Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Bu çalışma HealthGrants DK85035 ve DK074797 (İH) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Solucan Suşları <ol><li> C&#39;yi elde elegans Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) için Bristol N2 ve vahşi tip suşu NGM plakalar üzerinde onları korumak E ile tohumlandı coli suşu OP50 7. Not: Transgenik solucan IQ6011 (Phrg-1 :: GFP), daha önce tarif edildiği gibi 11, kullanılan suşları üretilmiştir. IQ6011 yazara talep edilebilir. </li></ol> Değiştirilmiş C 2. Hazırlanması elegans yerleşime ve Üreme Orta (mCeHR) 12 aşağıda tarif edildiği gibi mCeHR sıvı ortam hazırlayın. Bu aksenik sıvı medya solucanlar herhangi bir ek gıda kaynakları olmadan büyümeye olanak sağlar. Böyle bir laminer akış kaputu gibi kesinlikle steril koşullar kullanılarak aksenik sıvı medya ve aksenik solucanlar tüm manipülasyonları yürütmek. <ol><li> Bir bakkal ultra pastörize yağsız süt alın. Buzdolabında pro kullanınkanal değil, oda sıcaklığında bir ürün. MCeHR orta çizgi olarak agar plakaları Brain Heart İnfüzyonu (BHI) ile ilgili en süt kullanımı ve kısırlık kontrol etmek için, 30 ° C ve 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca inkübe önce. -80 ° C&#39;de 50 ml steril tüpler ve saklamak için süt transfer </li><li> Aşağıdaki bileşenlerin her hazırlamak ve düzen ve mCeHR 1 L hazırlanması için belirli bir miktarda (Tablo 1) içinde bir araya getirilir: 2 mM kolin diasit sitrat 10 mi, vitamin ve büyüme faktörü karışımı, 10 ml (Tablo 1B &#39;de tarif bakınız), 2.4 mM miyo-inositol, 10 ml, 10 ml 2 mM hemin klorür, deiyonize su 250 ml. 0.22 mikron filtre ünitesi sayesinde emme ve filtre uygulayın. </li><li> Nükleik asit karışımı 20 ml (Tablo 1C&#39;de tarifi), mineral karışımı, 100 ml (Tablo 1D&#39;de tarifi), 170 mg / ml laktalbümin hidrolizat 20 ml, esansiyel amino asitler, 20 mi, gerekli olmayan amino 10 ml ekleme asitler, 450 mM KH 2 PO 4 20 ml,1.45 M D-glükoz, 1 M HEPES, 10 ml, sodyum tuzu, 250 ml deiyonize edilmiş su, 50 mi. </li><li> Bileşenleri sterilize filtre emiş uygulayın. Filtreyi kaldırmak ve 5 mg / ml kolesterol 1 ml ekleyin. Ortamın pH değeri yaklaşık olarak 6-6.5 olduğundan emin olun. Not: Bu çözelti, bir yıla kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kullanmadan önce mCeHR ortamına% 20 (v / v) organik ultra pastörize kaymağı alınmış süt ekleyin. Süt açma ve aliquoting zaman (bir laminar akış başlığı içinde örneğin) titizlikle steril tekniği kullanarak. 4 ° C&#39;de saklayın Ortamı </li></ol> 3.. C&#39;yi hazırlayın aksenik mCeHR Sıvı Ortamda Kültür elegans <ol><li> Birçok gebe solucanlar ve OP50 E. az miktarda vardır kadar on 60 mm NGM plakalar üzerinde solucanlar büyütün plakalar üzerinde coli. </li><li> M9 tampon maddesi (Tablo 1F&#39;de tarifi), 5 ml ile durulanarak, her plakadan solucanlar çıkarın ve 50 ml konik bir tüp içinde bir araya getirir. </li><li> S solucanlar izinettle 5-10 dakika için beklemeye tüp bırakarak daha sonra dikkatli bir şekilde E. içeren süpernatant kaldırmak coli. </li><li> Tekrar prosedürü devam etmeden önce mümkün olduğunca artık bakteri kadar çıkarmak için 3.2 ve 3.3 2x adımları. </li><li> , Üç katı olan bir hacim içinde 0.1 N NaCI içinde yeniden süspanse solucanlar, örneğin 1.5 ml, 3 ml ya da 6 ml olan tek tek solucanlar tüp görülebilir. </li><li> 5 N NaOH ve% 5 sodyum hipoklorit, sonsuz süspansiyona bir 01:02:06 oranında (çamaşır suyu) çözeltisi ekleyerek solucanlar Bleach. Örneğin, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml% 5 sodyum hipoklorit: solucan süspansiyonu 6 ml. Solucan süspansiyonuna eklemeden önce NaOH ve ağartıcı karıştırın. </li><li> Vortex çözelti kuvvetli bir şekilde gebe solucanlar çözülene kadar ve sadece yumurta süspansiyonu (yaklaşık 5-10 dakika) içinde görülebilir. 10X objektif ile bir faz kontrast mikroskop kullanılarak işlemi izler. </li><li> Solucanlar tamamen çözüldükten sonra, pelet hemenyumurta 45 saniye boyunca 800 x g hızında, 4 ° C &#39;de Süpernatantı ve 4 ° C&#39;de 45 saniye boyunca 800 x g &#39;de santrifüj ile topak, steril 10 ml su ile iki kez durulama pelet </li><li> Ağartma sonra, 100 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen mCeHR ortam 10 ml içeren, 25 cm 2 doku kültürü şişesine yumurta pelet aktarın. Steril teknikleri kullanarak bu işlemi yürütmek. Arzu edildiği takdirde, aksenik sıvı kültürlerde bakteri gelişimini önlemek için 250 ug / ml nalidiksik asit de dahil olmak üzere, ilave antibiyotikler ekleyin. </li><li> Yaklaşık 70 rpm bir çalkalama inkübatöründe 20 ° C&#39;de, sıvı kültürleri inkübe edin. </li><li> Gelişme aşamasına ve büyüme oranını dikkate günlük solucanlar edin. Not: Worms başlangıçta yavaş büyür ve gebe olmak için 7 ila 10 gün gerektirir. Solucanlar sıvı ortama alışmak Ancak, nesil zaman vahşitip (N2) solucanlar için yaklaşık 4 gün düşecektir. </li><li> Solucanlar deve aldıktan sonrabir konik tüp solucan kültür aktarmak ve, salıncak kovalı bir rotor kullanılarak 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de topak haline solucanlar, sıvı ortam içindeki sahne gebe miştir. </li><li> Süpernatantı ve yavaşça 0.1 M NaCI eşit hacimde solucan pelletini. Örneğin, mCeHR 10 ml kültür solucanlar için 0.1 M NaCl 10 ml kullanımı. Solucanlar buz üzerinde 5 dakika boyunca yerleşmek için izin verin. </li><li> 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma prosedürü uygulayın ve solucanlar aksenik sıvı ortam maddesi içinde bir ikinci nesil boyunca büyümeye izin verir. Gerekirse, bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için yeniden antibiyotik ekleyin. </li><li> Yine bir senkronize bir popülasyonunun üretilmesi için adımlar 3,5-3,8 de tarif edildiği gibi yeniden ağartıcı, adımlar 3.12 ve 3.13 &#39;te tarif edildiği gibi daha sonra 0.1 M NaCl içinde solucanlar ve pelet tekrar süspansiyon solucanlar gebe olmayı sağlar. Artık antibiyotik olmadan sıvı ortamda L1 larva solucanlar büyür. </li></ol> Sıvı 4. Senkronizasyon WormsKültür <ol><li> Pellet ve adımlar 3.12 ve 3.13 de yukarıda tarif edildiği gibi, 0.1 M NaCl içinde solucanlar tekrar süspansiyon. 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma. </li><li> M9 tampon, 10 ml yumurta pelletini ve larvalar döner platformlu sallayıcı üzerinde 20 ° C &#39;de O / N yumurtadan izin verir. Not: Yumurta L1 larva cünyır olacak, ama daha fazla geliştirmek değil, L1 aşamada solucanlar senkronize. </li><li> Korumak ve alt kültür solucan, 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de topak L1 larvalarının, daha sonra 10 ml mCeHR ve bir 25 cm 2 şişesine transfer larvaları için tekrar süspansiyon. Solucanlar dönen bir platform üzerinde 20 ° C&#39;de büyümeye izin verin. Solucanlar için yeterli beslenme sağlamak için 3.000 solucan / ml / cm 2 maksimum yoğunluğunu korumak. Not: Bu aşamada, antibiyotikler işlemleri bir laminar akış başlığı içinde steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmektedir zaman aksenik koşullarını korumak için gerekli değildir. Worms büyümesini izlemek için her gün kontrol edilmelidir. </li></ol> 5. Bedavaaksenik Orta Kültürler kuvvet ve Çözülme Worms <ol><li> Aksenik asenkron solucan kültürleri veya sıvı azot içinde senkronize L1 larva dondurun. 5 dakika boyunca 800 x g Pellet solucanlar daha sonra her bir şişeye 0.5 ml &#39;si kullanılarak S tamponu (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCI) yeniden süspanse edin. Her bir şişeye,% 30 h / h gliserol, S tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve sıvı N2 içinde uzun süreli depolamadan önce -80 ° C&#39;ye kadar solucanlar aktarın. Her bir şişe içinde, ml başına yaklaşık 1 x 10 6 solucanlar dondurun. </li><li> Hemen hemen tüm buz eriyene kadar yaklaşık 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek şişe solucanlar çözülme. Bir laminar akış başlığı içinde, mCeHR içeren steril bir şişeye solucanlar transferi ve 20 ° C &#39;de koyun </li></ol> 6.. MCeHR Büyüme ve Üreme üzerine Hemin Konsantrasyon Etkisi belirleyin <ol><li> C arasında besin bağımlı büyüme analizi için mCeHR aksenik ortamı kullanın elegans. Etkisi o belirlemeksolucan büyüme ve gelişme üzerinde f hemini konsantrasyon, aksenik N2 solucan veya diğer ilgi suşları senkronize kullanın. Bölüm 4&#39;te yukarıda tarif edildiği gibi L1 larvalarının senkronize. </li><li> Ertesi gün, pelet ve senkronize L1 larvaları saymak ve aksenik medya ul başına 1 solucan sulandırmak üzerine. 0.3 M NH4 OH 10 mM hemin klorid yapın ve konsantre HCI kullanılarak pH 8&#39;e ayarlanır. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka mCeHR medya 800 ul ekleyin. Ortam 100 ul her bir oyuğa 100 solucanlar ekleyin. 0 uM, 1.5 uM, üç kopya halinde 1.000 uM arasında değişen konsantrasyonlarda her bir göze hemin klorür ekleyin. Tüm çukurlar 0.3 M NH4 OH aynı konsantrasyonunu içeren emin olun. Yavaşça 100 L1 larvalarının her bir göze ilave emin olmak için pipetleme önce solucanlar yeniden süspansiyon haline getirildi. </li><li> Günlük solucanlar inceleyin ve her bir konsantrasyonda her bir büyüme not edin. Inkübasyon 9 gün sonra solucanların sayısını ve her bir heme tekabül solucanlar / ml sayısını arsakonsantrasyonu, (Şekil 1). </li></ol> Heme Sensör Worms Hemin Konsantrasyon 7. Etkisi <ol><li> 4 içeren mCeHR senkronize L1 heme sensörü solucanlar (Phrg-1 :: GFP) inkübe ilM, 8 uM, 10 uM ve 20 uM hemin. </li><li> Floresan konfokal mikroskopi, 48 saat sonrası inkübasyon (Şekil 2) kullanılarak görüntü solucanlar. </li></ol> 8. Transgenik C oluşturmak için mCeHR kullanmak elegans mikropartikül bombardımanı ile Not: Şekil 3 13&#39;te gösterilmiştir üreten ve unc-119 (ED3) mCeHR yetiştirilen solucanlar kullanılarak mikro-parçacık bombardımanı gerçekleştirilmesi için prosedür. <ol><li> Solucan Hazırlık <ol><li> Bir 175 cm2 şişeye bir hafta önce bombardımanı için mCeHR ortam 90 ml, yaklaşık 1 x 10 6 uyumsuz unc-119 (ED3) solucanlar aktarın. Solucanlar 20 ° C o büyümeye izinna 70 rpm (Şekil 3-1) ~ at platformu sallayarak. Not: Bir hafta sonra, solucan yoğunluk birçok yetişkin gebe solucanlar ile önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Yaklaşık 3 x 10 7 solucanlar mikropartikül bombardımanı için gerekli olacaktır. </li><li> Chill JM109 E. coli buz üzerinde 10 cm NGM plakaları seribaşı. </li><li> Iki 50 ml konik tüplere aksenik solucanlar aktarın ve 2 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj solucanlar. Süpernatan aspire ve M9 tamponu (Şekil 3-2), 50 ml bir tüp içinde, her solucanlar tekrar süspansiyon. </li><li> Büyütülmüştür buz üzerinde 10-15 dakika boyunca yerçekimi ile pelet izin verin. Not: 2 ml Pelet şimdi&gt;% 90 erişkin solucanlar içermelidir. Bu pelet 2 ml, yaklaşık 5 x 10 6 solucanlar ve bir mikropartikül bombardımanı için yeterli olmalıdır. </li><li> Coat soğutulmuş JM109 tüm yüzeyi solucanların 2 ml pelet NGM plaka tohumlandı. Tamamen emilecek sıvı daha sonra plaka terk Veren(Şekil 3-3) geçmeden önce, buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı. </li></ol></li><li> Altın partikülleri hazırlanması <ol><li> Bir silikon mikrosantrifüj tüpüne altın partiküllerinin 30 mg tartılır. 1 ml% 70 etanol ekleyin ve 5 dakika için tüp vorteks. </li><li> Tüp altın parçacıkları pelet 10 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj, ardından 15 dakika boyunca bekletin. Dikkatli bir altın parçacıklarına tüp ters tarafına ucu dokunarak bir pipet kullanarak süpernatantı. </li><li> 1 dakika boyunca steril 1 ml su, girdap ile altın parçacıkları yıkayın ve kısa bir süre için 10 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj tüpü. Daha sonra steril% 50 gliserol, 0.5 ml altın parçacıkları tekrar süspansiyon, iki kez yıkama adımı tekrar edin. Not: altın parçacıkları son konsantrasyonu, 60 mg / ml olacak ve 4 ° C sıcaklıkta 1-2 ay boyunca saklanabilir </li></ol></li><li> DNA-altın partikül karışım hazırlayın <ol><li> 10 ve istenilen plazmid DNA 10 ug birleştirin# 956, bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde unc-119 kurtarma plazmid g. DI su 50 ul ve de yeniden süspansiyon haline getirildi altın partikül çözelti daha sonra 1 dakika boyunca vorteks 100 ul ekle. </li><li> 2.5 M CaCI2 150 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca çözelti yine vorteks. Bu çözeltiye, 3-5 dakika boyunca 0.1 M spermidin ve vorteks 60 ul ekle. </li><li> Pulse 10 sn boyunca 6.000 xg&#39;de çözümü santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 300 ul ekleyin. Vortex de 1 dakika boyunca, 6000 x g&#39;de santrifüj puls,% 100 etanol içinde 170 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. Şiddetle 5 ila 10 dk sonra santrifüj nabız ve süpernatant kaldırmak için çözüm vorteks. </li></ol></li><li> Bombardıman (Şekil 3-3) Not: Bu protokol, Malzeme / Ekipman Tablosunda belirtilen partikül teslim sistemi ile gerçekleştirilir. Mevcut parçacık teslim enstrüman için yönergeleri izleyin. <ol> &lt;li&gt; 15 cm tabak içine doku bir kağıt yerleştirin. Cımbız kullanarak, ayrı ayrı% 100 etanol içine yedi macrocarriers daldırma ve kurumaya dokusu üzerinde onları yatıyordu. </li><li> ,% 70 etanol ile biyolistik odası, makro-taşıyıcı tutucu, ve hedef plaka temizleyin. Temiz ve her bombardımanı işlem öncesi durdurma ekranları otoklav. </li><li> Oturma aracını kullanarak tutucu içine cımbız ve basın kullanarak tutucuya macrocarrriers yükleyin. </li><li> Eşit her bir makro taşıyıcı merkezinde DNA kaplı altın partiküllerinin 20 ul yayılır ve daha sonra çözelti, tamamen kurumaya bırakın. </li><li> Etanol ile basınç bölücünün iki parçalarını temizleyin ve etanol temizlenmiş kopma diskler ile birleştirin. Bombardıman odasına monte basınç bölücü ve kopma diskleri vida. </li><li> Macrocarrier sahibinin bir otoklava durdurma ekran birleştirin ve metal gerekli raf ve yerinde kilitlemek için aparat yerleştirin. </li><li> Monte Macr kaydedinocarrier basınç altında ayrılmış bölücünün yuvasına biyolistik odasına cihaz ve basınç bölücü aynı hizaya gelir. </li><li> Hedef plakası raf üzerine solucanlar ile açık NGM plaka bantla ve odasının kapısını kapatın. </li><li> , Solucanlar bombardıman kopma diskleri kırmak için gerekli için basıncını ayarlamak için. , Hg basınç 28 inç vakum açın diskler delinmesine kadar sonra yangın düğmesine basın. </li><li> Vakum bırakın ve aparattan NGM plaka çıkarın. Plakadan solucanlar yıkayın ve JM 109 E ile seribaşı yirmi 10 cm NGM plakaları yeniden dağıtma coli (Şekil 3-4). </li><li> Solucanlar 25 ° C&#39;de 10-14 gün boyunca büyümeye ve plakalar açlıktan izin verin. Unc-119 kusur kurtarıldı Worms normal hareketi olacak ve şu anda tespit edilebilir. Bu bağımsız transgenik satırları (Figür temsil olarak daha fazla analiz için ayrı levhalar en az 10 &quot;Yabanitip&quot; solucanlar almake 3-5). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarları veya çıkar çatışması vardır beyan ederim.

Bu protokolde hızlı C. sağlayan bir modifiye aksenik sıvı medya mCeHR sunmak solucanlar, çok sayıda üretim elegans üretimi. Solucanlar E. kirletmeden yetişir gibi bu ortam birçok avantajları göstermektedir coli veya bakteriyel yan ürünleri ve beslenme ve toksikolojik çalışmalar istismar edilebilir. E. kullanılması E. coli ya da bu tür çalışmalarda diğer bakterilerin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, bakterilerin büyümesi çeşit...

Toprak nematod, Caenorhabditis elegans, toksikoloji genetikten çok sayıda çalışmalarda kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu 1 mm boyutu, dört gün, yetiştirme kolaylığı, hızlı bir üretim süresi ve büyük döl numaralarının bir sonucu olarak, bu nematodlar genetik ve farmakolojik ekranlar, 1, 2, bir dizi olarak kullanılmıştır. Araştırmacılar omurgalı sistemlerinde muhafaza molekülleri ve yolları belirlemek için bu solucanın yararlanmak. Bu yollar hücre ölümü sinyalleri, yaşlanma ve metabolizma yolları ve sinir sistemini 3-6 arasındadır. Buna ek olarak, C şeffaflık elegans doğrudan gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonu analiz etmek görselleştirilebilir floresan protein muhabir kullanılarak transjenik nesil için izin verir. Birçok çalışmada bu nematod nematod büyüme ortamı (NGM) plakalar kullanılarak, bir katı agar-bazlı bir yüzeye veya l kültürlenirJK monitörler kültürler bir besin kaynağı olarak 7,8 Escherichia coli ile tohumlandı. Bu bakteri gıda kaynakları tarafından ürünlerin sonuçların yorumlanmasını etkileyen bakteriyel müdahalesi ile biyokimyasal ve toksikoloji çalışmaları karıştırabilir. , C. Bu bileşik etkileri önlemek için, elegans bir besin kaynağı olarak bakteri yoksun olan bir aksenik sıvı ortam içinde kültive edilebilir. Bu medyayı kullanarak, başarılı birçok standart C için son derece senkronize solucan milyonlarca kültüre C. farklı olarak düzenlenen genlerin dahil olmak üzere, mikro-dizi analizi elegans protokolleri elegans heme farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve gen bombardımanı ile transgenik solucanlar üretimi. Bu ortam, kimyasal olarak tanımlanmış ve Dr Eric Clegg 9 formüle orijinal bir reçete modifiye edilir. Bu mCeHR medyayı kullanarak, başarılı heme homeostazda ilgili genleri tespit ettik, 10 (hrg ler) olarak heme duyarlı genlerin ifade yönelecekE ile ekim yapılmış olan NGM agar plakalar kullanmak normal büyüme koşullarında mümkün olmamıştır coli. Bu protokolde C tanıtmak ve korumak için prosedürü tarif E. yetiştirilen elegans coli aksenik mCeHR ve transgenik C üretmek için solucan çok sayıda elde etmek için bu yöntem kullanmak mikro-parçacık bombardımanı kullanılarak elegans hatları. C beslenme gereksinimini belirlemek için aksenik medyayı kullanmanın yararını göstermektedir biz de mevcut çalışmalar elegans bir örnek olarak heme kullanılmıştır. Bu çalışmalar mCeHR medya kullanarak C arasındaki bir sayıda hızlı büyüme sağlar olduğunu göstermektedir solucan araştırmacılar tarafından kullanılan birçok downstream uygulamalar için elegans.

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Potassium citrate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -phosphate</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2&#039; - and 3&#039; -monophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheine</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5&#039;-phosphate</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-acid citrate</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gold particles (Au Powder)&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>or</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1.0 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

Bu protokol, biz gerekli malzemeleri mevcut, ve modifiye C yapmak için prosedür. E Legans Alışma ve Üreme medya (mCeHR). Ayrıca, C teşhir ve acclimatizing için adımlar E. yetiştirilen elegans sıvı ortam aksenik coli açıklanmaktadır. Aksenik C kullanmaktadır Son olarak, alt-deneyler elegans Bu işlemin yararlarını gösterir. C analiz ve tespit yeteneği elegans besin gereksinimi değişen heme konsantrasyonları ile aksenik sıvı ortamda N2 yabani tip solucanlar büyüyen tarafından izah edildi. Bu prosedür, solucan büyüme ve gelişme için optimal konsantrasyonunu belirlemek için ya da ilaç tedavilerinin toksikolojik etkisini saptamak için söz konusu besin ile çoğaltılabilir. Yabani tip solucanlar büyümesi üzerinde çeşitli heme konsantrasyonlarının etkisi niteliksel mikroskopik gözlem yoluyla ve t ölçülmesi ile tespit edilmiştirHer bir heme konsantrasyonda büyüme solucanlar O sayısı. Buna ek olarak, çeşitli besin konsantrasyonlarının etkisi, ilgi konusu besin değişikliklere yanıt floresan sensörler ifade solucan kullanılarak analiz edilebilir. Ayrıca, solucan, çok sayıda mikro-parçacık bombardımanı ile kolayca transgenik C. elegans üretimi için üretilmiştir.

C Kültürleme E. tarafından üretilen ikincil metabolit müdahalesi olmaksızın, solucan için gerekli olan besin belirlenmesinde aksenik sıvı ortam yardımcıları elegans coli. Yabanitip N2 solucanlar üç kuşak içinde mCeHR ortama alışmak ve NGM bakteriyel plakalar üzerinde yetiştirilen solucanlar karşılaştırılabilir büyüme göstermektedir. Nitekim, bu solucanlar OP50 bakteriler üzerinde yetiştirilen solucanlar için 3.5 gün ile karşılaştırıldığında 4 gün için...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K Görüntüleme.  University of Maryland.  C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır. 

Video: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetik

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Gelişim Biyolojisi

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Nörobilim

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

Kültürleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler