Yazarlar onu mükemmel teknik yardım için Ina Wolter teşekkür etmek istiyorum. VGAT Venüs transgenik fareler Dr ile oluşturulmuştur. Dr A. Miyawaki tarafından sağlanan pCS2-Venüs kullanarak Y. Yanagawa, M. Hirabayashi ve Milli Fizyolojik Bilimler Enstitüsü, Okazaki, Japonya Y. Kawaguchi.

Etik Açıklama: Tüm prosedürler ve hayvan bakım Kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı, Alman Hayvan Refahı Yasası, Avrupa Konseyi hayvanların korunmasına ilişkin Direktifi 86/609 / EEC ve yerel otoriteler (Berlin, T-0215/11 den kılavuzlar ) Akut-hipokampal Dilimleri hazırlanması 1. <ol><li> Kortikal inhibitör 13 çoğunluğunu etiketler vGAT promoteri altında, floresan Venüs / YFP proteini ifade edilmesi, (17-24 günlük) bir transgenik fare al. Sıçan başını kesmek. Hızla carbogenated, semifrozen (% 95 O 2 /% 5 CO 2) sakaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (sakaroz-ACSF, Şekil 1A) içine beyin (&lt;40 sn) teşrih. </li><li> , Lamba ve 515 emisyon filtresi LED gözlük bir çift üzerine monte nm bir 505 ile Venüs / YFP floresan için disseke sıçan beyni değerlendirin. </li><li> Korteks ve Cereb cephe üçte çıkarınEllum; sonra tüm bir neşter ile, hemisferlerdir ayırmak. Daha önce tarif edildiği gibi 14, beyin aşağı yapıştırmak için düz bir yüzey temin etmek üzere korteks dorsal yüzeyini çıkarın. </li><li> Bir vibratom üzerinde hipokampal oluşumun enine dilim (300 mikron) Kesme, hemisfer semifrozen ile çevrili olmalı, sakaroz-ACSF (Şekil 1B) 14 carbogenated. Rostral korteks, midbrain ve beyin sapı ek bölgeleri çıkarın. Carbogenated ve 35 ° C&#39;ye ısıtılır sükroz ACSF ihtiva eden bir yarı-tutma odasına her dilim aktarın. </li><li> Isındı ACSF giren son dilimin zaman 30 dakika boyunca 35 ° C&#39;de kurtarmak için dilimleri bırakın. Metabolik süreçleri etkinleştirmek ve kesilmiş nöronal süreçlerin kapanmanın kolaylaştırmak için bunu yapın. Daha sonra depolama (Şekil 1C), oda sıcaklığında transfer. </li></ol> 2. İmalat ve Kayıt Pipetler dolumu <ol><li> Pu(hücre içi etiketleme için)% 0.1 biocytin ihtiva eden hücre içi çözelti filtreden geçirilmiş ile doldurulduğu zaman 2-4 M? bir pipet direnci elde edilir, böylece cam kılcal LL yama pipetler, (0.2 mikron bir şırınga filtreden, gözenek boyutu). Bileşenlerinin bozunmasını önlemek için buz üzerinde soğutulmuş, hücre içi çözelti tutun. </li><li> Konsantrasyon (; çözelti listesine bakınız E R (Cl) = -61 mV), - fizyolojik olarak ilgili olan, düşük Cl ihtiva eden bir çözelti ile postsinaptik akımlar tespit edilmesi için yama pipetler doldurun. </li><li> Konsantrasyonunu (E R (Cl) = - eşleştirilmiş kayıtları presinaptik reseptörü kaynaklı tepkileri belirlemek için, düşük bir Ca 2 + tampon presynaptically transmiter salımına engel olmamak için kapasitesi, hem de 4-kat daha yüksek bir Cı gibi, hücre içi çözelti ile yama pipet dolgu -20 mV) sinyal-gürültü farmakolojik respin doğru değerlendirilmesini sağlayan gözlenen iPSCs 5 artırmak içinonsiveness. Konsantrasyon IPSC kinetik 15 değiştirebilecek - Cl değişen unutmayın. </li></ol> FS-ins 3. Tüm Hücre Patch-kelepçe Kayıt <ol><li> ACSF Carbogenate ve (aynı zamanda emme hattı, Şekil 2A aracılığıyla kayıt odasından ACSF kaldırır) bir peristaltik pompa vasıtasıyla, kayıt odasına perfüzyon sistemine beslenir. Kayıt için hazırlık kurulum tüm ekipmanı açın. </li><li> Kayıt odasına bir dilim aktarın ve ipek tek lifleri ile sinirli bir platin halkası ile yerinde tutun. CA1 stratum (str.) Pyramidale hem str 2 pipet ile erişim sağlayan, görüş alanında dikey olarak çalışacak şekilde dilim yerleştirin. radiatum ve str. oriens anda (Şekil 2C ve 4A). </li><li> (32-34 ° C) kayıt A kurulum içine odasına yerleştirin ve carbogenated perfüzyon başlar ve ısındı5-10 ml / dakika bir akış hızında CSF verildi. </li><li> 40X objektif büyütme IR-DIC optik altında dilim kalitesini değerlendirmek ve bir ekranda izlendi CCD kamera ile görselleştirmek. Yuvarlak, orta kontrastlı CA1 piramidal hücreleri (CA1 PC), çok sayıda str görüldüğü takdirde iyi bir dilim kaliteli varsayalım. pürüzsüz ve hafifçe kraterli yüzeyi (Şekil 2C) altına 20-30 mikron derinlikte pyramidale. Kalitesiz dilimleri pürüzlü bir dilim yüzeye sahip, yüksek kontrastlı, çökmüş ya da şişmiş hücrelerin çok sayıda içerir. </li><li> Veya str yakın büyük kutuplu somata ile Venüs / YFP (Şekil 2B), ifade gibi epifloresans aydınlatma altında farazi FS internöronlardan tanımlayın. pyramidale. Makul derin amacıyla dilim (50-100 mikron, Şekil 2C) içindeki hücreleri seçin daha iyi morfolojik bütünlüğünü korumak için. </li><li> Headstage pipet tutucu kayıt elektrodu monte; Daha sonra uygulamaly tüp hattı üzerinden düşük, pozitif basınç (20-30 mBar). Dilim yüzeyine indirin pipet hafifçe seçilen nöronun merkezine kaydırın. </li><li> Daha önce 14,16 anlatıldığı ve aynı zamanda 2D ve 2E Rakamlar bkz olarak tam hücreli kayıt yapılandırmasını edinin: <ol><li> Bir hücreyi hedef: 70-80 mBar&#39;a basıncını arttırın ve hızla sadece seçili hücreye (Şekil 2B, üstte) soma yukarıda dilim aracılığıyla pipet indirin. </li><li> Hücreyi Yaklaşım: (üst, Şekil 2B) bunun üzerine bir &quot;gamze&quot; üretmek için hücre zarı karşı pipet basın. Komşu hücrelerin biocytin etiketleme önlemek için, hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Giga-ohm mühür oluşturun: pipet 20 mV gerilim komutu uygulamak eşzamanlı basıncı bırakın ve. Bir giga-ohm mühür (1-50 GΩ Şekil 2B, alt ve Şekil 2E orta) typicmüttefiki hızla gelişir. Bir kez gerilim komut olarak potansiyel beklenen dinlenme membran (tipik olarak -70 ve -60 mV) uygulanacaktır, mühürlü. </li><li> Yama kırmaya: mühürlü sonra, negatif basınç kısa bir darbe ile membran rüptürü yama; böylece bütün hücre konfigürasyonu (Şekil 2E ve alt) etkisi. </li></ol></li><li> Bütün hücre kapasitans ve seri direnç (R S) dengeleyin. R s 120 dakikaya kadar normalde 5-20 M? Ve kararlı. Break-through membran potansiyeli (V M) -50 mV daha depolarize ise hücreleri terk; R S 30 M? Daha başlangıçta büyüktür; Kaydın boyunca% 20&#39;den fazla ya da R ve S değişir. </li><li> (+250 PA, Şekil 2F, top -250) akım darbeleri Depolarizan için hiper bir aile (akım kelepçe modunda) onların yanıt FS-İnş tanımlayın. FS-INs nispeten V M (genellikle -50 t depolarize varo -60 mV), kısa membran zaman sabiti (&lt;20 msn) ve frekanslarda aksiyon potansiyelleri bir tren (AP) ile akım enjeksiyon Depolarizan 500 pA yanıt&gt; 100 Hz 11 (Şekil 2F, alt), belirgin olan CA1 PC&#39;ler (Şekil 2F, orta) olanlar farklı. </li></ol> 4. Hücre dışı Elektriksel Stimülasyon GABA B R-aracılı yanıtları uyandırmak için <ol><li> Str sınırında dilim:; synaptically uyarılmış yanıtları gözlemlemek için, bir hücre dışı uyarım elektrot (0.1-0.3 M? Direnç 2 M NaCl ile dolu bir yama pipet) yerleştirin. radiatum ve str. lacunosum-moleculare. stimülasyon eserler (Şekil 3A) hücrenin doğrudan elektrik stimülasyonu önlemek ve en aza indirmek için soma elektrodu 200-300 mikron yanal yerleştirin. </li><li> Stimülasyon elektrodu bir biçimde pozisyonlandığı zaman, tüm hücre kayıt eldeseçilen hücre ve 3.9 bölüm (Şekil 3B) olarak akım kelepçe modunda fizyolojik fenotipi değerlendirmek. </li><li> Voltaj-kelepçe (V M -65 mV) kaydedilen nöron ile bir presinaptik akson elektriksel uyarımı sağlamak 50 V (~ 500 uA etkili uyarıcı), izole edilmiş bir sabit voltaj uyarıcısı kullanılarak her 20 saniye,. Tek uyaranlara kullanın (100 mikro-saniye süresi, Şekil 3C, üst) GABA B R aracılı iPSCs gözlemlemek, ve daha verici serbest üretmek için (200 Hz) birden uyaranların trenler ile birbirinden. </li><li> İzole monosinaptik IPSC (orta üst Şekil 3C) ortaya çıkarmak için:;: Banyo İyonotropik glutamat reseptör antagonistleri (d-AP5 [50 iM] NMDA reseptör DNQX [10 iM] AMPA reseptörü) uygulanır. Bundan başka, bir GABA A, R&#39;nin bloker tatbik edilmesi ile, GABAB R aracılı iPSC izole (gabazine [10 uM]; Şekil 3C, L ortaower). </li><li> GABA B sonraki uygulama CGP-55845 [5 mcM] (Şekil 3C alt, gri bindirmiştir) tarafından R-aracılı olarak bileşkesini yavaş dışa akım (genişletilmiş Şekil 3C düşük) onaylayın </li></ol> FS-IN ve CA1 PC&#39;ler birleştiğinde synaptically 5. Eşli Kayıtlar <ol><li> Aşağıda açıklandığı gibi sinaptik-birleştiğinde IN ve PC çiftleri arasında yapılan eş zamanlı kayıtları ile inhibitör sinaptik iletim GABA B R aracılı presinaptik kontrolünü değerlendirmek. </li><li> Öncelikle, (bölüm 3 gibi) bir presinaptik interneuron bütün bir hücre kayıt kurmak ve FS fenotip (Şekil 4A) onaylayın. </li><li> Sonra komşu CA1 PC (20-100 mikron mesafe, Şekil 4A) yama ve APleri ortaya çıkarmak için (akım kelepçe modunda tutulan) presinaptik IN akım darbeleri (1 msn süre, 1-5 nA genlik) Depolarizan kısa suprathreshold geçerlidir. Sinaptik bir işbirliği halindennection, voltaj-kelepçe düzenlenen CA1 PC, içinde olarak iPSCs neden olmaktadırlar AP (yaklaşık% 80 ila R S telafi) kullanılır. </li><li> Gerekirse bir bağlantı bulunana kadar, daha CA1 PC&#39;ler yeni kayıt elektrot ve kayıt doldurun. </li><li> Bir bağlantı kurulduktan sonra, üniter sinaptik tepki ve dinamik davranışı hem değerlendirmek için presinaptik FS-IN içinde AP çiftleri ortaya. 50 milisaniye aralıklarla (Şekil 4B) ile 2 olan depolarize edici uyarılara tipik bir eşleştirilmiş darbe protokolünü kullanır. </li><li> Bazal koşullarda kontrol izlerini toplayın. Daha sonra, bu şekilde tam olarak reseptör aracılı etkileri engellemek için, antagonistin CGP-55845 (5 uM), ardından GABAB Rs, aktivasyon, perfüze ACSF için seçici GABAB R agonisti baklofen (10 uM) uygulanır. Her ilaç durumda (Şekil 4B ve C) Kararlı durum sırasında ~ 50 izleri toplayın. </li><li> Kayıt işlemi tamamlandıktan sonra, bir dışında Paris oluşturarak somatik membran sızdırmazE-üzerinden yama: Yavaş V-kıskacına hücre gövdesinden pipet çekilme ve R S arttıkça, mV -40 V ​​M azaltır. Dış kısım-dış yama oluşumunu kolaylaştırmak için bu fazlası; Daha sonra banyosundan pipet çıkarın. </li></ol> Elektrofizyolojik Özellikleri 6. Analizi <ol><li> NOT: farklı yazılım paketleri bir çokluk elektrofizyolojik veri edinimi için kullanılabilir. Burada, WinWCP, ücretsiz Strathclyde Elektrofizyoloji Yazılım paketinde bir Windows programı kadar 16 analog giriş kanalları kayıt ve 10 dijital sinyallerin çıkışını sağlayan, kullanılır. </li><li> Alçak geçiren filtre 20 kHz tüm 5-10 kHz veri ve örnek. </li><li> Bir off-line analiz suite ile fizyolojik verileri analiz. NOT: Stimfit, bu durumda kullanılan bir Python kabuğu içeren açık kaynak kodlu bir yazılım paketi; Ancak diğer alternatifler kolayca yerine kullanılabilir. <ol><li> Pasif membran p AnalizKaydedilen nöronların roperties, membran dinlenme potansiyeli Bulunduğum kelepçe satın aldı. </li><li> Kaydın başlangıcında kaydedilen yanıtların başlangıca göre ortalama dinlenme membran potansiyelinin ölçülmesi. </li><li> Küçük hiperpolarizan atımlannm (≤ -50 pA) için gerilim yanıtı, Ohm kanunu kullanarak, giriş direnci hesaplayın. Gürültü oranı, ortalama birden izleri sinyali artırmak için. Not: Bizim örnekler 10-50 bireysel Piyango ortalamasıdır. </li></ol></li><li> Küçük hiperpolarizan akım darbelerine yanıtların çürüme bir monoexponential eğri oturtularak sürekli görünür membran zaman tahmin. </li><li> Eşik genliği (tepe eşik) ve süreyi (yarı yükseklikte ölçülen genişlik) mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin ortaya çıkardığı eşik seviyesinin belirlenmesi için aksiyon potansiyeli dalga analiz edin. </li><li> GABA B R gerilim kelepçe kayıtları aracılı iPSCs analiz edin. Filtre off-çizgi izler500 Hz (Gauss filtresi) ve (en az 10 izleri ortalamalarının) GABAB R aracılık yanıtının tepe genliği ve gecikmeyi belirlemek. </li><li> Tepe ve önceki taban arasında ölçülen GABA A R-aracılı iPSCs pik genliği bir değişiklik olarak ins inhibitör çıkışında GABA B Rs etkisini algılar. Kontrol süresi ve tüm farmakolojik dönemini kararlı devlet için ≥50 izlerinden ortalama genlik hesaplayın. </li></ol> 7. Görselleştirme ve İmmünositokimya FS-Ins <ol><li> Kayıtlarından sonra, 4 ° C &#39;de 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH = 7.35) O / N oranı ile% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile dilimleri sabitleyin. </li><li> Gerekli dilimleri işlemeden önce 1 ~ haftaya kadar PB transfer ve saklanabilir edin. </li><li> Liberal taze PB ve daha sonra% 0.9 NaCl ile 0.025 M PB yıkayın dilimleri (PBS, pH = 7.35). </li><li> Fo dilimleri bloke spesifik olmayan antikor azaltmak için% 10 normal keçi serumu (NGS),% 0.3 Triton-X100, PBS içinde hazırlanmış NaN3 ve% 0.05 (membranları nüfuz edilebilir kılınması için bir deterjan) ihtiva eden bir çözelti içinde, oda sıcaklığında 1 saat r. </li><li> PBS, NaN3% 5 NGS,% 0.3 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde seyreltilmiş bir anti-BD monoklonal fare antikoru kullanarak, BD ekspresyon için etiketlemek için. 4 ° C&#39;de 12 gün boyunca 2-3 primer antikorlar inkübe edin. Iyice PBS dilimleri durulayın. </li><li> Floresan anti-fare sekonder antikor uygulayın (örneğin AlexaFluor-546). Biyotin bağlayıcı protein streptavidin ile birlikte bir florokrom konjüge edilmiş (örneğin, AlexaFluor-647); ve PBS içerisinde seyreltilmiş NaN3,% 3 NGS,% 0.1 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde inkübe edildi ve 4 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. </li><li> Liberal 2-3 PB durular ile PBS ile takip 2-3x dilimleri durulayın. Cam slaytlar dilimleri monte edin. Çökmesini dilim önlemek için 300 mikron ağar ayırıcı kullanın. Bir Fluores ile kapak kayma dilimleritırnak-cilası ile yüzde montaj orta ve mühür. </li></ol> 8. Görüntüleme ve Visualized İmar FS-Ins <ol><li> Uygun lazer çizgisinin (diyot lazer AlexaFluor-647 için 635 nm ile heyecanlı fluorochome muhabiri ile bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri görselleştirmek; Venus AlexaFluor-546 PV için etiketleme ve Argon 488 veya 515 nm Helyum-Neon 543 nm / YFP). </li><li> Bütün hücrenin Z-yığını elde etmek için (20X objektif kullanarak, tipik haliyle 0.5-1 um adımlar) uygun bir Z çözünürlükte al. Birden yığınları normal görüntüye dijital FIJI / İmageJ yazılım (Şekil 5A) kullanarak off-line dikişli olabilir tam hücre, gereklidir. </li><li> Bir yarı-otomatik izleme yöntemi kullanılarak dikişli görüntü yığını hücreyi yeniden yapılandırma (FİJİ / İmageJ yazılım paketi 17 Basit nörit İzleyici eklentisi, Şekil C). </li><li> Son olarak, i PV-bağışıklık tepkiselliğini tahlilyüksek sayısal açıklık objektif lens ile nterneuron (60X silikon-daldırma, NA = 1.3). PV somatik arınma çok güçlü ise soma görüntüleri, proksimal dendritler ve proksimal akson veya alternatif akson terminallerinin olun. Immün-etiketleme biocytin-etiketli yapılar (Şekil 5B) ile uyum görülürse Hücreler PV için imünoreaktif sayılır. </li></ol>

<ol>
	<li>Freund, T. F., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+hippocampus.">Interneurons of the hippocampus.</a> Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).</li><li>Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+labeling+of+parvalbumin-positive+interneurons+and+analysis+of+electrical+coupling+in+identified+neurons.">In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons.</a> Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).</li><li>Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+IPSPs+evoked+by+interneurons+at+the+stratum+radiatum-stratum+lacunosum-moleculare+border+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus+in+vitro.">Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro.</a> Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).</li><li>Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+cleft+at+GABA+synapses+in+the+brain.">Bridging the cleft at GABA synapses in the brain.</a> Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).</li><li>Bartos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+synaptic+inhibition+promotes+synchronized+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks.">Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks.</a> PNAS. 99, 13222-13227 (2002).</li><li>Cobb, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+effects+of+identified+interneurons+innervating+both+interneurons+and+pyramidal+cells+in+the+rat+hippocampus.">Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).</li><li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks.">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).</li><li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li><li>Buhl, E. H., Szil&#225;gyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+properties+of+anatomically+identified+basket+and+bistratified+cells+in+the+CA1+areas+of+the+rat+hippocampus+in+vitro.">Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro.</a> Hippocampus. 6, 294-305 (1996).</li><li>Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spiking+cells+in+rat+hippocampus+(CA1+region)+contain+the+calcium-+binding+protein+parvalbumin.">Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin.</a> Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).</li><li>Booker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+GABAB-Receptor-Mediated+Effects+in+Perisomatic-+and+Dendrite-Targeting+Parvalbumin+Interneurons.">Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).</li><li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+cortical+GABAergic+neurons+revealed+in+transgenic+Venus-expressing+rats.">Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Chloride+Ions+Regulate+the+Time+Course+of+GABA-Mediated+Inhibitory+Synaptic+Transmission.">Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission.</a> Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Geiger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+in+brain+slices+with+improved+slicer+technology.">Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology.</a> Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li><li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates.">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li><li>Neu, A., F&#246;ldy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus.">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li><li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit,+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic,+basket,+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus.">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz işlevsel in vitro morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan nöronlar karakterize etmek elektrofizyolojik ve Nöroanatomik tekniklerini birleştiren bir yöntem tarif; Özellikle kortikal inhibitör ins çeşitli türleri. Prosedürün önemli yönleri vardır: Potansiyel ins (1) ön seçim; (2) hücre içi kayıt ve nöron görselleştirme; ve nihayet (3) Kaydedilen INS morfolojik ve immünositokimyasal analizi. Bu çalışmada özellikle PV bileşenler ele olmasına rağmen, tarif edilen protokol minimal değ...

Hipokampal nöronal devreler nedeniyle uzun süredir insanlar ve kemirgenler hem onların öğrenme ve hafızada önemli bir rol yanı sıra mekansal navigasyon için anatomi ve fizyoloji, hem de saygı ile, yoğun inceleme konusu olmuştur. Aynı şekilde, hipokampusun önemli, ama basit laminar organizasyon bu bölge kortikal ağların yapısal ve fonksiyonel özelliklerini ele çalışmaların bir tercih konusu yapar. Hipokampal devreleri uyarıcı asıl hücrelerin (&gt;% 80) ve daha küçük (% 10-20), ancak inhibitör 1-3 derece çeşitli kohort oluşmaktadır. Internöron hızlı iyonotropik GABA A reseptörlerinin hareket akson terminallerinden γ-amino butirik asit (GABA) (GABA A Rs) ve yavaş metabotropik GABA B reseptörleri (GABA B TL) bırakın 4. Bu inhibisyon mekanizması uyarma dengelemek ve ana hücrelerinin uyarılabilirliğini düzenleyen ve böyleceir zamanlama ve deşarj desen. Bununla birlikte, GABA internöronlar salınan ana hücreler üzerinde değil, aynı zamanda kendilerini 5,6 internöronlar üzerinde de etki eder. Ön ve postsinaptik reseptörleri interneuron çeşitli türleri arasında geribildirim düzenleme ve inhibitör karşılıklı etkileşimlere aracılık. Interneuron ağlarda Bu önleyici mekanizmalar farklı frekanslarda 7&#39;de özellikle sallantı- nesil ve nüfus aktivite desen şekillendirme, merkezi olduğuna inanılmaktadır. Tüm hücre patch-kelepçe kayıt içsel özellikleri ve nöronların sinaptik etkileşimlerinin incelenmesi için köklü bir yöntemdir. Ancak, interneuron türleri yüksek çeşitlilik nedeniyle, inhibitör incelenmesi kaydedilen hücrelerinin titiz belirlenmesini gerektirir. Hipokampal interneuron türleri farklı morfolojik özellikler ve nörokimyasal işaretleyici ifade, kombine anatomik ve immünositokimyasal e nitelendirildiğindenxamination hassas interneuron kimlik 6,8,9 belirlemek için bir araç sağlayabilir. Bu yazıda biz yavaş GABA B karakterizasyonu için izin, tek nöronların veya sinaptik-birleştiğinde çiftlerinden tüm hücre patch-kelepçe kayıtları post-hoc morfolojik ve immünositokimyasal analizi ile takip, hücre içi etiketleme ile kombine edildiği deneysel bir yaklaşım tanımlamak reseptör tespit internöronlarda inhibitör etkilere aracılık. Örnek olarak, biz onun postsinaptik hedeflerin soma ve proksimal dendritler innerve ve bir &quot;fast çivilenmesi&quot; (FS) ile karakterize edilir interneuron bir ana tip, sözde &quot;basket hücrelerinde&quot; (BC) bir alt kümesi, odaklanmak kalsiyum-bağlayıcı protein parvalbumin (PV), 10,11 desen yoğun hücre gövdesi kaplama tabakası bir akson ve ifade boşaltın. Bu internöron büyük postsinaptik inhibitör akımları, yanı sıra önde gelen pre gösterilecekGABAB R aktifleşmesinin 12 tepki olarak sinaptik çıkış sinaptik modülasyonu. Burada açıklanan tekniklerin kombinasyonu tanımlanmış diğer nöron türlerinden çeşitli intrinsik veya sinaptik mekanizmalarını incelemek için de eşit ölçüde uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

GABAerjik inhibitör beyin nöronal devrelerin içinde merkezi bir rol oynarlar. Internöron nöronal bir topluluğun canlılığını (% 10-20) küçük bir alt kümesi ihtiva eder, ancak bunların çeşitli fonksiyonları yansıtan, fizyolojik morfolojik ve nörokimyasal heterojenlik yüksek bir seviyesini gösterir. Bu nedenle, internöronlar incelenmesi önemli organizasyon ilkeleri anlayışlar ve nöronal devrelerin fonksiyonu sağlar. Ancak bu durum, tek tek interneuron türlerinin seçimi ve tanımlanması için bir fizyolojik ve Nöroanatomik bir yaklaşım gerektirmektedir. Interneuron özel markörlerin promotörler altında floresan protein ifade eden transgenik hayvanların akut beyin kesitleri, kayıt, tam hücre patch-clamp, hedef ve elektrofizyolojik spesifik interneuron türleri iç ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için etkili bir yöntem sağlar. Hücre içi boya etiketleme ile birlikte, bu yaklaşım post-hoc mo ile uzatılabilirrphological ve immünositokimyasal analizi, kaydedilen nöronların sistematik bir şekilde tanımlanması sağlanır. Bu yöntemler kortikal nöronların çeşitli türdeki fonksiyonel özellikleri ile ilgili bilimsel sorular geniş bir yelpazede uygun hale getirilebilir.

Sağlanan bu dilim kalite hem CA1 PC&#39;ler ve FS-INs az zorlukla elde edilebilir kayıt, kayda değer iyidir. VGAT promoter 13 altında Venüs / YFP ifade transgenik fare hattı tümden FS-INS, ya da gerçekten BCs tespit etmez. Ancak ve str etrafında INS gelen kayıtları. pyramidale, FS-ins yoğunluğu 1 genellikle yüksek olduğu, FS-ins (Şekil 2B) seçerek bir yüksek olasılık sonuçları. FS-INs CA1 PC&#39;ler ve RS-INS, her ikisi de farklı karakterist...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons at JoVE.com

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K Görüntüleme.  Charité Universitätmedizin.  Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir. 

Video: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...