Cryo Soft X-ışını tomografisi, hücresel düzeyde bağımsız olarak veya diğer görüntüleme teknikleriyle birlikte kullanılabilecek kantitatif değerli bilgiler sağlayabilir. Boyama veya kesitleme için gerekli olan donmuş hidratlanmış bir durumda sensör görüntüsü. Buna ek olarak, yüksek verimli bir tekniktir, çünkü her tomogram sadece birkaç dakika içinde toplanır.
Yumuşak röntgen kriyo-tomografisi, enfekte veya kusurlu hücrelerde hücre restorasyon sürecini tek hücre düzeyinde takip etmek için mükemmel bir platform sunar. Bu teknik, redakte edilmiş fenotiplerin enfeksiyonunu geri döndürmek için yeni antiviral ilaçların veya gen tedavisinin etkinliğini bildirebilir. Numuneleri iletim X-ışını mikroskobuna yüklemek için, transfer odasını 100 Kelvin'den daha azına ulaşana kadar sıvı azotla soğutun.
İş istasyonunu ek sıvı azotla doldurun ve iş istasyonu jantının ısıtıcısını açın. İş istasyonu jantı kaynamayı durdurduğunda, ızgaraları içeren kriyo kutusunu, kriyo koşulları altında iş istasyonunda uygun yerlere yerleştirin ve ızgaraları önceden soğutulmuş numune tutuculara yükleyin. Tutucuları mekiğe yükleyin ve kapaklarla koruyun.
Mekiği transfer odasına 100 Kelvin'den daha az bir hızda yükleyin ve odayı düşük vakuma pompalayın. Transfer odasını mikroskopa takın ve transfer odası mekiğini mikroskopa yüklemek için ekrandaki vakum prosedürünü izleyin. Mekik örneklerle mikroskopa girdikten sonra, bir örnek tutucuyu numune aşamasına aktarmak için mikroskop robot kolunu kullanın.
Çevrimiçi görünür ışık mikroskobu ile ızgaranın parlak alan görüntülemesi için, görünür ışık mikroskobu kamerasını seçin ve parlak alan görüntüleme için görünür ışık mikroskobu LED kaynağını açın. Görünür ışık mikroskobu hedefine bakacak şekilde numuneyi eksi 60 dereceye döndürmek için Hareket, Kontrol, Örnek ve Örnek teta'ya tıklayın ve Hareket Kontrolü ve Örnek'i seçin ve örneği beklenen ortalanmış konumlara taşımak için X ve Y örneğini değiştirin. Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Sürekli ve Başlat'ı seçin ve karbon destek filminin hücreleri ve/veya delikleri netleşene kadar odağı beş mikrona kadar daha küçük adımlarla hassaslaştırmak üzere Z örneğini seçmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi tıklatın.
Ardından, mozaik için varsayılan değerleri kullanarak parlak alan modunda ızgaranın tam mozaik haritasını almaya başlamak için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Mozaik ve Başlat'ı seçin. Floresan modu mozaik görüntüleme için, parlak alan görüntüleme için görünür ışık mikroskobu LED kaynağını kapatın ve istenen uyarma dalga boyuna karşılık gelen LED ışık kaynağını ve ilgili optik filtreyi kurulumda manuel olarak seçin. Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Edinme Modları, Sürekli ve Başlat'ı seçin ve floresan görüntüye odaklanmayı hassaslaştırmak üzere Z örneğini seçmek için Hareket Kontrolü ve Örnek'i tıklatın.
Ardından, parlak alan mozaiğinden konumsal X ve Y parametrelerini koruyan bir mozaik harita almak için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Mozaik ve Başlat'ı tıklatın. Ardından, LED ışık kaynağını kapatın. X-ışını mozaik alımı için, çıkış yarığını beş mikrona değiştirin ve MISTRAL'de bir saniyelik bir pozlama kullanın.
Örnek Z çevirisini kullanarak odağı ayarlamak için Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Kamera Ayarları ve Binning'i seçin. Numune Z.Beş mikronluk adımlarla başlayarak, hücre veya karbon folyo delikleri iyi odaklanana kadar odağı 0,5 mikronluk adımlara kadar hassaslaştırın. Ağ karesinin mozaik haritasını almak için Mikroskop, Edinme, Edinme Ayarları, Edinme Modu, Mozaik ve Başlat'ı tıklatın.
Harita alındığında, Hareket Denetimi ve Örnek'i tıklatın ve örneği düz bir alan konumuna taşımak için X ve Y örneğini değiştirin. MISTRAL'de pozlama süresini bir saniyeye ayarlayın. Ardından, iletimi elde etmek ve normalleştirilmiş mozaiği kaydetmek için edinilen mozaiği düz alan görüntüsüyle normalleştirin.
Dönme eksenindeki numuneyi sıfır derecedeki dönüşle hizalamak için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve dönüş eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine odaklanmak için X, Y ve Z örneğini değiştirin. Numuneyi pozitif bir teta konumuna döndürmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve Numune tetasını pozitif teta olarak değiştirin. Döndürme eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın.
Numuneyi negatif teta konumuna döndürmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve Numune tetasını negatif teta olarak değiştirin. Döndürme eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Pozitif veya negatif teta konumundayken, seçilen unsuru her iki çizgi arasındaki merkez konumuna taşımak için örnek Z çevirisini kullanın ve minimum çizgiden satıra mesafe elde edilene kadar numune rotasyonunu tekrarlayın.
Örnek teta sıfıra eşit olduğunda, seçilen unsuru görüş alanının merkezine koymak için gereken mesafenin iki katı kadar X örneğini hareket ettirin ve özelliği görüş alanının merkezine geri getirmek için X bölge plakasını hareket ettirin. Z bölge plakası konumunu yeni dönüş eksenine göre yeniden optimize etmek için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları ve Odak Serisi'ni seçin ve bir bölge plakası Z odak serisi kaydetmek için Başlat'ı tıklatın. Ardından, Hareket Kontrolü ve Bölge Plakası'nı tıklatın ve Z bölge plakasını numunenin odaklandığı konuma taşımak için Z bölge plakasını seçin.
Bir tomogram edinmek için, Hareket Kontrolü ve Örnekle'ye tıklayın ve negatif maksimum açıyı artı 0,1'e taşımak için Örnek teta'yı seçin. Görüntü sayısını sıfır açısındaki ve açısal aralıktaki görüntüyü dikkate alarak toplam açı sayısı olarak ayarlamak için Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Alma Modları ve Tomografi'yi tıklatın ve görüntü sayısını ayarlayın. Açı Başlangıcı ve Açılı Uç'u seçin, Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Kamera Ayarları'na tıklayın ve pozlama süresini ayarlayın.
Tomografi tilt serisini satın almaya başlamak için Başlat'ı tıklatın. İdeal numune, ince bir buz tabakasına gömülü kare bir ağın merkezinde tek hücrelere sahip olmalı ve iyi dağılmış altın referans belirteçleri ile çevrili olmalıdır. Mitokondri, endoplazmik retikula, vakuoller ve çekirdek gibi birçok farklı organel, doğrusal absorpsiyon katsayılarının kantitatif rekonstrüksiyonu sayesinde, nihai yeniden yapılandırılmış tomogramda ayırt edilebilmelidir.
Bu görüntüde, daha yüksek hücre yoğunluğuna sahip bir kare gözlemlenebilir. Bu örnekte, lekelenme daha az verimliydi ve çatlaklarla daha kalın bir buz tabakasına yol açtı. Bu preparatta bazı daha büyük yapılar tanınabilse de, kalın buzun düşük vitrifikasyon kalitesi nedeniyle gürültü ve grenli doku içinde ince detaylar kayboldu.
Kriyo-korunmuş numune minimal olarak ele alınmalıdır, çünkü eserlerin çoğu bu aşamadaki örnekler indüklendiğinde indüklenir. Genellikle, korelasyon kriyo-görünür ışık fotomikroskopisi, kriyo substrat tomografisinden önce kullanılır. Ek olarak, spektral mikroskopi ilgili kimyasal elementlerde yapılabilir.
Bu protokol, başka herhangi bir doğrudan görüntüleme tekniği tarafından kolayca erişilemeyen bir numune ve çözünürlük rejiminde çalışarak, birkaç mikron ve 30 nanometre yarım adım çözünürlüğe izin vererek bir nişi doldurur.
