan etiketlere göre sonuçları renklendirmek için &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, ETİKETLER) kullanın. NOT: modelin özelliklerine dayanarak, VLFeat sınıfların sayısına baştan atanmış (faiz özelliklerini) görüntüyü sınıflandırmak. Istenilen doğruluk derecesine bağlı olarak, başka yaklaşımlar veya tahmin Clust ile bu yöntemi birleştirmek mümkündürBöyle gövde ve küme merkezleri olarak er parametreleri. SVM algoritmasının çıktı olasılıklı bir modeli ve yeni veri istenen sınıflarının çok ikili maskeler. </li></ol></li><li> &gt;&gt; $ Biçimi &#39;tiff&#39; olduğunu imwrite (im, $ biçimi, $ dosya) ve $ dosya çıktı dosyası için yolu: komutunu girerek sonuçları kaydedin. </li><li> &gt;&gt; Imshow (im): Görüntüleri görselleştirmek için, komutu girin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

3D EM hacimleri ilgili özelliklerin çıkarılması için etkili stratejiler acilen son zamanlarda biyolojik görüntüleme vurdu veri tsunami yetişmek için ihtiyaç vardır. Veri saat veya gün içinde oluşturulabilir iken, derinlemesine 3D hacimleri analiz aylarca sürer. Bu nedenle, görüntü analiz bilimsel buluşlar için darboğaz haline gelmiştir açıktır; Bu sorunlar için yeterli çözümler olmadan, görüntüleme bilim adamları kendi başarısının kurbanı. Bu durum, aynı zamanda, yüksek veri karmaşıklığı ve tipik olarak proteinler ve protein kompleksleri sınır bir tane ve esas gri tonlama yoğunluklarda oluşan sürekli bir gradyan olarak görünür biyolojik hücrelerde bulunan yüksek moleküler kalabalık ötürüdür. Sorun numune hazırlama ve görüntüleme kusurları ile komplike, ve bazı durumlarda görüntü rekonstrüksiyonu eserler, önde gelen tam otomatik bir yaklaşım sorunlar oluşturabilmektedir mükemmel daha az hacimsel verilere edilires. En önemlisi, ancak, numune hazırlama, görüntüleme, ve biyolojik yorumlanmasında uzmanlar nadiren iyi hesaplamalı bilim usta, ve böylece etkili bir özellik çıkarma ve analiz yaklaşımı konusunda rehberlik gerektirir olmasıdır. Bu nedenle, çeşitli örnekler aracılığıyla, protokol segmentasyon verileri, yanı sıra manuel soyutlanmış modeli üretimi, otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon, ilgi özellikleri manuel izleme ve özel-uyarlanmış otomatik segmentasyon için adımlarını nasıl hazırlanacağını açıklar. Prosedür özetlenen manuel ve otomatik yaklaşımlar burada sözü bunlardan bazıları segmentasyon yazılımı, büyük bir çeşitlilik bulunabilir, ancak diğerleri benzer işlevleri yerine ve eşit derecede uygundur. Sonuçlar 3B bölütleme yaklaşımların her birinin etkinliği veri setlerinin her farklı tip için farklılıklar olduğunu göstermektedir. Hatta s farklı yaklaşımlar niteliksel üretilen olsaimilar 3D render nihai ürün olarak, zaman ve çaba miktarı önemli ölçüde değişmiştir segmentasyon işlemi sırasında her geçirdi. Uygun görüntü özellikleri ve segmentasyon başına yaklaşım kişisel amaçlar için öneriler ayrıca aşağıdaki dört alt bölümlerde açıklandığı Şekil 5, özetlenmiştir. Bu kriterler Şekil 6 karar akış şemasında gösterildiği gibi Şekil 5 rağmen., Altı veri setlerine uygulanmış ve 6 yalnızca Her veri kümesi için bir gerekçe sağlamak içindir ve kriterlerin her karar verme sürecinde ağırlıklı nasıl, Onlar kusursuz bir rehberlik değil, bir başlangıç ​​noktası yoktur. Karar verme sürecini etkileyen pek çok kriter sadece vardır: diğerleri gibi istenen bir hedef olarak daha öznel ölçütleri, oysa bazı tür bir veri seti özellikleri gibi objektif kriterler vardır. Bu yüksek lev gösterdikleri veri setleri söylemek güvenli olduğunukeskin net sınırları ile kontrast el, iyi ayrılmış ve (çok çeşitli değil) nispeten homojen ve nesnelerin çok sayıda için bir yoğunluk modeli görüntüleme amacı ile işlenen özelliklere sahip, otomatik yaklaşımlar, üstün olacaktır için değil eğer manuel yaklaşımlar sadece kaynak (zaman) -prohibitive olacağını gerçeği. Kontrast düşükse Öte yandan, veriler bulanık ve böylece, nesneler kalabalık ve özellikleri yüksek bir çeşitlilik göstermektedir ve dolayısıyla heterojen olan bir uzman bilgisi gerektirir, bir manuel özellik çıkarımı dışında başka seçeneğim yok olabilir / segmentasyon. Manuel Düsünce Modeli Üretimi Manuel soyutlanmış modeli izleme, lineer elemanları segmentlere otomatik (sopa) bağlanabilir tohumlar noktaları (topları) sağlamada etkilidir. Bu tür topları ve sopalarla-modelleri uzunluğu a ölçmek için çok güçlü olabilirnd bu modelin yönelimi ve nitel muayene ve kantitatif analiz hem de yeterli derecede soyutlanması modeli sunar. Analizine harcanan kaynakların en aza indirilmesi yaygın biçimde kullanılmaktadır Manuel soyutlanmış model üretme orijinal veri şekilleri mutlak sadakat daha önemlidir. Bu ilgi doğrusal ve homojen özellikler (örneğin, filamentler, borular) ile en başarılı olduğunu. Veri kontrast, netlik ve kalabalığımızın sürece insan gözü ilgi nesnesi tanımadığı gibi, bu yöntemin başarısını belirlemede önemli bir rol oynamaz. Bazen bu tür modelleri de segment bir iskelet iskelet çevresindeki bir bölgede 3 boyutlu harita olarak kullanılabilir. Anahtar modeli yerine tam bir yoğunluk yansıma olmasına rağmen, 3B yoğunluk skeletonize versiyonunu temsil eder ve bu şekilde karışık olmayan bir görüntüleme ve kalitatif analizi sağlar. Uzunluk gibi sayısal ölçümler de yaklaşık modelinden belirlenebilir. Bir içinmanuel soyutlanmış modeli nesil yazılım örneği, online Chimera ayrıntılı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . İlgi Özellikleri Manuel Takip Manuel fırça izleme hemen hemen tüm veri özellikleri ile iyi çalışır, ama aynı zamanda yöntemini en zaman alıcı olduğunu. Bazen, bu tür ince ve kıvrık hücre zarı gibi özellikler, büyük bir çeşitlilik içeren karmaşık bir görüntü kümesinden ilgilendiren önemli bir özelliği ayıklamak için tek tekniktir. Ilgi özelliği sorunsuz değiştirdiğinde bazı programlarda mevcut yararlı bir araç aralıklı segmentlere dilimleri arasında enterpolasyon sağlar. Veri berrak ve yüksek kontrast ortam maddesine sahip olan, elle izleme en verimli şekilde tatbik edilebilir, fakat aynı zamanda kullanılabilirkullanıcı sürece daha zorlu veri setleri, ilgi nesnesi ile tanıdık. Veri karmaşıklığı nesneleri yakından dolu karmaşık ve kalabalık veri setleri, ayrık nesneler değişebilir. Otomatik yaklaşımlar genellikle segment istenilen hacmi mücadele ve çok fazla veya çok az ayıklamak gibi ikinci durumda, manuel segmentasyon, tek seçenek olabilir. Böyle dolambaçlı levhalar veya hacimleri gibi zor özelliği Morfolojileri, ayrıca bu yöntemle elde edilebilir. Ilgi özellikleri yüksek nüfus yoğunlukları segmentasyon zaman engelleyici olur gibi ilgi özelliklerin nüfus yoğunluğu, düşük Ancak, kullanıcının birkaç zor özelliklere sahip bir veri seti sadece segmente edilebilir akılda tutmak gerekir. Manuel takibi ile bir yazılım, örneğin, online Amira detaylı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. Otomatik Yoğunluk tabanlı Segmentasyon Manuel tekniklerinin aksine, otomatik yaklaşımlar genellikle görüntüleri büyük bir yığını segmentlere dikkate alınması gereken önemli bir faktör daha az zaman alıcı vardır. Ancak, basit eşikleme olarak doğru olmayabilir, ve çok daha fazla zaman otomatik olarak bölümlenmiş hacmi arıtma ve kürasyonunda harcanan olabilir. Otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon tüm segmentasyon gerektiren ilgi benzer özelliklere sayıda gösterilecek veri kümeleri üzerinde en iyi çalışır. Veri daha karmaşık ise, bu otomatik teknikleri hala bir ilk adım olarak hizmet edebilir, ancak ilgi özelliğini içeren bir subvolume belirtmek için satır aşağı bazı manuel müdahale gerektirir. Bu strateji genellikle doğrusal morfolojilere veya kıvrık birimlerde iyi çalışıyor, ama bunun gibi ince kıvrık yaprak ile nadiren başarılıhücre zarları. Yüksek sadakat karşılığında zaman gibi birkaç kullanıcı kaynakları sokmaksızın ise otomatik yaklaşımları ile en az kullanıcı müdahalesi, büyük veya küçük hacimlerde yoluyla segmentasyon sağlar. Otomatik yoğunluk tabanlı segmentasyon ile bir yazılım, örneğin, online Amira detaylı kullanım kılavuzunu ziyaret edebilirsiniz <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . Özel-Tailored Otomatik Segmentasyon Özel tasarlanmış otomatik segmentasyon, belirli bir veri kümesi için algoritmalar güç özelleştirme sağlar, ancak genellikle önemli özellik sınırlı sayıda uygun veri seti veya veri türü, özeldir ve kolayca genelleştirilmiş olamaz. Burada görücüye prosedürü, havza daldırma ve diğer düzeyi gibi genel otomatik segmentasyon yaklaşımları farklıdır<html> Bu tohum noktalardan hızlı yürüyen küp yayılımı takip kritik başlangıç ​​vokseli bir programlanmış belirlenmesine dayanan grubu yöntemler,. Bu tema üzerine bir varyasyon gradyan vektör bilgilerini özellik sınırlarını bildirir sınır segmentasyon, olduğunu. Aksine, burada kullanılan özelleştirilmiş komut kullanıcı manuel olarak birkaç örnek izleri bir eğitim sahnede dayanır. Makine öğrenme yoluyla, belirli algoritmalar algılamak ve daha sonra bağımsız tutarlı izleri bulunan özellikleri ve veri özelliklerini tanımayı öğreneceksiniz. Algoritmaları yeniden eğitmek ve örnek daha dahil ederek segmentasyon doğruluğunu artırabilir uzman bir kullanıcı özelliği kriterleri daha büyük bir dizi sağlamak için izler. Curation sadece manuel izleme gibi yoğun emek olarak olabilir Genel olarak, eşikleme ve ilgili yaklaşımlar, hatta müşteriye özel yaklaşımlar, organellere veya şekillerin karmaşık çeşitliliği ile bir görüntünün ilgi tek bir özelliği ayıklamak için yararlı olmayabilir. &quot;&gt; Veri triaging ve Segmentasyon Yaklaşımı seçimi için Stratejiler Şekil 5, Şekil 4 ve uygun veri setleri özetinde gösterilen subjektif ve objektif kriterler dikkate alındığında, Şekil 6&#39;da karar verme düzeni veri setlerinin büyük bir çeşitlilik için özellik çıkarma stratejileri etkili bir değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Veri setleri, Şekil 4&#39;te sunulan dört ilgili hedefleri yanı sıra, iki öznel kriterlere herhangi birini içerebilir, her biri dört ardışık karardan içinde yanıtlanması edilir. Bir örnek olarak, Şekil 6, altı, her veri triaging için rasyoneldir setleri Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Kuşkusuz, orada bir tek, benzersiz bir yol değildir, ancak her bir veri seti için t yol açabilir karar verme için değişik kriterler aşağıdaki Bu matris boyunca oldukça farklı yollarıveri segmentasyonu için aynı veya farklı bir öneri o. Her veri seti tahmin edilemez özellikleri, kendi seti var olsa da, altı örnekler her tercih özellik çıkarma / segmentasyon yaklaşımın arkasındaki mantığı bir açıklama ile eşleştirilmiş, verilir. Çoğu da alternatif bir rota karar aynı veya farklı bir bölümleme yaklaşımın kullanımı ya sonuçlar (Şekil 6) için bir teklif içermektedir. Kinocilium otomatik yaklaşımlar daha olası başarılı kılan açıkça tanımlanmış sınırları, seti net veridir. Tüm ilgi özellikleri de yine otomatik bir yaklaşım lehine, ayrılır. Buna ek olarak, söz konusu özellikleri, özel olarak uyarlanmış segmentasyon için nispeten homojen bir veri seti ideal hale getirir, birbirine benzer. Son olarak, amaç, bir yarı otomatik yaklaşımlarla, bütün özelliği elde etmek olmuştur. Sonuç olarak, bundan, otomatik bir eşik (Katı yeşil hat) yanı sıra özel tasarlanmış (örneğin,) denetimli segmentasyon şekil yaklaşımı (noktalı yeşil hat) hem bu veri kümesi üzerinde de yapmak olasıdır. Karar verme ağda farklı bir sırayla yerleştirilir, ancak benzer kriterler, bakteriler durumunda uygulanır. Bu veri seti çok büyük oldu çünkü kişiye özel yaklaşım bölümünde tavsiye edilir; dolayısıyla, sınırlı kaynaklar, emek-yoğun manuel müdahale / segmentasyon yaklaşımı yasaklamaktadır. Eşikleme kabul edilebilir sonuçlar vermiştir isterken, özel olarak tasarlanmış bir yaklaşım bakteri-arasında veya hemen yanında bakteri ya bulunan hücre dışı metal yataklarının, gelen yuvarlakça bakteri şekilleri ayırmak için çalışmanın temel hedeflerinden yürütmek başardı, ve bu nedenle kişiye özel bir yaklaşım tercih edilmiştir. Stereocilia veri setleri için, önceliğiniz istenen hedefidir: hedefi tüm yoğunluğunu göstermek için olabilir, yaveya geometrik modeller oluşturmak için. Ilgi hacmi kalabalık bir alanı oldu ve objektif segmente sonradan vb yardımcı oldu uzunlukları, sayılar, mesafeler, oryantasyon, dahil kantitatif hacimsel analizini yürütmek için ayrılmış nesneleri gibi nesnelerin çok sayıda olduğu bir nesneler faiz ağırlıklı olarak lineer vardı ve bu seçim yöntemini izleme geometrik modelini yaptı. Ancak, bunun yerine objektif bir otomatik eşikleme protokol mümkün kılacak keskin tanımlı sınırları ile tüm yoğunluğu, daha sonra doğrusal özelliği morfolojisini yanı sıra nispeten yüksek kontrast göstermek olmuştur eğer. Hücre zarları ve mitokondri veri olgu özelliği morfoloji kendi kategorilerine otomatik yaklaşımlara karşı çıkıyor: kıvrık yaprak ve hacimleri, sırasıyla. Amaç doğru hücre ya da mitokondri anahat iz olduğunu, ancak bunu yapmak için sadece sonlu kaynaklar vardır. Inter Buna ek olarak, özelliklerest karmaşıktır ve mitokondri veri muhtemelen daha fazla özelleştirme ile tatbik edilebilir bakteri için alınan özel komut dosyası yaklaşımı setleri için rağmen, kolayca otomatik olarak algılanır veya şekil kodlanmış olamaz. Neyse ki, zar ve mitokondri kendilerini sadece bütün hacminin bir kısmını teşkil eder, ve bu nedenle, mekanik izleme zaman alıcı bir yaklaşım olsa bir basittir. Kontrast oldukça düşüktür ve sınırları oldukça bulanık olduğunda Manuel izleme ayrıca veri setleri için tercih edilen bir yöntemdir. Onlar veri setlerinin önemli bir bölümünü teşkil bile Sonuç olarak, bu tür dolambaçlı yaprak elle basitçe nedeniyle daha iyi bir alternatif olmadığı için, takip edilmelidir. Amaç segmenti yoğun aralıklı ve kalabalık bir sahne oluşturan tüm nesneleri, oldu, çünkü bitki veri seti kendi zorlukları poz verdi. Yoğunluğu gösteriliyor as-is şekli ve nesnelerin organizasyonu, ama b hakkında ölçümleri sağlayacakecause elle her ipliksi nesne, otomatik eşikleme yerine çok masraflı istihdam edildi edilir segmentlere. 3D modeli oluştururken çeşitli aşamalar ve ilgili sonuçları burada görüntülenir edilmiştir, ama daha da önemlisi, bulunan veri özellikleri ve kişisel kriterler segmentasyon iyi yolu da izah edilmiştir belirlenmesinde önemli olması. Görüntü verilerinin kendisi önemli özellikleri aksine, kalabalık, canlılık ve farklı şekil ya da (örneğin, organeller, filamentler, membran gibi) özelliklerin sayısı olarak burada açıklanan bir yer alır. Subjektif kriterler (ölçüm / sayma, iskeletize temsil veri / 3D renderings hacimleri görüntüleme), ilgilenilen özellik morfolojik özellikleri (doğrusal, uzun ağ, karmaşık, dolambaçlı), yoğunluğu segmentasyon amacı istenen dahil düşünün bütün hacmi (olan nesnelerin fraksiyonuna göre ilgi özellikleriönemli ve) ayıklanması gereken ve orijinal veri segmentasyon sadakat kaynakları sokmaksızın tradeoffs ve kaynakların önemli ölçüde daha yüksek tahsisi için artan iyileştirmeler sonuçlanan yatırım azalan getiri dengeleme. Görüntü segmentasyonu alanı anlamlı son yıllarda olgunlaştı, henüz gümüş kurşun, hepsini yapabilirsin hiçbir algoritma ya da program var. Veri seti boyutları rutin onlarca gigabayt megabayt yüzlerce büyüdü, ve şimdi neredeyse imkansız manuel segmentasyon yaparak, terabayt aşan başlıyor. Böylece, daha fazla kaynak, insan karar verme süreci taklit zeki ve zaman etkin özellik çıkarma yaklaşımları yatırım gerekir. Bu tür çabalar (Google Earth benzeri) anlamsal hiyerarşik veri tabanları, (2) veri soyutlama teknikleri (yani, geçiş tabanlı (1) coğrafi bilgi sistemi (CBS) ile kombine edilmesi gerekecektirBilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı sık sık kullanılan olarak, (3) simülasyon teknikleri, önemli ölçüde veri miktarını azaltmak ve böylece daha büyük hacimli 35 görüntü sağlayan amacıyla uyumlu geometrik / hacimsel gösterimi için bir vokselin) den mühendislik disiplinleri gibi (oyun endüstrisi için geliştirilen ne benzer) sinek-yoluyla animasyonlar dahil (4) gelişmiş animasyon ve film yapma yeteneklerini,. Açıkçası, verimli özellik çıkarma ve segmentasyon, farklı veri türleri için alınmış hücresel yüksek çözünürlüklü görüntüleme önümüzdeki devrimin kalbinde daha iyi yaklaşımlar her zaman ihtiyaç olacaktır olurken, ve, ilkeler Burada sunulan, yanı sıra ne yaklaşım örneklerini yatıyor almak için yaklaşım hangi bir karar için bazı değerli bilgiler sağlayacaktır.

Geleneksel olarak, elektron mikroskobu (EM) alan 1) yüksek ve süper yüksek çözünürlüklü TEM kullanarak yapısal biyoloji dalı ayrılmıştır, genellikle örtülü veya açık veri ile makromoleküler komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını araştırmak için ortalama ile kombine tanımlı bir bileşim ve tipik olarak nispeten küçük boyutlu 1-4 ve bütün sahneleri hücresel 1,5,6 görselleştirilir, 2) hücresel görüntüleme dalı. Yapısal biyoloji dalı son dört yılda muhteşem bir gelişme geçirmiş olsa da, hücre biyolojisi şube çoğunlukla, çoğu az-daha-iyi şekilde korunmuş örnekleri üzerinde, iki boyutta sınırlandırılmıştır. Sadece son on yılda elektron tomografisi gelişine tipik hücresel sahnelerine ve böylece ilgi özellikleri olarak yapılamaz ortalama üçüncü boyut 5,7, içine genişletti hücre biyolojik Ultrastrüktürel görüntüleme sahiptir, genellikle benzersizdir. Görüntülenmiştir hücresel sahneler sık ​​sık göze çarpıcı olsa da, tam olarak protein bileşiminin, genellikle bilinmemektedir, çünkü, bu tür yüksek ilgi ve kompleks hücresel hacimlerinin sonraki kantitatif analiz özellikleri etkin bir ekstraksiyon dolayısıyla bu hücresel yorumlamak için daha zor bir hale getirmektedir, kısmen, geride 3D hacimleri. Bu tarihe kadar, geniş bir biyolojik uzmanlık çoğu kez karmaşık tomogram yorumlama, ya da 3 boyutlu hacim önemli bölgeleri ve temel bileşeni tanımlamak için gereklidir. Bir diğer komplikasyon olarak, 3D hacimlerinin görselleştirme derece saçmadır olmayan. 3D hacimleri düşündüm ve böylece 2B görüntülerin yığınları olarak görülebilir. Sıralı 2D görüntülerin dilim-dilim muayene karmaşıklığını azaltır, ama aynı zamanda sınırları iki boyutlara çıkarma ve dolayısıyla kantitatif analiz bulunmaktadır. Ancak, çoğu 3D nesneler için, 3D hacimlerinin tasviri olarak sadece ardışık uçaklarının bir yığın eksik bir yol açarBelirli bir sistemin 3D doğanın içine d çarpık bakış açısı. Görsel denetim alternatif modları bir hücresel genellikle yoğun doğasını-verilen ya hacim görüntülemesini veya yüzey işleme gerektiren hacim-can böylece interaktif manuel segmentasyon zorlaştırır, kolayca iç içe nesneleri bir engel görünümüne yol veya tamamen bir kullanıcı korkutur. Bu engelleri, otomatik özellik çıkarımı büyük bir çeşitlilik giderilmesi için (segmentasyon) yaklaşımlar tipik density- veya gradyan tabanlı 8-10 ya olduğu geliştirilmiştir. Bazı yeni yöntemler ilgi belirli bir özelliği hedefleyebilir rağmen Ancak, bu yöntemleri gibi aktin filamentler 11 gibi, ne olursa olsun alanları veya özellikleri uzman ilgilendiren hangi segmentine tüm hacmi eğilimindedir. Buna ek olarak, otomatik bir segmentasyon yürütme programları, bazen, örneğin, su havzası immersio olup, (alt miktarlar çok sayıda üretilmesiyle sonuçlanabilirgenellikle ilgi tüm özelliğini içeren ya da daha fazla segmentasyon tabi manuel olarak geri birleştirilecek gerekir n segmentasyon). Bu nedenle çoğu render bilgisayar algoritmaları genellikle istenen bir bölümlenmiş hacmi üretmek için gerekli olan bir uzman tarafından, sadece sadakat ile ilgi özelliklerini ve önemli curation çabaları ayıklamak için veremiyoruz, özellikle karmaşık ve kalabalık veri setleri için de geçerlidir. Ayrıca, oldukça belirli bir probleme özel çözümler genellikle onları geniş olması konusunda bir vurgu ile küçük bir bilimsel toplantı kağıdı olarak yayınlanan ve matematik, bilgisayar bilimi ve / veya alanların samimi bilgiye sahip değilsiniz araştırmacılara kapsamlı araçları erişilebilir edilir bilgisayar grafikleri. Görüntü analizi kütüphanelerin bir dizi içeren bir özelleştirilebilir programlama yazılımı ortamı, kullanıcıların verimli, doğru segmentasyon için kendi modülleri yazmak için izin güçlü bir araç seti olabilir. Ancak, bu yaklaşım ext gerektirirensive eğitim ve birçok özellikleri veya görüntü analizi için yeteneklerinden yararlanmak amacıyla bilgisayar bilimi arka plan. Bir çevrelerini 12,13 ilgi nesneleri ayırmak için &quot;şablonlar&quot; eşsiz geometrisine bağlı güçlü şekil-tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, örneğin özellikleri daha seyrek olan bazı veri setleri, böyle çok yönlü bir yazılım ortamında çalışabilir . Bilgisayar grafik görselleştirme paketleri adil çeşitli interaktif manuel segmentasyon ve model bina var. Kaliforniya San Francisco Üniversitesi Chimera 14, Colorado imod 15 Üniversitesi ve University of Texas Austin VolumeRover 16: diğerleri akademik kökenli ve gibi, ücretsiz dağıtılan Bazı paketler piyasada mevcuttur. Ancak, bu programlar sahip özellikleri ve yetenekleri geniş ve karmaşıklığı ea için öğrenme eğrisi dikleşirch. Bazı görüntüleme programları gibi topları ve karmaşık 3D hacminin basitleştirilmiş bir modeli oluşturmak amacıyla yoğunluk haritaları içine konabilir çeşitli boyutlarda, sopalarla gibi basit geometrik modelleri sağlamak. Bu modeller daha sonra basit geometrik ve hacimsel ölçümleri ve bu nedenle sadece &quot;güzel bir resim&quot; ötesine izin verir. Nesnelerin tür el izleme nesnelerin sadece az sayıda takip ve ekstre edilmesi için gereken miktarlar için iyi çalışır. Ancak, kullanarak büyük hacimli 3D mikroskobik görüntüleme son gelişme ya odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobu (FİB-SEM) 17-20 veya seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) 21 3D veri büyüklüğünün ek komplikasyon sunar setleri onlarca gigabayt ve gigabayt yüzlerce ve hatta terabayt kadar uzanabilir. Bu nedenle, büyük 3D hacimleri manuel özellik çıkarımı için neredeyse erişilemez ve dolayısıyla verimli bir kullanıcı güdümlü yarı-otomatik Feature çıkarma öngörülebilir gelecekte 3D hacimlerin verimli analizi için darboğazları biri olacak. Rutin biyolojik görüntü türleri geniş bir yelpazede kullanılan dört farklı segmentasyon yaklaşımdan burada sundu. Bu yöntemler daha sonra biyologlar kendi verilerin etkin özellik çıkarımı için iyi segmentasyon yaklaşımı ne olabilir karar vermenize yardımcı olacak bir rehber haline bir derleme izin veri setleri farklı türleri için kendi etkinliği için karşılaştırılmıştır. Ayrıntılı kullanım kılavuzları açıklanan programların çoğu için mevcut olduğundan, amaç bu özel paketlerinden herhangi biri ile potansiyel kullanıcılar aşina yapmak değildir. Bunun yerine, amaç farklı özelliklere sahip altı örnek veri setleri bunları uygulayarak bu farklı segmentasyon stratejileri ilgili güçlü ve sınırlamaları göstermektir. Bu karşılaştırma ile, bir kriter dizisi ya da bir nesnel görüntü özelliklerine dayanmaktadır geliştirilmiştirÖrneğin segmentasyon için istenen amaç olarak subjektif değerlendirmeler, veri aksine, canlılık, kalabalık ve karmaşıklık, ya da sap gibi 3 boyutlu veri setleri, özellikleri morfolojileri kısmını yani, ilgi özelliklerinden nüfus yoğunluğu, bölütlenecek ilgi özelliği ve nasıl gelinir optimal böyle bir zaman ve personel durumu gibi sonlu kaynaklarla tarafından işgal hacmi. Bu farklı bir örnek veri setleri bu objektif ve subjektif kriterler veri setleri belirli türleri ile belli özellik çıkarma yaklaşımları eşleştirme elde kombinasyonlar çeşitli sıralı olarak uygulanabilir nasıl göstermektedir. Umarım acemiler yardımcı olacak verilen tavsiyeler segmentasyon seçenekleri büyük bir çeşitlilik ile karşı karşıya kendi 3D hacim için en etkili segmentasyon yaklaşımı seçin. Bu çalışmanın odak noktası veri toplama ve ön-işleme verilere özellik çıkarımı, dikkat iken verimli s için çok önemlidiregmentation. Çoğu kez numune boyama düzensiz olabilir ve bu nedenle, potansiyel boyama eserler bölütleme prosedür dikkate alınmalıdır. Ancak, leke genellikle daha yüksek sinyal-gürültü verir, ve bu nedenle daha az filtreleme ve potansiyel olarak da eserler neden olabilir hücresel hacimleri, diğer matematiksel tedavi gerektirir. İlgili ham görüntü veri setleri 3D hacim içine, doğru kontrast ve kamera piksel ayarlarında edinilen hizalanmış ve yeniden inşa edilmesi gerekiyor. Tomografi için hizalanır görsel ağırlıklı geri-yansıtma kullanılarak, tipik olarak yeniden edilir ve daha sonra bu veri kümesi, genellikle, doğrusal olmayan bir anizotropik difüzyon 22, iki taraflı filtre 23 ya da 24, filtreleme yinelemeli algoritmalar medyan denoising tabi tutulur. FIB-SEM ve SBF-SEM görüntüleme verileri gibi ImageJ 25 gibi XY kullanan programlarda çapraz-ilintisi ardışık kesit hizalanır. Kontrast geliştirme ve filtreleme özelliklerini artırmak için uygulanabilirfaiz ve böylece görüntü yığınını gürültü de için. Filtreleme yaklaşımlar hesaplama pahalı olabilir Filtreleme, seçimi veya seçilen hacimler üzerinde subvolume önce tüm birimdeki ya yapılabilir. Veri önemli görülen çözünürlüğü ile karşılaştırıldığında örneklenmiş olması durumunda aşağı örnekleme zaman gürültü azaltma ve / veya dosya büyüklüğü azaltılması için kullanılan verileri (kutulamanın), ve, sadece önerilir. Gürültü azaltma sonra, işlenmiş görüntüler daha sonra çeşitli yöntemlerle göre segmente edilebilir ve bu çalışmada odak aşağıdaki dört üzerinde: bir top-ve-sopa modeli yaratarak (1) manuel soyutlanmış modeli nesil (2) manuel izleme Projeye özel segmentasyon için bir komut dosyası aracılığıyla ilgi, (3) otomatik eşik tabanlı yoğunluk ve (4) özel uyarlanmış otomatik segmentasyon özellikleri. Sınır segmentasyon 8 ve sürükleyici havza segmentasyon 10 basit eşikleme için daha iyi alternatifler vardır, ama they aynı kategorideki aittir ve bu tartışmada açıkça dahil edilmemiştir. Yoğunluk elle izleme dilim-dilim-ilgili alt-alanlarında hücresel orijinal yoğunluğa tutulmasını sağlar, söz konusu özellikleri de ortaya gerektirir. Bu yaklaşım segmentasyonu sürecinde maksimum kontrol sağlar, ama sıkıcı ve emek-yoğun bir işlemdir. Bir algoritma kullanıcı tanımlı parametreleri bir dizi dayalı pikselleri seçer nerede otomatik eşik tabanlı (ve ilgili) yoğunluk segmentasyon yaklaşımlar, yarı otomatik vardır. Böyle ucsf Chimera, imod, Fiji 26 ve VolumeRover gibi çeşitli akademik (ücretsiz) görselleştirme paketleri, paketler (ücretli lisans gerektiren) mevcuttur, yanı sıra, ticari, ve her iki tip genellikle bu segmentasyon yaklaşımlardan birini veya daha fazlasını içerir. Bu farklı yöntemler göstermek için bu çalışmada kullanılan yazılım paketleri hem ticari programları ve akademik açık s katmakelle soyut bir modelini, yanı sıra manuel ve otomatik yoğunluk segmentasyonu üretmek için ource programları. Ancak, açık kaynak yazılım bazen özelleştirme olanağı ile daha gelişmiş seçenekler sunabilir. Veri setleri farklı türleri kullanarak bu tekniklerin karşılaştırılması bilgilerimize henüz yayınlanmamış olan çeşitli biyolojik veri 3D ciltlik segmentasyon nasıl yaklaşılması üzerine aşağıdaki kurallar sunumu ve rehberlik yol açtı. Böylece, bu ilk sistematik farklı yaklaşımların karşılaştırılması ve farklı amaçlarla kullanıcılar için özelliklerinin değiştirilmesi ile veri setleri onların kullanışlılığı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

Modern 3D elektron mikroskobu yaklaşımlar son böyle yapışma kompleksleri, yanı sıra yüksek-nizam yapılarda, örneğin hücre iskeleti gibi ve hücresel organellere gibi büyük makromoleküler makineleri, görselleştirme sağlayan hücrelerin ve dokuların 3D ultrastrüktürel örgüte görülmemiş içgörü sağladı onların ilgili hücre ve doku bağlam. Hücresel hacimlerinin doğal karmaşıklığı göz önüne alındığında, ilk olarak 3D organizasyon görselleştirme, ölçme ve bu nedenle kavrama sağlamak için ilgili özelliklerini elde etmek için gereklidir. Her bir veri seti verilerin farklı özellikleri, örneğin, sinyal-gürültü oranı, zindelik (keskinlik) tarafından tanımlanan, özellikleri, özellikleri, varlığı veya kolay tanımlanması için izin karakteristik şekiller olmaması kalabalığımızın ve yüzde heterojen ilgi, belirli bir bölge işgal hacminin tamamının. Tüm bu özelliklerinin dikkate alınması gerekirkarar verirken segmentasyon için almak hangi yaklaşım. Üç farklı görüntüleme elde edildi sunulan altı farklı 3D ultrastrüktürel veri setleri yaklaşımlar: reçine gömülü lekeli elektron tomografisi, iyon beam- ve seri blok yüz-taramalı elektron mikroskobu (FİB-SEM, SBF-SEM) odaklı hafif lekeli ve ağır lekeli örneklerinin sırasıyla. Bu veri setleri için, dört farklı segmentasyon yaklaşım uygulanmıştır: (1) tam manuel model bina (3) yarı-otomatik yaklaşımlar takip yüzey sunumuna takip verileri (2) manuel izleme segmentasyon, model görselleştirme yalnızca tarafından takip yüzey işleme, veya yüzey işleme ve kantitatif analizleri takiben (4) otomatik bir özel tasarlanmış segmentasyon algoritmaları tarafından. Veri seti özelliklerin kombinasyonuna bağlı olarak, bu dört kategorik yaklaşımlar tipik olarak bir diğerlerinden daha iyi performans olduğu bulunmuştur, ancak kriterlerin tam diziye bağlı olarak, morfolinYeniden fazla yaklaşma başarılı olabilir. Bu verilere dayanarak, farklı veri setlerinin analizi için objektif veri seti özelliklerini ve öznel kişisel kriterleri hem kategorize eden bir triyaj düzeni öneriyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data at JoVE.com

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Hücresel 3D elektron mikroskobu için darboğaz oldukça karmaşık 3D yoğunluk haritalarında özellik çıkarma (segmentasyon) &#39;dir. Biz dolayısıyla etkili segmentasyon için bir başlangıç ​​noktası sağlayan, segmentasyon yaklaşımı (manuel, yarı otomatik veya tam otomatik) farklı veri türleri için en uygun olduğu konusunda rehberlik sağlamaktadır kriterleri bir dizi geliştirdik.

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Görüntüleme.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Hücresel 3D elektron mikroskobu için darboğaz oldukça karmaşık 3D yoğunluk haritalarında özellik çıkarma (segmentasyon) 'dir. Biz dolayısıyla etkili segmentasyon için bir başlangıç ​​noktası sağlayan, segmentasyon yaklaşımı (manuel, yarı otomatik veya tam otomatik) farklı veri türleri için en uygun olduğu konusunda rehberlik sağlamaktadır kriterleri bir dizi geliştirdik. 

Video: From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Biyomühendislik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Son derece eğimli oluşturmak için bir kılavuz döşeme mikroskop genişletilmiş görünümü alan tek molekül görüntüleme için süpürüldü.

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...