We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Hayvan Etik Beyanı: Bu yazıda anlatılan protokoller Auckland ve Stanford Üniversitesi Üniversitesi tarafından kurulan hayvan bakım yönergeleri izleyin. P7 sıçan yavrular hızlı dekapitasyon ötenazi edildi. Hipokampal diseksiyon hemen sonra aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. 1. Organotipik Hipokampal Dilim Kültür <ol><li> Hazırlık <ol><li> (Beyin diseksiyon için sadece kullanılır) diseksiyonu Orta hazırlayın. 5 ml HEPES tampon çözeltisi, 2 ml 1 M Tris stok çözeltisi (pH 7.2) (0.85% NaCl, her biri 10,000 birim) 200 ml Asgari Temel Ortam, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu birleştirin ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize . Buz-soğuk diseksiyon ortamda hipokampal diseksiyonu yürütmek. </li><li> Diseksiyon orta soğutun. Yaklaşık 1 saat önce sıvı çok soğuk kadar diseksiyon başlamadan dondurucuda diseksiyon ortamı yerleştirin. Büyük buz cr izin vermeyinystals oluşturur. Gerekli kadar buz üzerinde muhafaza edin. </li><li> (Hippocampi diseksiyon dışında her şey için kullanılır) kültür ortamı hazırlayın. / L-glutamin, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu, w Hank tuzları w / 100 ml Asgari Temel Ortam, (1x konsantrasyonu, sıvı) birleştirin (% 0.85 sıvı, her biri 10.000 adet NaCl), 2.5 mi HEPES 1 M tamponu Çözelti, 50 mi Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 50 mi At Serumu (tanımlandığı gibidir, ısı ile inaktive edilmiş), ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize edilir. </li><li> Kültür yemekleri hazırlayın. 35 mm kültür tabağı başına kültür ortamı, 1 ml yerleştirin ve her bir tabağa, bir zar ek eklemek. Bir 150 mm Petri kabı içine bu yemekler yedi kadar koyun (bir &#39;plaka&#39; olarak anılan). Yemekler, kültür ortamı, uygun sıcaklık ve pH doldurduğu şekilde diseksiyon başlamadan önce en az bir saat boyunca bir CO2 inkübatör plaka koyun. </li></ol></li><li> Postnatal Gün 7 de Rat Yavrularının gelen Hipokamplardan diseksiyonu (P7) <ol><li> İşlemden önce UV ışık altında tüm diseksiyonu araçları Ön sterilize. </li><li> Hızlı başı kesildikten sonra, bir tabak soğutulmuş ortama beyin ve yer kaldırın ve sonra diseksiyon için nemlendirilmiş filtre kağıdı bir parça için onu kaldırın. Hipokampus açığa künt pürüzsüz plastik kaplamalı minyatür spatulası kullanarak uzak orta beyin korteksi kızdırmak. Forniksinin kesin, sonra yavaşça (Şekil 1A) dışarı çevirmek için hipokampus altında spatula çalışır. NOT: Başarılı dilim kültürleri P10 kadar hayvanları kullanılarak hazırlanabilir. </li><li> Uzak beynin geri kalanından izole hipokampus kesin. Nemlendirilmiş yumuşak bir fırça kullanarak soğutulmuş diseksiyonu medya içeren yeni bir tabağa aktarın hippocampi (örneğin, beyaz samur # 4). </li><li> Bu süngerimsi, meninge gibi dokular zor hipokampus ayırmak için yapmak gibi, diseksiyon sırasında koroid pleksus hipokampusun alt (yani düz tarafı) temizleyindaha sonra birbirinden dilimleri. NOT: nazikçe alay edilemez ise yerde bu dokuları bırakın. </li><li> Hippocampi zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı tüm diseksiyon. Not: dikkatli bir diseksiyon sürece deneysel koşullar soğutulmuş olarak, hızlı bir daha önemlidir. Aynı anda üç fareden hipokampları dilim. Kaplama dilimleri inkübatör içine gitmek dilim sağlık için kadar baştan toplam süre olarak etkilenmez 30 dakika altındadır. </li></ol></li><li> Dilimleme <ol><li> Transvers bir biçimde el doku dilicisi kullanılarak 400 um enine bölüme hipokampları dilim. Dilimleme gerçekleştirilen edildiği gibi bir yöntem, ince dokulu kağıdın aşırı zarar vermeyen ve (Ammon Boynuz kolayca dokusunda korunması gerekli görülmektedir) yani, hali hazırda görünür laminer mimarisi ile tutarlı kalınlıkta dilimler üretiyor sürece, önemli değildir. </li><li> Doku sahnede hippocampi Lie# 2 filtre kağıdı üçlü kalınlığı üzerinde kıyıcı. Hipokamplar (daha ziyade bu noktada dilimlenmiş ekmek somunları gibi; Şekil 1B tüm kesimler yapılana kadar tüm hipokampus helikopterde sahnede kalan yani), her tür dilimleri çıkarmadan tamamen dilimlenmiş. </li><li> Her hipokampus yanında koydu yumuşak bir fırça (2 beyaz samur #) kullanarak diseksiyon ortama hippocampi aktarın. Yavaşça hipokampus ve altta uzanan filtre kağıdı arasındaki yapışmayı kırmak için yan her hipokampus itin. Sahneden onu almak için her hipokampus altına fırçayı döndürün. Soğutulmuş diseksiyon ortamının aynı 35 mm Petri kabı içine tüm hipokampları yerleştirin. Elle saat yönünde ve saat yönünün tersine hareketleri alternatif olarak çanak ajite tek tek dilimler halinde hippocampi ayırın. </li><li> Bir mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve açıkça görünür hücre sahip değil, küçük hasarlı veya hangilerinin herhangi atınVücut katmanları. NOT: Bu genellikle tüm dilimleri başarıyla bu şekilde onların kardeşleri ayrılır değil böyle olacaktır. Bu durumda, kenar çevirerek ve ince forseps uçları ile kışkırtmaktansa ile ayrılabilir. &quot;İyi&quot; dilimler kesilir ve yangın cilalanmış Pasteur pipet (Şekil 1C-E) kullanarak soğutulmuş diseksiyon orta içeren bir başka temiz bir Petri kabı aktarılır. </li></ol></li><li> Depolama <ol><li> Membran filtre ekler üzerine tek tek dilimler yerleştirin. Pasteur pipet kullanarak kesti ve yangın, büyük bir delik vermek ayrı kültürü ekler dilimleri aktarmak için cilalı. NOT: Kesme ve ateş cilalı pipet önemlidir oluşturulan deliğin büyüklüğü. Çok küçük ve dilimler kolaylıkla membran için pipet bırakmaz. Çok büyük ve fazla sıvı dilim ile birlikte, zarın yüzeyi üzerine yerleştirilir. En iç çapı, tipik olarak yaklaşık yarısı olan çappipet namlunun etre. Kesme esnasında, bu çap pipet incelen uygun yerde kesilerek seçilebilir. </li><li> Dilim Transferi <ol><li> İlk orta ile pipet doldurun, ve sonra küçük emme güçleri ile tek bir dilim kadar emmek. Bu pipet açılışına yakın dilim tutar ve dilim yerleştirmek için ekleme içine çok fazla orta çıkmaları önlenir. </li><li> Küçük bir asılı damla oluşturulması için ampul hafif bir basınç uygulanır, bu dilim damlacık içine yerleşir ve daha sonra zarın bu damlacık dokunun ve zar üzerine dilim &quot;düşüş&quot; izin verir. Genel olarak üç dilim her zar elemanının üzerine yerleştirilir. Not: sıvı damlacık çok büyükse, üç dilim gelen damlacıklar, membran yüzeyinde birleştirme eğilimi ve dilimler bu nedenle tüm daha zor, daha sonra elektrofizyolojik kayıt için onları ayırmak için yapım zarın merkezi toplayacaktır. </li></ol></li><li> Sıvı Removal <ol><li> Dilimleri dalmış veya diseksiyon orta bir havuzu ile çevrili değildir, böylece o plaka tüm dilimleri (uç başına 3 dilim = plaka başına 21 dilim) için kültür plaka ucun üstünden herhangi bir aşırı orta aspire. </li><li> Bu bir kesilmemiş ile olan gerçekleştirin, ancak yangın cilalı Pasteur pipet. Dilim yerleşmek ve pipetlemeden önce bir dakika membran uymak için izin verin. Yukarı pipet içine dilim emmek için özen. Dilimleri yerleşmek için yeterli zaman tanımak için, ilk ekilir uçlar için sıvı kaldırma yürütmek. </li></ol></li><li> Dilim Depolama <ol><li> 37 ° C&#39;de% 5.0 CO2 inkübatöründe saklayın dilim kültürleri. Şekil 1 E&#39;deki kültürlerin nihai düzenleme dikkate alınmalıdır. Her bir diliminin bir tabanı için bir gözenekli membran içeren bir kültür plakasında eki üzerine oturmaktadır ve bu uç orta küçük bir miktarı ile doldurulur ve bir Petri kabı içine yerleştirilir; Bu yolla, dilimler bana batmayankireç, sodyum, ancak kültürü plakası, parçanın alt zar içinden erişime sahip. </li><li> İsteğe bağlı olarak, kültür plaka elemanını kaldırarak veya bir dilim içeren insert membran bir bölümünü keserek olabilir çalışma için ya dilimleri çıkartın. </li></ol></li></ol></li><li> Bakım <ol><li> Kültürleri yaptıktan sonra bir gün Petri yemekler orta değiştirin. Transfer edilmeden önce en az bir saat boyunca inkübatör, denkleştirilmektedir taze kültür aracı maddesi 1 ml içeren yeni bir petri etmek için kültür plakası elemanını aktarın. </li><li> Kültür yapıldıktan sonra üçüncü günde aynı şekilde tekrar orta değiştirin. Üçüncü gün, 34 ° C&#39;ye ayarlanmış bir kuluçka kültürleri aktarın. Iki kez, her hafta (her 3-4 gün) orta değiştirin. </li><li> Sağlıklı kültürleri tanımlamak. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları için sağlıklı kültürleri seçin. Not: Sağlıklı kültürler iyi tanımlanmış bir kenarı açık bir şekilde tanımlanmış ve piramidal hücre tabakası vardır. Kültürler zekâsaat karanlık (olasılıkla nekrotik) alanlar mevcut veya düzleştirilmiş sınırları ile bir vaküollu görünüm reddedilir. Bu kriterlere istihdam, dilim kültürlerin genellikle iki-üçte yeterince kayıt için sağlıklı. </li><li> Zaman oldukça küçük bir pencere olan bu kültürleri yararlanın. Nöronlar yavaş yavaş zamanla kötüleşir biraz epilepti davranışı göstermek için başlar beri fazla iki hafta boyunca kültüre değil kullanılan dokularda yapın. Nöronal hayatta kalma kesin üst sınırı bilinmemektedir ancak kültürde piramidal hücreleri gibi geç 16 haftaya kadar çalışmasını kaydetmek mümkündür. </li></ol></li></ol> 2. Eşli Tüm Hücre Kayıtlar <ol><li> ACSF ve Hücre içi Çözümleri <ol><li> 120 potasyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 kadar NaATP ve 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm ozmolarite, KOH ile pH 7.2) ile (mM olarak) karıştırılması ile presinaptik elektrot çözeltisi hazırlayın. Aynı elektrot çözeltisi ve postsinaptik nöronların, sezyum glukonat için kullanılır iken (120 mM), Başlıca postsinaptik elektrotta tuzu artı 5 mM QX314 olarak kullanılır. NOT: Bu postsinaptik NMDAR aracılı akımları 8-10,13 kaydetmek için olumlu potansiyelleri stabil voltaj kelepçeleme sağlar. Ayrıca Giga ohm mühür yapılmadan önce postsinaptik bir kayıt elektrotu akan iç çözelti ile presinaptik nöronların potasyum kaynaklı aşın engeller. </li><li> (MM olarak) oluşturan postsinaptik elektrot çözeltisi 120 sezyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 kadar NaATP ve (;: 290 mOsm ozmolarite CsOH ile pH değeri 7.2) içinde 0.3 NaGTP hazırlayın. 5-10 M? Direnci cam Mikroelektronlar çekin ve filtre iç çözümü ile doldurun. </li><li> Yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 119 NaCl, 2.4 KCl, (mM olarak) oluşturan hazırlayın MgSO 4 1.3, 2.4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3,% 95 O, 2, 5 ile doyurulmuş 11 glukoz, pH 7.4, % CO 2. NOT: r AMPAR aracılı iseesponses, NMDAR EPSCs incelenmesi için bloke gereken ACSF 10 mcM CNKX veya NBKX içerir. </li></ol></li><li> Eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar elde <ol><li> İki ayrı nöronlar arasındaki sinaptik iletimi incelemek için, presinaptik nöron olarak bir nöron tayin ve aksiyon potansiyelleri teşvik ve sinaptik iletimi başlatmak için geçerli kelepçe tutun. </li><li> Postsinaptik nöron olarak, ikinci nöronu tayin ve araştırmacı tarafından gerekli bilgilere göre akım veya gerilim kelepçe tutun. Gerilim kelepçeye postsinaptik nöron tutarak mV 6-16 30 muayene -65 mV muayene AMPAR-aracılı EPSCs ve NMDAR-aracılı EPSCs ile Glutamaterjik akımları, ayrıntılı muayene edinin </li><li> Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturun. Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturmak için, presinaptik bütün hücre kayıt daima çok sayıda arka arkaya ve postsinaptik nöronların sağlayan, ilk elde edilen bağlandığını sinaptik bir ürünle elde edilene kadar edilmesid elde edilir. Sinaptik plastisite deneyler, bu LTP 8,19 için gereken sitoplazmik faktörleri ile yıkama önlemek için bütün hücre kayıtları elde 10 dakika içinde başlatılmalıdır postsinaptik nöron LTP indüksiyonu ilk olarak presinaptik nöron elde edilmesi için özellikle kritiktir. </li><li> Hareket ile tetiklenen hücre kaybını önlemek. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları gerçekleştirerek büyük bir meydan okuma titreşim ve ikinci kayıt elde ederken ilk tam hücre kayıt hareketi kaynaklı bozulmasını önler edilir. <ol><li> İlk tüm hücre kayıt elde ve kurulan kayıt monitör (Şekil 2A) görünen alanının kenarında yer alır, böylece daha sonra x-ekseninde mikroskop objektif 10-200 mikron taşıyın. </li><li> ACSF hala lens ile temas muhafaza sağlarken ~ 5-10 mm mikroskop merceği kaldırın. İkinci elektrot takın ve (sıvı menisküste içine Şekil 2B kılavuz </strong&gt;). </li><li> Bu lensten ışık yolu altında olduğunu, ancak hala önemli kurulan kayıt elektrot yukarıda kadar xy düzleminde elektrot hareket ettirin. Elektrot mikroskop altında görünür olduğunda, uzak ucu birinci elektroddan monitörün uzak kenarında olduğundan emin olun. </li><li> Her iki elektrot, aynı odak düzleminde kadar odaklı mikroskop dizisinde ikinci elektrot aşağı doğru hareket ettirin. Bu ilk bütün hücre kayıt bozacak şekilde pozitif basınç düzeyi çok güçlü uç tıkanmayı önlemek için yeterince sağlam, ancak olması önemlidir. Bu, ilk olarak dilim girdiğinde elektrottan 2-3 nöronlarda hareket indükleyici pozitif basınç çevirir. </li><li> İlk presinaptik kaydı (Şekil 2C) benzer bir odak düzleminde bir postsinaptik ortağı bulun. Kayıt genellikle ilk r bir 0-200 mm nöron CA3 piramidal nöronların ikinci tüm hücre arasındaki kayıtları eşleştirilen Obtain edilirayıt (Şekil 2C, d). NOT: nöronal çiftleri arasındaki Sinaptik iletim kadar 3-4 saatlik süreler boyunca stabil olan bu standart tüm hücre kayıt tekniklerini kullanırken. </li></ol></li></ol></li><li> Sinaptik plastisite: Bir kez başarılı synaptically bağlı piramidal hücre çifti elde edilmesi üzerine (Şekil 3A, B), sinaptik iletim ve plastisite özelliklerini incelemek. <ol><li> LTP indüksiyon. <ol><li> 1 dakika boyunca 0 mV (Şekil 3C) 7-9,12-14 -10 için postsinaptik depolarizasyon ile presinaptik aksiyon potansiyelleri (1 Hz) eşleştirme tarafından LTP neden. Break-postsinaptik nörona 10 dakika içinde eşleştirme başlatın. Not: LTP da postsinaptik aksiyon potansiyeli ile, 1 dakika için 1 Hz presinaptik ve postsinaptik aksiyon potansiyelleri eşleyerek mevcut kelepçede tutulmuştur, her iki nöron ile indüklenebilir presinaptik nöron 8 içine enjekte edildikten sonra akım 10 msn ortaya çıkardı </s&gt; kadar. </li></ol></li><li> Bundan başka 5-10 dakika (Şekil 3C), 9 -55 mV&#39;ye sinaptik sonrası nöronu hafif bir şekilde depolarize ile birlikte 1 Hz düşük frekansta (LFS) ile LTD neden olur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+receptor+ion+channels.">The glutamate receptor ion channels.</a> Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).</li><li>Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+-+A+decade+of+progress.">Long-term potentiation - A decade of progress.</a> Science. 285, 1870-1874 (1999).</li><li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path.">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).</li><li>Dudek, S. M., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homosynaptic+long-term+depression+in+area+CA1+of+hippocampus+and+effects+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+blockade.">Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).</li><li>Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calyx+of+held+synapse:+from+model+synapse+to+auditory+relay.">The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay.</a> Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).</li><li>Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+pair+recordings+from+CA3+pyramidal+cells+in+organotypic+culture.">Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture.</a> Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).</li><li>Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+kinase+activity+supports+long-term+potentiation+at+synapses+between+individual+hippocampal+neurons.">Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).</li><li>Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pair+recordings+reveal+all-silent+synaptic+connections+and+the+postsynaptic+expression+of+long-term+potentiation.">Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation.</a> Neuron. 29, 691-701 (2001).</li><li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+heterogeneity+in+synaptic+depression+between+pyramidal+cell+pairs.">State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs.</a> Neuron. 33, 765-777 (2002).</li><li>Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+NMDAR+endocytosis+during+LTD+and+its+dependence+on+synaptic+state.">Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state.</a> BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).</li><li>Waites, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+SAP97+isoforms+regulate+AMPA+receptor+dynamics+and+access+to+presynaptic+glutamate.">Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate.</a> Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).</li><li>Emond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+subunits+define+properties+of+state-dependent+synaptic+plasticity.">AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP97+directs+NMDA+receptor+spine+targeting+and+synaptic+plasticity.">SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).</li><li>Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-spaced+stimulation+and+protein+phosphatase+1+dictate+the+direction+of+synaptic+plasticity.">Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity.</a> European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).</li><li>Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+subunit+GluA1+is+necessary+for+long-term+potentiation+and+synapse+unsilencing,+but+not+long-term+depression+in+mouse+hippocampus.">Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus.</a> Brain Research. 1435, 8-14 (2012).</li><li>Arons, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-associated+mutations+in+ProSAP2/Shank3+impair+synaptic+transmission+and+neurexin-neuroligin-mediated+transsynaptic+signaling.">Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling.</a> Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).</li><li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+synaptic+states+define+a+major+mechanism+of+synapse+plasticity.">Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity.</a> Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).</li><li>Miles, R., Poncer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pair+recordings+from+neurones.">Pair recordings from neurones.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP.</a> Science. 252 (5006), 722-724 (1991).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+facilitation+and+depression+at+unitary+synapses+in+rat+hippocampus:+quantal+fluctuation+affects+subsequent+release.">Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release.</a> Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).</li><li>Debanne, D., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro.">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li><li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release.">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li><li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Burada Organotipik hipokampal dilim kültürlerde başarılı eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları kurulması için gereksinimleri tarif etmişlerdir. Eşli kayıtlar da akut dilimleri ve ayrışmış kültür sistemleri 26,27 dahil olmak üzere birden hazırlıkları, yapılabilir. Odak burada sinaptik plastisite (yani LTP ve LTD) uzun formları indüksiyon olmuştur ederken, kısa bu organotipik, akut dilim o eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları vurgulamak önemlidir ve hücre preparatları quantal ...

Glutamat reseptörlerinin, merkezi sinir sistemi sinapslarda uyarıcı sinirsel iletimin çoğunluğu aracılık eder. Postsinaptik zar omurga başında lokalize iyonotropik glutamat reseptörlerinin iki ana alt tipi, N-metil-D-aspartat (NMDA) ve α-amino-3-hidroksi-5-4-proprionik-metilizoksazol asit (AMPA) reseptörleridir. Membran potansiyelleri istirahat, AMPA reseptörleri sinaptik iletimi sırasında postsinaptik akımının en taşımak. Hipokampta, NMDA reseptör postsinaptik zar içindeki AMPA alıcılarının sayısındaki değişiklikler tetiklenmesinde önemli bir rol oynar: bir &quot;tesadüf detektörü&quot; olarak hareket eden 1 sinaptik gücü 1 değişiklikleri başlatmak için, NMDA reseptör sinaptik mekanizmalar dahildir bir alt hücresel düzeyde öğrenme ve hafıza destekleyecek düşünülmektedir. Presinaptik iletici salıverilmesi paralel olarak sinaptik sonrası nöronu depolorizasyonun yanıt olarak, kalsiyum NMDA vasıtası ile içeri girenreseptör AMPA reseptörü ekleme veya kaldırma 2 başlatmak için. Bu reseptör dinamikleri sinaps plastisite temelini oluşturur: sinaptik kuvvetinde bir azalma uzun süreli depresyon 4 (LTD) ise, sinaptik mukavemetinde bir artış, uzun süreli potansiyasyon 2,3 (LTP) &#39;dir. NMDA reseptörleri, kendi indüksiyon kontrol edildiği düşünülmektedir sırasında nedenle AMPA reseptörü hareketi, sinaptik plastisite ifadesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Sinaptik iletim ve plastisite altında yatan kesin mekanizmaları belirlenmesi ideal sinapsların küçük nüfus, tek sinaps eğitim gerektirir. Bazı sinapslar oldukça nedeniyle sinaptik bağlantıların küçük ve dağınık doğası bu son derece zordur çoğu sinaptik popülasyonlarının bu seviyede, örneğin, 5 Tutulacak kaliks, eğitim için uygundur iken. İki büyük elektrofizyoloji teknikleri tek sinaptik bağlantıları incelemek için geliştirilmiştir: İlk minimal stimülasyon, nereyeBir presinaptik lif kabul edilir E ekstrahücresel uyarılmış. İkinci teknik synaptically bağlı nöronlardan gelen eş zamanlı iki tam hücre kayıtları yapılır kayıtları, eşleştirilmiş. Minimum uyarım önemli bir avantajı, aynı zamanda, bir sinaptik sonrası nöronu kayıt sırasında aksonal yolu içine, hücre dışı bir uyarıcı elektrot yerleştirme içeren gerçekleştirmek için hızlı ve nispeten basit olmasıdır. Bu tekniği kullanarak temel kaygısı, tek bir hücrenin güvenilir uyarılması nadiren yargılamadan sonra deneme garanti edilebilir olmasıdır. Son on beş yıl içinde biz rutin iki synaptically bağlı piramidal nöronlar 6-17 gelen tüm hücre kayıtları paired var. Bu tekniğin önemli avantajı, yalnızca bir presinaptik sinir tutarlı ve güvenilir şekilde uyarılır olmasıdır. Ayrıca, elektrofizyolojik karakterizasyon değil, aynı zamanda presinaptik nöron 6,18 &lt;farmakolojik işleme izin vermemekte,/ Sup&gt;. Bununla birlikte, nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı olasılığı 19 elde etmek için çift bağlantılı zorlaştırır düşüktür. Organotipik beyin dilim kültürlerinin kullanımı sinaptik bağlantı olarak bu engel, in vitro olarak yeniden tesis ve ayrıca elde edilen bağlantı yapısı doğal beyin dokusunda 20 benzerdir aşılmaktadır. Ayrıca, organotipik kültürler için plastisite mekanizmalar sağlayan, LTP, LTD 7-10,12-15,21 ve eşleştirilmiş-darbe kolaylaştırma (KOF) ve depresyon (PPD) 6,22,23 dahil kısa vadeli sinaptik plastisite ek form ifade nöronların çiftleri olarak incelenebilir. Burada bunu başarılı bir şekilde in vitro sistemde eşleştirilmiş kayıtları elde katılan ayrıntılı yöntemler tarifedilmiştir. Bu bilgiler kolaylıkla akut dilimleri ve diğer beyin bölgeleri de dahil olmak üzere diğer deney sistemlerinde, adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Sinaptik bağlantı kayıt elektrot aracılığıyla bir depolarizan akım darbesi (20 msn için genellikle 20-50 pA) ileterek bir aksiyon potansiyeli presinaptik nörona uyararak açıktır. Postsinaptik akımı iz bu presinaptik hareket potansiyelini (Şekil 3A) ve pikten sonra kısa (&lt;5 ms) ve tutarlı bir tepki vermişlerdir gecikmeleri olan monosinaptik bir batık EPSC varlığı açısından incelenir. Bir synaptically bağlı çifti elde edilebilir önce en deneylerde birden postsinaptik nöro...

Watch this Scientific Journal Video about Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices at JoVE.com

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Görüntüleme.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Video: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Nörobilim

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.