Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Tüm hayvan bakımı ve deneyler Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca yapılmıştır. Cocem3D daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 bir kombinasyonundan kaynaklanmıştır ve PyyGFP raportör fare 12 kullanarak belli bir enteroendokrin hücre çalışma için uygulanmıştır. Bu yöntem, hali hazırda ticari olarak temin edilebilen transgenik raportör fareler kullanılarak ilgi diğer hücrelere de uygulanabilir. Korelatif konfokal mikroskopi, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM) ve 3D rendering veriler: yöntem üç bölümlerde açıklanmıştır. Korelatif Konfokal Mikroskop Bu bölümün amacı, karşılıklı konfokal ve SBEM görüntüleme sağlayan boyutları distal kolonda bir doku segmenti hasat etmektir. aşağıdaki gibi protokol: 1. Hasat Doku <ol><li> HazırlamakPBS içinde 50 ug / ml heparin solüsyonu 10 mi. </li><li> 10 ml ketamin (100 mg / ml) ve xylazine 1 ml (20 mg / ml) karıştırarak ksilazin / ketamin anestezi stok hazırlayın. <ol><li> 0.1M PBS 4: ksilazin / ketamin Stokta 1 seyreltin. </li></ol></li><li> PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 0.1 glutar aldehit içinde sabitleyici çözeltisi bir 100 ml hazırlayın. </li><li> Ksilazin / ketamin anestezik öldürücü bir dozu ile, 6-10 haftalık bir PyyGFP fare anestezisi. Fare ağırlığı 20 g başına 0.15 ml intraperitoneal anestezik enjekte edilir. </li><li> Kuyruk veya ayak kısma doğru fare anesthetization onaylayın ve kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanın. </li><li> Fiksatif intrakardiyak 10 serpmek için bir değişken akış peristaltik pompa kullanın. Cerrahi makas kullanarak (13 cm uzunluğunda) kesim bağırsak, kalp, akciğerler ve ortaya çıkarmak için karın boşluğuna açın. Dar kalıp kavisli bir forseps (12 cm uzunluğunda) ile kalbi tutun ve peristaltik pompa gelen kelebek iğne (19 G) takın iNto sol ventrikül. Hemen, bahar düz makas (uzunluğu 4 mm) sağ atrium kesti. 2 ml&#39;lik bir oranda serpmek / dk, ilk fare kuyruk kadar 15 dakika boyunca buz soğukluğunda sabitleyici çözeltisi ile daha sonra heparin 1 dakika için çözelti ve tamamen katıdır. Not: Bu, bağırsak mukozasında küçük damarların patlamasını önlemek için yavaş bir hızda perfüze edilmesi için çok önemlidir. Gemilerin Patlama dokusunun ultrastrüktür uzlaşma olacak. Perfüzyon yeterli ise, karaciğer 3-5 dakika içinde renk soluk açmalısınız. </li><li> Kullanımı küçük makas karın boşluğu açın ve distal rektumun için çekum ile kavşağından tüm kolon tüketim. Buz soğukluğunda PBS doku yerleştirin. PBS batmış olsa da, küçük yaylı makas ile mezenter boyunca kolon açık kesti. </li></ol> 2. Doku Bölümleri Kesme ve Sabitleme <ol><li> Bir bisturi kullanılarak, distal kolon ila yaklaşık 6 Küçük doku bölümleri (2 mm2) kesti. Bir yaprak o bu yapınf diş mum ve PBS birkaç damla gömülmüş. </li><li> 4 ° C &#39;de 3 saat süre ile sabitleştirici çözelti içinde doku bölümleri sonrası sabitleyin. </li></ol> 3. Mikro-diseksiyon Doku Blokları <ol><li> Agaroz PBS içinde% 5 düşük erime hazırlamak ve 45 ° C&#39;de bir su banyosu içinde muhafaza edin. </li><li> % 5 agaroz düşük erime standart boyutta Tissue-Tek cryomold gibi, küçük bir plastik kap kullanarak doku segmentleri gömün. </li><li> Titreşimli bıçak mikrotomda gömülü bölümler monte ve buz gibi soğuk PBS ile tampon tepsisini doldurun. </li><li> 0.8 genlik ve 0.04 mm / sn hızında 300 mikron doku şeritlerini kesin. Not: Bu noktada, kağıt şeritleri agaroz yerinden edilecektir. </li><li> Yeniden embed agaroz 300 mikron doku şeritleri ve vibratome en bıçak dik mikrotomda takar. </li><li> Bir vibratome kullanarak, 50 um kadar bir kalınlıkta doku şeritler kesilir. Not: Nihai doku blokları yaklaşık 300 um genişliğinde x 50 mikron kalınlığında olacaktır. Bunlar dimensions enteroendokrin hücrenin kalınlığı 15-20 mikron ve neuropod uzunluğu 30-70 nm arasında olduğunu göstermiştir Pilot konfokal deneylerden optimize edilmiştir. Hücrenin oryantasyon doku bloğun yüzüne paralel, bu nedenle, bütün bir hücre 50 mikron kalınlığında tarafından dokuya 300 mikron genişliğinde bir blok içinde yer olabilir. Ilgi konusu doku ve hücre tipine bağlı olarak, bu boyutlar değişir. </li><li> 4 ° C de PBS içinde doku blokları saklayın. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme <ol><li> 4000: 1 PBS içinde DAPI seyrelterek nükleer leke çözüm hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca DAPI Nükleer soya doku blokları inkübe edin. Not: DAPI boyama konfokal ve SBEM görüntüleri ilişkilendirilmesi için yararlı onların çekirdekleri tarafından ayırt tek tek hücrelerin kolaylaştırır. </li><li> Tahsil cam slayt Mount doku blokları, PBS birkaç damla ekleyin ve bir lamel ile bunları kapatın. </li><li> Konfokal mikroskop kullanılarak, blok tespitbozulmamış villus ve ilgi PyyGFP hücreleri ile s ve z-process optik bölümleri elde etmek için onları görüntülenmiş. <ol><li> 1 mikron optik bölümleri z-yığınları elde etmek için bir 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat hedefini kullanın. </li><li> Z yığın için, başka hücrelere ilişkiyi belirlemek için 405 nm&#39;de (DAPI) kanalları kullanarak 488 nm endojen GFP ilgi hücre lokalize etmek ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) hücre göre konumunu belirlemek için lümen. </li><li> 1.024 piksel veya daha yüksek görüntü çözünürlüğü kullanın. </li></ol></li></ol> Agaroz 5. Gömme bloklar <ol><li> PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 2.5 glutar aldehit içinde sabitleyici 10 ml hazırlayın. </li><li> Dikkatlice doku bloğu zarar vermeden uzak cam slayt lamel slayt kapak kayma kenarları PBS eklenerek cam slayt doku blokları kaldırmak. Sonra, bir 1 slayt doku bloğu aktarmak için bir sanat fırça kullanın.5 Ml% 4 paraformaldehid ve% 2.5 glutaraldehit fiksatif içeren mikrosantrifüj tüp. </li><li> Sonrası düzeltme doku blokları O / N 4 ° C&#39;de. </li><li> PBS doku blokları aktarın. Sonra,% 5, iki cam slaytlar arasında onları sandviç agaroz düşük erime düz blokları embed. Not: agaroz ince bir tabaka halinde bloklar gömülmesi boyama esnasında arka manipülasyon kolaylaştırır. </li><li> Bir meydanda agaroz kesin ve üst tarafta bir çentik yapmak. Not: Bu adım, daha sonraki kademelerde yönünü sağlamak için gereklidir. </li><li> Daha sonra işlenene kadar 4 ° C &#39;de PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü saklayın blok. </li></ol> Seri Blok-yüz Taramalı Elektron Mikroskobu (SBEM) Bu bölümde, doku bloğu hazırlanır ve düşük büyütmede SBEM ile görüntülendi. Blok yüz anket görüntü daha sonra ilgi hücreyi içeren bölgeyi tanımlamak için konfokal verilerle ilişkilidir. Bölgede keztanımlanır, doku 7 nm / piksel ve 70 nm dilim çözünürlükte görüntülü. Bu sorunu gidermek ve diğer organelleri büyük yoğun çekirdek salgı veziküller ayırt etmek için yeterli oldu. Enteroendokrin hücrelerde, veziküller, bu tür çapı 13 ila 100 nm ila 150 arasında değişir. aşağıdaki gibi protokol: 6. Boyama Doku Bölümler <ol><li> PBS doku çıkarın ve 0.1 M kakodilat tampon içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 1 saat 0.1% tannik asit leke blok hücre zarları 14 kontrastı arttırmak için, 0.1 M kakodilat tampon maddesi içinde çözülmüştür. </li><li> Yayınlanan protokole göre 11 sonraki boyama ve doku dehidratasyon yürütmek. Deerinck et al izlenerek. Protokol, bu çözüm hazırlanması: 1)% 1 (ağırlık / hacim) thiocarbonhydrazide (THC); 2) aspartat çözüm kurşun; 3)% 1 uranil asetat ve 4) ozmiyum tetraoxyde / potasyum ferrosiyanür (OsO 4 / K ferrosiyanür). % 4 OsO 4 ve 2x karıştırın1 at [10 ml H 2 O K ferrosiyanür ve 0.86 g Na kakodilat ile 0.3] K ferrosiyanür stok: 1 oranında OsO 4 / K ferrosiyanür yapmak. Not: agaroz gömülü doku olması boyama esnasında kullanımını kolaylaştırır. Dikkatle takip eden reçine sızması için agaroz kaldırmak. </li><li> Durulama numuneler daha sonra, üç, 0.1 M kakodilat tampon içinde katı, her biri 5 dakika, 4 ° C &#39;de 2 saat süre ile OsO4 / K ferrosiyanür çözeltisi ile boyanır. </li><li> 60 ° C&#39;de 30 dakika boyunca TCH ultra saf su ile üç kez, her biri 5 dakika ve leke ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 2 OsO 4 (Resim K ferrosiyanür) ultra saf suda üç defa, her biri 5 dakika ve leke durulayın. Ultra saf su içinde tekrar üç kere, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de /% 1 uranil asetat O ile N Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 60 ° C&#39;de 30 dakika boyunca talebi aspartat ile Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> Solutio durulayarak dokuları dehydrateEtanol konsantrasyonları artan ns. % 50,% 75,% 85,% 95, ve mutlak% 100 etanol ile 2 defa, her biri 5 dakika durulayın. Sonunda, propilen oksit ile iki kez, 10 dakika her biri bölümleri yıkayın. </li></ol> Reçine 7. sızmakta ve katıştırma doku kesitleri <ol><li> Reçine, ticari olarak avaialble kiti kullanılarak bloklar sızmak. Bir EPON gömme kiti kullanılarak reçine gömün dokular. % 48 Epoksi,% 20 mi DDSA,% 30 mi NMA ve% 2 DMP30 bir reçine karışımı hazırlayın. 5 dakika boyunca kuvvetlice reçine karışımı karıştırın ve daha sonra kabarcıklar yüzeye gelmek için izin 30 dakika süreyle vakum karışımı yerleştirin. </li><li> 1 de propilen oksit ile reçine karıştırın: 1 oranını ve şiddetle çalkalanır. Dokulardan Nihai dehidrasyon durulama çıkarın ve propilen oksit ile karışık reçine ilave edin. Bir döndürücü O&#39;da örnekleri ile yerleştirin flakon / N ve flakon kapaksız bırakın. Ertesi gün, taze EPON Reçine ekleyebilir ve rotatör içinde 90 dakika boyunca karıştırın. </li><li> Onları sandviç mümkün olduğunca düz bir reçine gömün bloklarbirbirlerine 15 yapışmasını engellemek için, sıvı salma maddesi ile tedavi edilmiş cam slaytlar arasındadır. </li><li> Blok, düz gömülü sonra, 60 ° C&#39;de ilave bir 48 saat boyunca blok tedavi. </li><li> Blokları serbest bırakmak için birbirinden slaytları çekin. </li></ol> 8. Montaj ve Görüntüleme Doku Blok Kırpma <ol><li> Diseksiyon kapsamında, blok kesme önce ilgi hücreleri içeren bölgelerin belirlenmesi kolaylaştırmak için konfokal mikrograflar bununla reçine gömülü doku blokları yönünü maç. </li><li> Elle aşağı ~ 500 x 500 mm blok yüz reçine gömülü blok Trim. </li><li> 30 dakika boyunca iletken epoksi ve kuru içeren bir pim üzerine düz blok monte edin. Ardından, 60 ° C&#39;de bir yüzeye ve kuru O / N blok düz koymak. </li><li> Coat kolloidal gümüş sıvı ile blok. Co kolaylaştırmak için dik açıyla bloğun dilimleme sağlamak için doku kesitleri düz BakımSeri blok yüz ve konfokal mikrografikleri rrelating. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Görüntü SBEM sistemi ile donatılmış bir Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılarak blok (e .g., 3View). </li><li> Set başlangıç ​​kalınlığı ~ 2 mikron artışlarla bölüm ve doku yüz blok çıkana kadar kesti. </li><li> Tüm blok yüzünün surver görüntü kazanır. </li><li> Fiji yazılımı kullanarak, sabitleme sırasında ve 16 boyama örnek çözgü için ortak bir payda ve hesap oluşturmak için seri blok yüz ve konfokal hem mikrograflar ölçümleri almak. </li><li> Konfokal görüntüler koordinatlarına paydayı çarpılarak blok yüzünde ilgi alanını bulun. Bir referans olarak, mikrovillus, goblet hücreleri, ya da lamina propria konumu gibi, aynı zamanda diğer yapısal özellikleri kullanın. </li><li> En ilgi Görüntü bölge 2.25 kV ve yüksek vakum modunda 7 nm / piksel (veya 15,147X büyütme). Dilim artışları ayarlanması gerekir70 nm ya da daha az. </li><li> Ham 16-bit .dm3 formatta SBEM verileri toplayın. </li></ol> Yüzey segmentasyonu 10. Optimizasyon SBEM Görüntüler <ol><li> 8-bit tiff ham .dm3 biçiminden SBEM görüntüleri dönüştürün. </li><li> Fiji 0.8 gaussian blur filtresi kullanarak görüntüleri .tiff Filtre. </li><li> Orijinal boyutunun% 25&#39;ine veri seti küçültün ve set işlemek için gerekli olan RAM belleği miktarını en aza indirmek için bir .tiff yığınının olarak kaydedin. </li><li> Çeviri modunda Fiji eklentisi &quot;SIFT lineer yığın uyum&quot; seçeneğini kullanarak SBEM görüntülerin yığınını hizalayın ve &quot;ekin 3D&quot; eklentisi kullanarak kırpılmış. Not: Kırpma daha segmentlere ve volume rendering için gerekli RAM belleği miktarı azalır yardımcı olur. </li></ol> 3D Veri Oluşturma 11. Konfokal Mikroskop <ol><li> Otomatik &quot;yüzeyler&quot; aracı modunu aşmak kullanarak z-yığınları yeniden yapılandırma. Şekil 1D, bir rec gösterirMutlak yoğunluk olarak 0.126 um de yüzeyler alan detay, pürüzsüz seçeneğini kullanarak her kanalın onstruction ve eşikleme. </li></ol> 12. Seri Blok-yüz SEM Not: Manuel veri segmentasyonu çok zaman alıcı prosedür ve birkaç hafta sürebilir prosedürü işlenecek özelliklere bağlı olarak olduğunu. Bohórquez ark sunulan videolar ve şekiller için Segmentasyon. 2014 8 elle yapılır ve emek yaklaşık 500 saat sürdü. Bu bölümleme işlemine başlamadan önce render gerek temel özellikleri öncelik önerilir. Prosedür aşağıdaki gibidir: <ol><li> Beraberlik modunda &quot;yüzeyler&quot; aracını ve ilgi hücreyi hale manuel segment ve hacmi 50 milisaniye modu çizim &quot;kontur&quot; seçeneğini kullanın. </li><li> Yumuşak render veya daha hızlı render için her 5 dilim için hücrenin her dilim üzerinde konturları Trace. </li><li> İhracat son im300 dpi veya daha fazla bir çözünürlükte &quot;anlık&quot; aracını kullanarak yaşları. </li></ol>

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

Dr. Satish Medicetty çalışanı ve Renovo Sinir Inc% 100 maaş alır; Ancak, bu veri paylaşımı ve malzemelerde vallahi politikalarına yazarın bağlılığını değiştirmez. Çıkar çatışması kalan yazarlar için ilan edilir.

<html> Gastrointestinal chemosensation biyomedikal araştırmalarda heyecan verici yeni bir alan olarak ortaya çıkmaktadır. Bunun nedeni enteroendokrin hücrelerinde 18 fonksiyonel tat reseptörlerinin keşfine büyük bir parçası olduğunu. Daha sonraki çalışmalar, enteroendokrin hücreler karbonhidratlar, yağlar, amino asitler ve 5,6,19,20 içeren besin, özel reseptörlerini ifade olduğunu göstermiştir. Bu keşiflerin katalitik etken enteroendokrin hücreler, flüoresan 20 etiketli olan raportör farelerin geliştirilmesi olmuştur. Distal ince bağırsak ve kolon 17,21 enteroendokrin hücreleri incelemek için, bu farelerde biri PyyGFP fare geliştirdi. Tokluk 22,23 indükleyicileri, her ikisi de PYY ve glukagon-benzeri peptid 1, salgılayan çünkü bu hücreler, ilgi çekicidir. Anda, bu hücrelerin tam bir ultra-yapısal hesap biz onların sinyal mekanizmaları anlamak için gerekli olduğuna inanıyordu ki, eksik oldu. &quot;ontent&gt; Burada SBEM ile konfokal mikroskopi köprü görsel bir yöntem tarif. yöntem bize enteroendokrin hücrelerinin tam ultrastrüktürünü belgelemek için. Biz bu hücrelerin üç içeren bir neuropod sahip olduğunu bildirmiştir izin Cocem3D olarak adlandırılır Hücreleri enteroendokrin bu neuropods fiziksel olarak nöronlara bağlanmak olsa salgı veziküllerin 8 tüm dörtte. neuropod içinde nörofilament ve nöronal akson gibi çok var, neuropods enterik glial hücreler 8 ile beslenir. Daha da önemlisi, o bağırsak innerve ve Kolon 9. Cocem3D güçlerinden biri sadeliği olduğunu. Konfokal tarafından görüntülenmiş ve SBEM bir doku içinde belirli bir hücre belirlenmesini kolaylaştırır edilebilir bir bloğa doku örneği azaltılması. Salgı keseleri ve diğer organeller 7 nm / piksel çözünürlükte kolaylıkla tespit edilebilir. SBEM bölümler atılır için, başka süreçproteinlerin belirli dokuların şarkı, bu noktada bir seçenek değildir. Bununla birlikte, bu doku bloğu kesitleri muhafaza edildiği atum 24 gibi yöntemlerinin geliştirilmesi, hücre spesifik proteinlerin tanımlanmasını sağlamak olasıdır. Enteroendokrin hücreleri beyinde bağırsak ve tokluk gıda arasında duyusal bir arayüz olduğundan enteroendokrin hücreleri üzerinde kimyasal-duyusal reseptörleri belirli bir konuma belirlenmesi, obezite için ilaç tedavilerinin geliştirilmesi için gerekli bilgilerdir.

Bir hücrenin içinde hayat zaman ve mekan yer alır. Zamanla değişiklikler genellikle süper çözünürlük mikroskobu gibi floresan görüntüleme teknikleri ile kombine time-lapse mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. Uzay, bir hücre ya da hücre-hücre etkileşimleri içindeki organellerin düzenlemesi, özellikle, sadece hücre ince yapısı tam bir hesabı ile elde edilebilir. Bir hücrenin ince yapısı kapsamlı bir hesabı da C gibi, genom mevcut olduğu durumlarda genomik işlevine açıklık getirebilir elegans nematod 1 veya düz placozoa tricoplax 2. adherens. Seri kesit elektron mikroskopisi artık verimli tekrarlanabilir, zaman ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu 3 (SBEM) gibi otomatik 3D elektron mikroskopisi teknolojilerin geliştirilmesi, daha ucuz bir görev sayesinde. fonksiyonu aydınlatmak için yapısal bilgiye ihtiyaç belli cel çok açıktırnöronlar, glia ya da duyu epitel hücreleri gibi işlevi fiziksel hücre-hücre etkileşimlerine bağlıdır l türleri. Biz bağırsak lümeninde besin duyusal sinyaller sonuçta appetitive davranışları modüle bir elektrik sinyaline dönüştürür transdük nasıl durulaştırmada özellikle ilgilendi. Devre karmaşıktır, ancak besin duyu epitel hücreleri, adı enteroendokrin hücreleri ile temas haline geldiği bağırsak duvarından başlar. Mesela lezzet hücreleri gibi diğer duyusal epitel hücreleri, farklı olarak, enteroendokrin hücreler bin 4-7 arası bir oranda bağırsak epiteli boyunca dağılmıştır. Sonuç olarak, onlar tanımlamak ve incelemek için zor olmuştur, ve uzun bir süre için sadece bağırsak hormonları kaynağı olarak görüldü. Ama hücre özel floresan muhabiri farelerin gelişmesiyle birlikte, bu hücrelerin karmaşık duyusal işlevi ortaya çıkmaktadır. Bu muhabir farelerin birini bir peptid YY-GFP (PyyGFP) Fareyi kullanarak, biz o enteroendocr bulunduine hücreleri biz neuropod adında ünlü bir sitoplazmik kuyruk var. neuropods görünümü, hücre-hücre bağlantılı bir korunmuş işlevi önerdi. Böylece, bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürünü belgeleyerek, neuropods fonksiyonu elde edilebilir ki gerekçeli. tespit edilmesi zor bir dağınık hücrede bir uzantısı yapısını anlamak için ihtiyaç konfokal mikroskopi ve SBEM birleştirmek için bir yöntem geliştirmek için ana gerekçe oldu. İlgili hücre PyyGFP enteroendokrin hücreye spesifik raportör fareler kullanılarak belirlenmiştir. yöntem bize bir enteroendokrin hücre ve onun neuropod tüm ultrastrüktürünü belgelemek için izin verdi. Neuropods içinde, nöronal akson yapısal özelliklerini bulundu ve neuropods dışında, biz enterik glia 8 fiziksel bir ilişki bulundu. Gerçekten de, neuropods bu hücrelerin sekretuar işlevde önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir Tüm salgı vezikülleri yaklaşık% 70 içerir. Binayapısal veriler, daha yakın zamanda, bu neuropods yoluyla enteroendokrin hücreleri ve nöronların bağırsak dil 8,9 tat hücreleri benzer bir nöroepitelyal devresini oluşturur innerve bulundu. Yapısal verilere kaynaklanmıştır gastrointestinal kimyasal-duyusal mekanizmaların bu özellikleri ortaya çıkararak, bu bağlaşık mikroskopi yöntemi kullanılarak toplanmıştır. Bu yöntem, hücrelerin, çok düşük oranda dokular içinde dağılmış olan, özellikle hücre biyolojisi diğer alanlarda faydalı olabilir inanıyoruz. Biz 3D (Cocem3D) &#39;de bağlaşık konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu yönteme başvurdu. yöntem aşağıdaki ana adımlardan oluşur: doku diseksiyonu, konfokal mikroskopi, SBEM görüntüleme, SBEM ve konfokal görüntü korelasyon ve manuel segmentasyon. Korelasyon fiziksel ziyade kimyasal olduğundan diğer bağıntılı yöntemlerle karşılaştırıldığında, kavram oldukça basittir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Bir hücrenin ultrastrüktürü tarif işlevini anlamak için önemlidir. Bu, bağırsak epiteli enteroendokrin hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinde, yapılmış dokular boyunca yayılan nadir hücre tipleri için zor bir proje olabilir. 1000: Şekiller 1 oranında diğer epitelyal hücreleri arasında dağılmış nedeniyle gıda ve bakteri bu mide-bağırsak sensörler çalışma zor olmuştur. Son zamanlarda, transjenik farenin raportör flöresan ile enteroendokrin hücreleri tanımlamak için üretilmiştir. Bunlardan biri peptid YY-GFP faredir. Bu Fareyi kullanarak, biz konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu ilişkilendirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz yöntem cocem3D adında ve doku belirli bir enteroendokrin hücresini tanımlamak ve 3D hücrenin ultrastrüktür açıklayacak uygulamıştır. cocem3D çözünürlüğü hacmi yeniden hücre zarlarını salgı veziküllerinde gibi küçük organellere tanımlamak ve ayırt yeterlindering. Cocem3D kolayca doğal doku Diğer özel hücre tiplerinin 3D ultra yapısını incelemek için adapte edilebilir.

Burada sunulan yöntem epitel bir katman içinde belirli bir hücrenin ultra yapısını incelemek için kullanılmıştır. bu durumda ilgi hücre zor enteroendokrin hücresidir. Yerinde Onların kimlik sadece hücre spesifik floresan muhabiri farelerin gelişmesi ile son yıllarda mümkün olmuştur. 2011 yılında, hormon PYY&#39;nin promotörü yeşil floresan protein 17 ekspresyonunu tahrik eden bir fare geliştirdi. Bu PyyGFP farede, ince bağırsak ve kolon distal kısmının enteroendokrin hücreleri kolayca UV ışığı altında ayrılır. Bu fare modeli, enteroendokrin hücre ihtiva eden bir doku bloğu tanımlamak ve SBEM için işlemek için bir olanak sağlamıştır. korelasyon yöntemi cocem3D burada adlandırılır ve daha önce yayınlanmış protokolleri 10,11 üzerine inşa edilmiştir. Doku bloğu boyutlarını en iyi duruma getirme korelasyon için önemlidir. Ön deneylerde,Bu ilgi, hücrenin tüm vücudu kaplayan sırasında doku bloğu 300 um uzunluğunda ve 50 um kalınlığında SBEM görüntü sayısı en aza indirilmiş olduğu tespit edilmiştir. Şekil 1A, bir titreşimli bıçak microtrome kullanarak diseksiyon Bir Bakış göstermektedir Doğru boyutlara sahip doku bloğu edinin. En az 100 blok ilgi bozulmamış hücrelere sahip olanlar almak için içlerinden sıralamadan önce elde edilir. Seçilen bloklar konfokal mikroskopi ve görüntü z-yığınları tarafından görüntülü optik her 1 mikron (Şekil 1B ve C) aralıklı. Şekil 1D fare ileumda bir enteroendokrin hücresinin hacmi render görünümünü göstermektedir. Bu tanınmış neuropod ~ 60 um için epitel hücreleri altında uzanır. ilgi hücre tüm blok yüz bir SBEM görüntüsü ile konfokal z-yığınları ilişkilendirilerek bulunur. Sözgelimi, bir PyyGFP distal kolon bir blok burada sunulmuşturfare. Konfokal z yığınları (Şekil 2A) elde edildikten sonra, blok düşük erime agaroz ince bir tabaka (Şekil 2B) gömülüdür. Bu blok sonraki manipülasyon için gereklidir. Bu SBEM dilimleri ile optik dilim uygun olmaları için mümkün olduğu kadar düz bir blok yönünü muhafaza etmek önemlidir. Şekil 2C, bir temsili görüntüsü doku bloğu tüm yüzü gösterilir. Bu rakamın parçaları önceden Bohorquez ark yayınlandı. 2014 8. Bu sonradan hesap doku yerlerinden ve boyutları dikkate alınarak konfokal görüntü korelasyon. Şekil 2B açığa blok konfokal ve SBEM görüntünün bir kaplamasını göstermektedir ilgi, bizim hücrenin hassas konum. Hücre tespit edildikten sonra, SBEM görüntüleme salgı vezikülleri ve diğer hücre organelleri tespit için yeterince yüksek bir çözünürlükte yapılır. veri seti diye sunulanblok görüntüleri her 70 nm çekildiği gibi yeniden piksel başına 7 nm&#39;de görüntülendi. veri seti doku derinliği 45 mikron yayılan 643 fotoğraf içeriyordu. Birkaç mikron düşük büyütmede tüm blok yüzü ilk görüntüleme sırasında traş edilir. Ham SBEM veri seti .dm3 formatında edinilen ve sonraki kullanım için tiff dönüştürülmüştür. SBEM yığını ilgi sadece bölgeyi içeren Fiji yazılımı eklentisi &quot;ekin (3D)&quot; blok kullanılarak kırpılmış edildi. Bu volume rendering için gerekli RAM belleği miktarını azaltır. Hücre konumu ve salgı veziküller tarafından belirlenen ve Imaris yazılımı kullanılarak segmente edildi. 3 enteroendokrin hücre 3D render bir içeriyor Şekil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Şekil 1:. Korelatif konfokal mikroskopi (A) İş Akışı bir parça incelemekBir doku içine bağırsak dokusu 300 x 50 mikron kalınlığında blok. (B) doğru boyutlarda bir temsilci doku bloğu. Fare küçük bağırsak ile ilgili bu boyutların doku bloğu kolon 8 kript durumunda, yaklaşık 3 villi yayılan ya da dikkat edin. Ilgi konusu bir hücreyi ihtiva eden küçük bağırsak (C) bir tüy. Imaris yazılımını kullanarak 3D render (D) A konfokal z-yığın önemli bir neuropod bağırsak epiteli altında çalışan bir enteroendokrin hücre gösterir. Mavi = DAPI nükleer leke. Barlar = 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Şekil 2: Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (A) sele Konfokal görüntü.Çevrede PyyGFP enteroendokrin hücreleri (yeşil) içeren kolondan CTED doku bloğu. Blok konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş sonra (B), daha sonra agaroz cam slaytlar kullanarak düşük erime düz gömülür. Agaroz doku bloğu gömülmesi sonraki manipülasyon kolaylaştırır ve sol köşede çentik sağ yönde SBEM içinde blok monte yardımcı olur. Bloğun yüzeyinin (C) SBEM görüntüsü. SBEM ile confocal verilerin (D) Korelasyon faiz (beyaz ok) hücreyi tespit etmek. C ve bu rakamın d görüntüleri Bohorquez ark. Değiştirilmiş olan 2014 8. Mavi DAPI nükleer leke =. Barlar = 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Şekil 3:. Imaris yazılımını kullanarak enteroendokrin hücresinin Veri 3D render (A) Ses render. Hücre salgı veziküller ile dolu bir neuropod içeriyor. Bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürü tam bir açıklaması için, Bohorquez ve diğ., 2014 8 başvurun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Biyoloji

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Canlı Maya Hücrelerinde Mitokondriyal Peroksitin mtHyper7 Kullanılarak Görüntülenmesi

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Yazar Spotlight: Mitokondriyal Araştırmaları İlerletmek - Hücre Altı Analiz için mtHyper7 Biyosensör 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...