NSF (0854551) tarafından finanse edilmiştir.

1. Ön-deneysel Hazırlıklar <ol><li> Altı çözeltileri (kompozisyonlar için bakınız Tablo 1) hazırlanması: (a) 100 ml NZR (normal zebrafish Ringer), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (düşük Ca 2 + çözelti), (e) 10 ml Locas + papain, (f) ve 100 ml K +-iç çözelti. Solutions (a), (b), (d) ve (f) 4 ° C&#39;de yukarı bir ay depolanabilir Solutions (c) ve (e) deney günü hazırlanması gerekmektedir. Tüm çözümler deneyler başlamadan önce oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> Etiket ve yaklaşık olarak yarım çözümleri (a), (c), (d) ve (e) dört adet 35 mm Petri kapları doldurun. </li><li> Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) ile 60 mm Petri kabı doldurma ve daha sonra bir balık devrilme olmaksızın dik oturmak için izin verecek içine bir oyuk keserek bir diseksiyon çanak olun. </li><li> Bir cam sonuna bir köpek saç yapıştırma folikül sonuna kadar en az iki hücre izolasyonu araçları hazırlayınYapıştırıcı ile Pasteur pipeti, saç yaklaşık olarak 0.5 cm pipet sonunun uzatmak için izin verir. Labrador Retriever ve Weimaraners gibi yumuşak tüylü köpeklerin tüyleri iyi çalışır. </li></ol> 2. İşitsel ve Vestibüler Labirent İzolasyonu <ol><li> NZR + Tricaine içeren bir behere daldırılarak bir yetişkin zebrafish Kurban. Tüm opercular hareketleri sona kadar Görme solungaçları izlemek. Balık çıkarma ve taze NZR ile yıkamadan önce ek bir on dakika bekleyin. Bu prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Pepperdine Üniversitesi Komitesi (IACUC) kullanın fakat onay için kendi kurumunuzun alınmalıdır edilmiştir. </li><li> Için balık Pin kafasından uzaklığın yarısına yaklaşık üçte biri dorsal-ventral eksen boyunca her göz soketi ve bir üçüncü pin aracılığıyla bir standart dikiş düz pim (yaklaşık 2,5 cm uzunluğunda) takarak çanak dorsal yüzü yukarı diseksiyon de gösterildiği gibi, kuyrukŞekil 1A. </li><li> Bir zoom (0.62-5x) 10x oküler ile donatılmış stereo mikroskop altında, yaklaşık bir noktadan kafatası çatı kaldırarak beyin ve omuriliğin bir kısa segment ortaya çıkarmak için makas makas (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 15000-02) kullanın ileri balık burun solungaçları seviyesine kaudal 0.5 cm. Omurilik kesin ve spinal sinirler ve diğer ekleri kesim sırasında ince forseps (Güzel Bilim Araçları katalog numarası 11251-30) ile beyin kaldırın; beyin kaldırmak ve (Şekil 1B) atın. </li><li> Kalır kafatası kapsül ventral yarısında iç kulak organları içeren bir &quot;kase&quot; oluşturur. Her iç kulak ve daha rostrally yanal konumlandırılmış kırbacık otolit (Şekil 1C ve 4A) kaudal ucunda simetrik olarak yerleştirilen lagenas ve sacculi öne çıkan, beyaz, opak otolit gözlemleyin. </li><li> Tüm ventral ve lateral attachmen keserek kemik kasesini çıkarınts yavaşça ince forseps ile başının dışarı kaldırırken. Locas (Şekil 1D ve 4B) içeren Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Ince forseps iki çift kullanarak, iki kemik arasında yanal kenarları kapma ve merkezi forseps noktalarına ekleme ve yarıya meraklı ile sağ ve sol yarısı ayrılması, ya da alternatif olarak ayrı çekerek kendi orta hattan kase ayrı çatlak dışında. Ince forseps (Şekil 2) kullanarak kemik iki labirent çıkarın. </li><li> Semisirküler kanallar, utricles, sacculi ve lagenas (Şekil 4C): işitsel ve vestibüler end-organ tanımlamak için labirentler inceleyin. Her bir otolit altında pembemsi alanlar saç hücrelerini içeren makulaları vardır. Benzer bir şekilde, yarı dairesel kanal ampülleri içinde pembe bir şerit saç hücrelerinin bulunduğu kupulada tanımlar. </li><li> Dikkatlice ince forseps kullanarak lagena ve kesecik gelen otolit çıkarın ( <strong&gt; Şekiller 2 ve 4C). O bunu yaparken sakküler saç hücrelerinin zarar verebilir kesecik gelen otolit kaldırmak için gerekli değildir. </li></ol> 3. Saç Hücre İzolasyon <ol><li> Plastik bir transfer pipet (Fisher Scientific katalog numarası 13-711-09:00) kullanarak içeren çanak sonuna organları taşımak Locas + papain sıvı transfer hacmi en aza indirir. </li><li> Oda sıcaklığında otuz dakika için bu çözelti bu yapıların inkübe edin. </li><li> İnkübasyon süresinin sonunda, NZR + BSA ihtiva eden çanak için yapı taşımak ve en azından otuz dakika süreyle bu çözelti içinde inkübe edilir. Saç hücreleri dört saate kadar bu çözüm sağlıklı kalacak ama (sonraki adımlara bakın) izolasyonunu takiben 1-2 saat sonra bozulacaktır. </li><li> Hücre izolasyonu için hazırlık olarak, NZR içeren çanak sonu organlardan biri taşıyın. </li><li> Lagenas ve utricles için hafifçe pembemsi epitel ti makulaları-sayfaları çıkarmak için bir köpek saç kullanmaksaç hücreleri (Şekil 3A) ihtiva ssue. Makulaları scooped edilebilir sacculi bir otolitler altında (a köpek saç kullanılarak), ve yarı-daire şekilli kanalların ampülleri içinde kendi konumlarından cupulae. </li><li> Adım 1.4 olarak hazırlanan iki hücre izolasyonu araçlarını kullanarak, saç hücreleri (Şekil 3B) içeren bir enkaz alanı oluşturmak için bir makula veya kupulada çiğnemek. Hücreler taşımadan önce çanak alt üzerine yerleşmek için en az beş dakika bekleyin. </li><li> Faz kontrast optik ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasına çanak yerini değiştirin. 40X büyütme altında hücrelerde gözlemleyin ve morfolojisinde çeşitliliği dikkat. Diğerleri uzun ve ince ise birçok hücre avokado şeklindedir. Apikal saç demetleri varlığı saç hücreleri olarak tanımlayan ve faz-parlaklık sağlık sağlar. İzole saç hücrelerinin fotomikrografı Şekil 5 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 4. Zebra balığı Saç Hücreleri Mengene Patch <ol><li> Perfo için hazırlıkyeri 5 mg amfoterisin B (Sigma A4888) bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe ve 100 ul DMSO ile doldurun: anma yama kayıtları 5,6, şöyle amfoterisin içeren iç solüsyon hazırlanır. Amfoterisin tüm eriyene kadar 10-20 saniye boyunca hemen vorteks bu çözüm. Ikinci bir mikrosantrifüj tüp içine Sonra, pipetle 625 ul K +-iç çözüm. Yukarıdaki gibi iç çözelti +-K ve girdap için amfoterisin çözeltisi 10 ul ekle. Stok amfoterisin çözümü birkaç saat sürer, ancak bir saat sonra nihai çözüm kaybolacak. </li><li> Bir çok aşamalı çektirmesi (Sutter P-1000) kullanarak BF 150-86-10 borosilikat cam (Sutter Instruments) yama pipetler Fabrikasyona. Pipetler yaklaşık 2 mikron çapları Öneri olmalı ve Tablo 1&#39;de çözümleri ile MΩ 1-3 dirençleri olacaktır. Aşağıdaki gibi isler iyi olduğunu çektirmesi üzerine ayarları: Isı = Rampa minus10, = 0, Hız çekin = 18, Gecikme = 1, Basınç = 600. Şekliİyi bir pipet ucu Şekil 5&#39;in ilave c fotoğraf bellidir. Onlar elektrofizyolojik kayıtlar sırasında en az erişim direniş olarak Blunt &quot;mermi şeklinde&quot; pipetler tercih edilir. </li><li> Amfoterisin içeren K +-iç çözümü ile yarım bir kayıt elektrot doldurmak için, bir 28 gauge Mikrofil şırınga iğnesi (Dünya Hassas Aletler MF28G-5) kullanın. </li><li> Bir yama kelepçe amplifikatör headstage için takılan elektrot. -10 MV, 10 Hz&#39;de 10 ms gerilim adımlar uygulanır ve bu hücrelerin yakın kayıt tabağın tabanına karşı aşağıya doğru hava / çözelti arabirimi üzerinden hareket ettirilebilir ve olduğu gibi elektrot pozitif basıncı muhafaza. </li><li> Sağlıklı görünen bir hücreye ortogonal elektrot yerleştirin. Bunun üzerinden akan çözüm uzaklaşmaya başlar böylece elektrot yeterli hücre yakın olduğunda, hızlı bir elektrot için hafif bir vakum uygulanarak, basınç tersine üstüne hücre &quot;atlar&quot; kadar. Hemen th emiş durdurmae ve elektrot elektrot içine -70 mV&#39;luk bir tutma potansiyel uygulanır. Birkaç saniye içinde bir gigaohm mühür oluşturacak. </li><li> Yakında mühür oluşumundan sonra görünen gerilim adımların başlangıcı ve bitiminde kapasitif akımı geçici gözlemleyin. Transientler (yaklaşık on dakika), maksimum boyutuna büyüklüğü arttıkça izleyerek amfoterisin tarafından elektrodu altında membran perforasyonu izlemek için devam edin. </li><li> Sağlıklı hücre tam hücreli (delikli) yapılandırma kurulması onaylamak gerilim adımları hiperpolarizan ve depolarizan uygulayarak dışa K + akımları ortaya çıkarmak. Çoğu saç hücreleri belirgin dışa akımları (bkz. Şekil 6) var. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 4 hücre izolasyonu adımları sırasında çekilen görüntüleri gösterir. Panelin A lagenas, saccluli ve utricles ile ilişkili otolitler throu görülebilirgh kemik ince bir tabaka onları üzerler olduğunu. Bu opak yapılar diseksiyon sonraki adım sırasında hayvan son organ güvenli çıkarmaya yardım etmek için uygun görülecek sağlar. Panel B bozulmamış labirentler ve utricles, lagenas ve sacculi öne çıkan otolit içeren kemik &quot;kase&quot; gösterir. Panel C kemik kaldırılmış bir labirent gösterir. Lagena içinde taraklı kenarı ile büyük otolit, kesecik de kesecik ile fasulye-şekilli otolit içinde saçağı-şekilli otolit not edin. Boyut ve lagena izole edilen hücrelerde görülen morfolojik olarak çeşitlilik bazıları Şekil 5 de gösterilmiştir. Sağlıklı bir hücre kolayca keskin bir çevre ile parlak aşaması olarak tanımlanır. Hücre şekil kabaca iki sınıfa ayrılabilir: avokado-şekilli (AVO) ve uzun ve ince (thn) her bir grup içindeki hücre boyutları önemli ölçüde değişebilir olmakla beraber (örneğin AVO 1 ve AVO 3 karşılaştırın). Inset bir bir küme gösterirBu hücreler üç tamamen birbirlerinden izole edilemedi. Içerlek b hücre siyah renkli ve granüler bir görünüm kolaylıkla ölü olarak bu hücreyi tanımlar. Ankastre c bu hücrelerin kayıt için uygun şekil ve boyutlar gösteren bir yama pipet ucu göstermektedir. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi akım izleri Şekil 5&#39;te gösterilen AVO 2&#39;ye benzer bir lagena hücre uygulanan olası aşamaları hiperpolarize ve depolarize yanıt olarak elde edildi. Farklı boyutlarda ve şekillerde hücrelerinde Güncel yanıtları yaygın voltaj kapılı kanallar tamamlayıcı çeşitlilik gösteren değişebilir. Şekiller 1-3: saç hücrelerinin izolasyonu adımları gösteren Çizgi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Şekil 1. Kafatası capsu çıkarılmasızebrafish gelen iç kulak labirentler içeren le. A. Çanak diseksiyon için zebrafish dorsal yüzü yukarı feda pin. B. Açık kafatası, kaldırmak ve beyin atın. C. Utricles, lagenas ve sacculi. D otolit uyun. Labirentler içeren kafatası kapsül ventral kısmı çıkarın. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Şekil 2. Kafatası kapsül labirentler kaldırılması. A. Onun orta hatta kafatasının kapsülü dışında Crack. B. Kemik labirentler çıkarın. C. Forseps kullanarak lagenas ve utricles gelen otolit çıkarın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Şekil 3. Labirentler saç hücrelerinin izolasyonu. A. Yavaşça ma kaldırınBir köpek saç ile culae. B. İki köpek tüyleri ile makulaları Karışım. C. yama kelepçe için izole saç hücreleri kullanın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Şekil 4,. Görüntüler ayrı ayrı hücrelerin izolasyonu adımları sırasında alınmıştır. Beyin çıkarılmasından sonra A., iki lagenas ve sacculi (oklar) ve utricles (ok uçları) ile ilişkili otolitler görselleştirilebilir. B. ventral çıkarıldıktan sonra hayvan iç kulak organları içeren kafatası kapsül kısmı. B sağ yarısında karikatür sol kesecik, lagena ve Keseciklerin konumları tanımlar. Kesikli çizgi sol labirent yaklaşık konumunu gösterir. C. Sağ labirent (medial görünüm) D: C labirent anahtar bölümlerini gösteren Karikatür çizimi. Bir: ön yarıdairesel kanal, b: Yatay kanal, c: Posterior kanal, d: utricular otolit, E: sakküler otolit, f: lagenal otolit. D Ölçek çubuğu A ve B için 1 mm, C ve D için 0,5 mm temsil <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Şekil 5 morfolojisi çeşitlilik gösteren lagena İzole, sağlıklı hücreler; avo:. Avokado şekilli hücrelerden; thn: Uzun, ince hücreler. Inset bir: Üç tam olarak izole hücre kümesi; içerlek b: ölü hücre; içerlek c: zebrafish saç hücrelerinden elektrofizyolojik kayıtlar kullanılan yama elektrot ucu. Ölçek bar = 20 mikron ana figürü ve tüm parçalar için geçerlidir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Bir yama kaydedilen Şekil 6. Akımlar saç hücresi kenetlenir. Hücreye Ortalamalı yanıtları (benzer t-70 mV&#39;luk bir tutma potansiyelinden +70 mV&#39;a -140 mV 10 mV aralıklarla uygulanan voltaj adımı üç sunum için, Şekil 5&#39;te o AVO 2). Daha depolarize potansiyelleri görünür inaktive geçerli unutmayın. Gerilim adım büyüklükleri izleri bazı yanında gösterilir.

<ol>
	<li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells.">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li><li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus.">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li><li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken.">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li><li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li><li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211 (2009).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li><li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell:+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells.">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li><li>Kim, M. -. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).</li><li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea.">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li><li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish.">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son organ ve hücreler nazik tedavi dikkatli bir teşrih sağlıklı, bozulmamış ve fizyolojik olarak aktif saç hücrelerinin başarılı bir şekilde izolasyon için çok önemlidir. Aşağıdaki ipuçları bağlılık başarı sağlayacaktır: <ol><li> Bu küçük balık (uzunluğu 2-2.5 cm) sağlıklı hücreleri elde etmek kolaydır. Büyük balık diseksiyon işlemi sırasında olduğu belirsiz görselleştirme daha birçok yağ damlacıkları var. </li><li> Kıl hücreleri örten otolit, çıkarırken dikkatli olunmalıdır. Forseps ile otolit kapma sırasında hücreler dokunmaktan kaçının. </li><li> En iyi sonuçlar, makulaları ve cupulae epitel tritüre yaprak ve hücreler olarak kaldırdı zaman elde edilir. </li><li> Biz insan kirpik gibi konik ve daha az esnek olmayan 7 kullanıyorsanız dahil diğer yöntemleri, üstün olduğu hücreleri öğütmek için bir köpek saç kullanım alanı bulmaktadır. </li><li> Yama klemp, t pozitif basınç uygulanması sırasındaHava / çözüm arayüzü ucu temiz tutmak önemlidir aracılığıyla geçerken o elektrot. Elektrot üzerine &quot;atlamak&quot; için hücrenin etkinleştirmek için pozitif basınç serbest bırakılması da önemlidir. Bu nedenle bu yöntem hücreye bir gigaohm mühür oluşturan olasılığını arttırarak, uzak ucundan itibaren amfoterisin B ihtiva eden çözelti küçük bir hacim temizler. Deneylerde yerine daha fazla geleneksel tüm-hücre konfigürasyonu nedeniyle hücrelerin kırılganlık delikli yama kayıt tekniği kullanır. Gigaohm mühür kaybı genellikle sonuçları &quot;tüm hücre go&quot; çalışılıyor. </li></ol> Burada açıklanan yöntem, hayvan başına sağlıklı saç hücrelerinin yüzlerce verecektir. Teknik oda sıcaklığında yapıldı ve bir diseksiyon mikroskobu ötesinde hiçbir özel ekipman gerektirir. Edilebilir Vallahi bir önceki raporun bir ventral yaklaşımı 8 kullanarak zebrafish içinde iç kulak diseksiyonu açıklar. Bu yazarlar disse göstermekbütün, paraformaldehid sabit iç kulak organlarının ction. Biz okuyucu bizim yöntemleri ile karşılaştırmak için bu videoyu izlemenizi tavsiye ederiz. Burada anlatılan yöntemlerin bir avantajı, fizyolojik araştırmalar için yararlı canlı hücrelerin elde edilmesidir. Bu hücrelerin kullanımı kapasitans ölçümleri 11,12 yaparak hücre rezonans 9,10, monitör nörotransmitter serbest çalışmak için uzatılabilir (burada görüldüğü gibi) voltaj kapılı kanallar incelemek için yama kelepçe deneylerde kullanılmasının yanı sıra, neden nöromodülasyon araştırmak ligand kapılı kanallar 13 aktivasyonu yanı sıra işitme ve denge 14 hem etkileyen mutantlar kullanılarak toplanan edilebilir bilgi zenginliği içine dokunun.

<table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm Adı </td><td> Yemek tarifi </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (mM olarak) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 glikoz, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR +% 0.02 3-aminobenzoik asit etil ester metan sülfonat (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR +% 0,4 Bovine Albumin Serum (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Düşük Ca 2 + Çözüm) (mM) </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl2, 0,05 MgCl2, 3 glikoz, 30 Na-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papain </td><td> Locas +% 0.05 L-sistein (Sigma C1276) +% 0.2, papain (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-iç solüsyonu (mM cinsinden) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7.3. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözümler.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Çeşitli türlerin izole duyu saç hücreleri voltaj kapılı kanallar Yama kelepçe analizleri önceden 1-4 tarif ama bu videoyu zebrafish saç hücreleri bu teknikleri ilk uygulamayı temsil edilmiştir. Kesecik, lagena, kesecik ve semisirküler kanallar: Burada iç kulak sonu tüm organlarının sağlıklı, sağlam saç hücreleri izole etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Ayrıca, biz saç hücre boyutu ve morfolojisi çeşitliliğini göstermek ve elde edilebilir yama klemp kayıtları türlü bir örnek vermek. Diğerleri üzerinde bu zebrafish model sisteminin kullanım avantajı işitme ve denge hem etkileyen zebrafish mutant durumu kaynaklanmaktadır. Transgenik hatları ve genetik analiz ve manipülasyon, hücre izolasyonu ve elektrofizyolojik yöntemler kullanan diğer tekniklerin kullanımı ile birlikte rol saç hücrelerinin p içine daha fazla fikir kolaylaştırmalıdır burada tanıttıBu duyu modaliteleri arabuluculuk yatıyordu.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish at JoVE.com

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Görüntüleme.  Pepperdine University. Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

Video: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...