Bu çalışma HealthGrants DK85035 ve DK074797 (İH) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Solucan Suşları <ol><li> C&#39;yi elde elegans Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) için Bristol N2 ve vahşi tip suşu NGM plakalar üzerinde onları korumak E ile tohumlandı coli suşu OP50 7. Not: Transgenik solucan IQ6011 (Phrg-1 :: GFP), daha önce tarif edildiği gibi 11, kullanılan suşları üretilmiştir. IQ6011 yazara talep edilebilir. </li></ol> Değiştirilmiş C 2. Hazırlanması elegans yerleşime ve Üreme Orta (mCeHR) 12 aşağıda tarif edildiği gibi mCeHR sıvı ortam hazırlayın. Bu aksenik sıvı medya solucanlar herhangi bir ek gıda kaynakları olmadan büyümeye olanak sağlar. Böyle bir laminer akış kaputu gibi kesinlikle steril koşullar kullanılarak aksenik sıvı medya ve aksenik solucanlar tüm manipülasyonları yürütmek. <ol><li> Bir bakkal ultra pastörize yağsız süt alın. Buzdolabında pro kullanınkanal değil, oda sıcaklığında bir ürün. MCeHR orta çizgi olarak agar plakaları Brain Heart İnfüzyonu (BHI) ile ilgili en süt kullanımı ve kısırlık kontrol etmek için, 30 ° C ve 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca inkübe önce. -80 ° C&#39;de 50 ml steril tüpler ve saklamak için süt transfer </li><li> Aşağıdaki bileşenlerin her hazırlamak ve düzen ve mCeHR 1 L hazırlanması için belirli bir miktarda (Tablo 1) içinde bir araya getirilir: 2 mM kolin diasit sitrat 10 mi, vitamin ve büyüme faktörü karışımı, 10 ml (Tablo 1B &#39;de tarif bakınız), 2.4 mM miyo-inositol, 10 ml, 10 ml 2 mM hemin klorür, deiyonize su 250 ml. 0.22 mikron filtre ünitesi sayesinde emme ve filtre uygulayın. </li><li> Nükleik asit karışımı 20 ml (Tablo 1C&#39;de tarifi), mineral karışımı, 100 ml (Tablo 1D&#39;de tarifi), 170 mg / ml laktalbümin hidrolizat 20 ml, esansiyel amino asitler, 20 mi, gerekli olmayan amino 10 ml ekleme asitler, 450 mM KH 2 PO 4 20 ml,1.45 M D-glükoz, 1 M HEPES, 10 ml, sodyum tuzu, 250 ml deiyonize edilmiş su, 50 mi. </li><li> Bileşenleri sterilize filtre emiş uygulayın. Filtreyi kaldırmak ve 5 mg / ml kolesterol 1 ml ekleyin. Ortamın pH değeri yaklaşık olarak 6-6.5 olduğundan emin olun. Not: Bu çözelti, bir yıla kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kullanmadan önce mCeHR ortamına% 20 (v / v) organik ultra pastörize kaymağı alınmış süt ekleyin. Süt açma ve aliquoting zaman (bir laminar akış başlığı içinde örneğin) titizlikle steril tekniği kullanarak. 4 ° C&#39;de saklayın Ortamı </li></ol> 3.. C&#39;yi hazırlayın aksenik mCeHR Sıvı Ortamda Kültür elegans <ol><li> Birçok gebe solucanlar ve OP50 E. az miktarda vardır kadar on 60 mm NGM plakalar üzerinde solucanlar büyütün plakalar üzerinde coli. </li><li> M9 tampon maddesi (Tablo 1F&#39;de tarifi), 5 ml ile durulanarak, her plakadan solucanlar çıkarın ve 50 ml konik bir tüp içinde bir araya getirir. </li><li> S solucanlar izinettle 5-10 dakika için beklemeye tüp bırakarak daha sonra dikkatli bir şekilde E. içeren süpernatant kaldırmak coli. </li><li> Tekrar prosedürü devam etmeden önce mümkün olduğunca artık bakteri kadar çıkarmak için 3.2 ve 3.3 2x adımları. </li><li> , Üç katı olan bir hacim içinde 0.1 N NaCI içinde yeniden süspanse solucanlar, örneğin 1.5 ml, 3 ml ya da 6 ml olan tek tek solucanlar tüp görülebilir. </li><li> 5 N NaOH ve% 5 sodyum hipoklorit, sonsuz süspansiyona bir 01:02:06 oranında (çamaşır suyu) çözeltisi ekleyerek solucanlar Bleach. Örneğin, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml% 5 sodyum hipoklorit: solucan süspansiyonu 6 ml. Solucan süspansiyonuna eklemeden önce NaOH ve ağartıcı karıştırın. </li><li> Vortex çözelti kuvvetli bir şekilde gebe solucanlar çözülene kadar ve sadece yumurta süspansiyonu (yaklaşık 5-10 dakika) içinde görülebilir. 10X objektif ile bir faz kontrast mikroskop kullanılarak işlemi izler. </li><li> Solucanlar tamamen çözüldükten sonra, pelet hemenyumurta 45 saniye boyunca 800 x g hızında, 4 ° C &#39;de Süpernatantı ve 4 ° C&#39;de 45 saniye boyunca 800 x g &#39;de santrifüj ile topak, steril 10 ml su ile iki kez durulama pelet </li><li> Ağartma sonra, 100 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen mCeHR ortam 10 ml içeren, 25 cm 2 doku kültürü şişesine yumurta pelet aktarın. Steril teknikleri kullanarak bu işlemi yürütmek. Arzu edildiği takdirde, aksenik sıvı kültürlerde bakteri gelişimini önlemek için 250 ug / ml nalidiksik asit de dahil olmak üzere, ilave antibiyotikler ekleyin. </li><li> Yaklaşık 70 rpm bir çalkalama inkübatöründe 20 ° C&#39;de, sıvı kültürleri inkübe edin. </li><li> Gelişme aşamasına ve büyüme oranını dikkate günlük solucanlar edin. Not: Worms başlangıçta yavaş büyür ve gebe olmak için 7 ila 10 gün gerektirir. Solucanlar sıvı ortama alışmak Ancak, nesil zaman vahşitip (N2) solucanlar için yaklaşık 4 gün düşecektir. </li><li> Solucanlar deve aldıktan sonrabir konik tüp solucan kültür aktarmak ve, salıncak kovalı bir rotor kullanılarak 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de topak haline solucanlar, sıvı ortam içindeki sahne gebe miştir. </li><li> Süpernatantı ve yavaşça 0.1 M NaCI eşit hacimde solucan pelletini. Örneğin, mCeHR 10 ml kültür solucanlar için 0.1 M NaCl 10 ml kullanımı. Solucanlar buz üzerinde 5 dakika boyunca yerleşmek için izin verin. </li><li> 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma prosedürü uygulayın ve solucanlar aksenik sıvı ortam maddesi içinde bir ikinci nesil boyunca büyümeye izin verir. Gerekirse, bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için yeniden antibiyotik ekleyin. </li><li> Yine bir senkronize bir popülasyonunun üretilmesi için adımlar 3,5-3,8 de tarif edildiği gibi yeniden ağartıcı, adımlar 3.12 ve 3.13 &#39;te tarif edildiği gibi daha sonra 0.1 M NaCl içinde solucanlar ve pelet tekrar süspansiyon solucanlar gebe olmayı sağlar. Artık antibiyotik olmadan sıvı ortamda L1 larva solucanlar büyür. </li></ol> Sıvı 4. Senkronizasyon WormsKültür <ol><li> Pellet ve adımlar 3.12 ve 3.13 de yukarıda tarif edildiği gibi, 0.1 M NaCl içinde solucanlar tekrar süspansiyon. 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma. </li><li> M9 tampon, 10 ml yumurta pelletini ve larvalar döner platformlu sallayıcı üzerinde 20 ° C &#39;de O / N yumurtadan izin verir. Not: Yumurta L1 larva cünyır olacak, ama daha fazla geliştirmek değil, L1 aşamada solucanlar senkronize. </li><li> Korumak ve alt kültür solucan, 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de topak L1 larvalarının, daha sonra 10 ml mCeHR ve bir 25 cm 2 şişesine transfer larvaları için tekrar süspansiyon. Solucanlar dönen bir platform üzerinde 20 ° C&#39;de büyümeye izin verin. Solucanlar için yeterli beslenme sağlamak için 3.000 solucan / ml / cm 2 maksimum yoğunluğunu korumak. Not: Bu aşamada, antibiyotikler işlemleri bir laminar akış başlığı içinde steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmektedir zaman aksenik koşullarını korumak için gerekli değildir. Worms büyümesini izlemek için her gün kontrol edilmelidir. </li></ol> 5. Bedavaaksenik Orta Kültürler kuvvet ve Çözülme Worms <ol><li> Aksenik asenkron solucan kültürleri veya sıvı azot içinde senkronize L1 larva dondurun. 5 dakika boyunca 800 x g Pellet solucanlar daha sonra her bir şişeye 0.5 ml &#39;si kullanılarak S tamponu (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCI) yeniden süspanse edin. Her bir şişeye,% 30 h / h gliserol, S tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve sıvı N2 içinde uzun süreli depolamadan önce -80 ° C&#39;ye kadar solucanlar aktarın. Her bir şişe içinde, ml başına yaklaşık 1 x 10 6 solucanlar dondurun. </li><li> Hemen hemen tüm buz eriyene kadar yaklaşık 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek şişe solucanlar çözülme. Bir laminar akış başlığı içinde, mCeHR içeren steril bir şişeye solucanlar transferi ve 20 ° C &#39;de koyun </li></ol> 6.. MCeHR Büyüme ve Üreme üzerine Hemin Konsantrasyon Etkisi belirleyin <ol><li> C arasında besin bağımlı büyüme analizi için mCeHR aksenik ortamı kullanın elegans. Etkisi o belirlemeksolucan büyüme ve gelişme üzerinde f hemini konsantrasyon, aksenik N2 solucan veya diğer ilgi suşları senkronize kullanın. Bölüm 4&#39;te yukarıda tarif edildiği gibi L1 larvalarının senkronize. </li><li> Ertesi gün, pelet ve senkronize L1 larvaları saymak ve aksenik medya ul başına 1 solucan sulandırmak üzerine. 0.3 M NH4 OH 10 mM hemin klorid yapın ve konsantre HCI kullanılarak pH 8&#39;e ayarlanır. </li><li> Bir 24-yuvalı plaka mCeHR medya 800 ul ekleyin. Ortam 100 ul her bir oyuğa 100 solucanlar ekleyin. 0 uM, 1.5 uM, üç kopya halinde 1.000 uM arasında değişen konsantrasyonlarda her bir göze hemin klorür ekleyin. Tüm çukurlar 0.3 M NH4 OH aynı konsantrasyonunu içeren emin olun. Yavaşça 100 L1 larvalarının her bir göze ilave emin olmak için pipetleme önce solucanlar yeniden süspansiyon haline getirildi. </li><li> Günlük solucanlar inceleyin ve her bir konsantrasyonda her bir büyüme not edin. Inkübasyon 9 gün sonra solucanların sayısını ve her bir heme tekabül solucanlar / ml sayısını arsakonsantrasyonu, (Şekil 1). </li></ol> Heme Sensör Worms Hemin Konsantrasyon 7. Etkisi <ol><li> 4 içeren mCeHR senkronize L1 heme sensörü solucanlar (Phrg-1 :: GFP) inkübe ilM, 8 uM, 10 uM ve 20 uM hemin. </li><li> Floresan konfokal mikroskopi, 48 saat sonrası inkübasyon (Şekil 2) kullanılarak görüntü solucanlar. </li></ol> 8. Transgenik C oluşturmak için mCeHR kullanmak elegans mikropartikül bombardımanı ile Not: Şekil 3 13&#39;te gösterilmiştir üreten ve unc-119 (ED3) mCeHR yetiştirilen solucanlar kullanılarak mikro-parçacık bombardımanı gerçekleştirilmesi için prosedür. <ol><li> Solucan Hazırlık <ol><li> Bir 175 cm2 şişeye bir hafta önce bombardımanı için mCeHR ortam 90 ml, yaklaşık 1 x 10 6 uyumsuz unc-119 (ED3) solucanlar aktarın. Solucanlar 20 ° C o büyümeye izinna 70 rpm (Şekil 3-1) ~ at platformu sallayarak. Not: Bir hafta sonra, solucan yoğunluk birçok yetişkin gebe solucanlar ile önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Yaklaşık 3 x 10 7 solucanlar mikropartikül bombardımanı için gerekli olacaktır. </li><li> Chill JM109 E. coli buz üzerinde 10 cm NGM plakaları seribaşı. </li><li> Iki 50 ml konik tüplere aksenik solucanlar aktarın ve 2 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj solucanlar. Süpernatan aspire ve M9 tamponu (Şekil 3-2), 50 ml bir tüp içinde, her solucanlar tekrar süspansiyon. </li><li> Büyütülmüştür buz üzerinde 10-15 dakika boyunca yerçekimi ile pelet izin verin. Not: 2 ml Pelet şimdi&gt;% 90 erişkin solucanlar içermelidir. Bu pelet 2 ml, yaklaşık 5 x 10 6 solucanlar ve bir mikropartikül bombardımanı için yeterli olmalıdır. </li><li> Coat soğutulmuş JM109 tüm yüzeyi solucanların 2 ml pelet NGM plaka tohumlandı. Tamamen emilecek sıvı daha sonra plaka terk Veren(Şekil 3-3) geçmeden önce, buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı. </li></ol></li><li> Altın partikülleri hazırlanması <ol><li> Bir silikon mikrosantrifüj tüpüne altın partiküllerinin 30 mg tartılır. 1 ml% 70 etanol ekleyin ve 5 dakika için tüp vorteks. </li><li> Tüp altın parçacıkları pelet 10 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj, ardından 15 dakika boyunca bekletin. Dikkatli bir altın parçacıklarına tüp ters tarafına ucu dokunarak bir pipet kullanarak süpernatantı. </li><li> 1 dakika boyunca steril 1 ml su, girdap ile altın parçacıkları yıkayın ve kısa bir süre için 10 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj tüpü. Daha sonra steril% 50 gliserol, 0.5 ml altın parçacıkları tekrar süspansiyon, iki kez yıkama adımı tekrar edin. Not: altın parçacıkları son konsantrasyonu, 60 mg / ml olacak ve 4 ° C sıcaklıkta 1-2 ay boyunca saklanabilir </li></ol></li><li> DNA-altın partikül karışım hazırlayın <ol><li> 10 ve istenilen plazmid DNA 10 ug birleştirin# 956, bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde unc-119 kurtarma plazmid g. DI su 50 ul ve de yeniden süspansiyon haline getirildi altın partikül çözelti daha sonra 1 dakika boyunca vorteks 100 ul ekle. </li><li> 2.5 M CaCI2 150 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca çözelti yine vorteks. Bu çözeltiye, 3-5 dakika boyunca 0.1 M spermidin ve vorteks 60 ul ekle. </li><li> Pulse 10 sn boyunca 6.000 xg&#39;de çözümü santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 300 ul ekleyin. Vortex de 1 dakika boyunca, 6000 x g&#39;de santrifüj puls,% 100 etanol içinde 170 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. Şiddetle 5 ila 10 dk sonra santrifüj nabız ve süpernatant kaldırmak için çözüm vorteks. </li></ol></li><li> Bombardıman (Şekil 3-3) Not: Bu protokol, Malzeme / Ekipman Tablosunda belirtilen partikül teslim sistemi ile gerçekleştirilir. Mevcut parçacık teslim enstrüman için yönergeleri izleyin. <ol> &lt;li&gt; 15 cm tabak içine doku bir kağıt yerleştirin. Cımbız kullanarak, ayrı ayrı% 100 etanol içine yedi macrocarriers daldırma ve kurumaya dokusu üzerinde onları yatıyordu. </li><li> ,% 70 etanol ile biyolistik odası, makro-taşıyıcı tutucu, ve hedef plaka temizleyin. Temiz ve her bombardımanı işlem öncesi durdurma ekranları otoklav. </li><li> Oturma aracını kullanarak tutucu içine cımbız ve basın kullanarak tutucuya macrocarrriers yükleyin. </li><li> Eşit her bir makro taşıyıcı merkezinde DNA kaplı altın partiküllerinin 20 ul yayılır ve daha sonra çözelti, tamamen kurumaya bırakın. </li><li> Etanol ile basınç bölücünün iki parçalarını temizleyin ve etanol temizlenmiş kopma diskler ile birleştirin. Bombardıman odasına monte basınç bölücü ve kopma diskleri vida. </li><li> Macrocarrier sahibinin bir otoklava durdurma ekran birleştirin ve metal gerekli raf ve yerinde kilitlemek için aparat yerleştirin. </li><li> Monte Macr kaydedinocarrier basınç altında ayrılmış bölücünün yuvasına biyolistik odasına cihaz ve basınç bölücü aynı hizaya gelir. </li><li> Hedef plakası raf üzerine solucanlar ile açık NGM plaka bantla ve odasının kapısını kapatın. </li><li> , Solucanlar bombardıman kopma diskleri kırmak için gerekli için basıncını ayarlamak için. , Hg basınç 28 inç vakum açın diskler delinmesine kadar sonra yangın düğmesine basın. </li><li> Vakum bırakın ve aparattan NGM plaka çıkarın. Plakadan solucanlar yıkayın ve JM 109 E ile seribaşı yirmi 10 cm NGM plakaları yeniden dağıtma coli (Şekil 3-4). </li><li> Solucanlar 25 ° C&#39;de 10-14 gün boyunca büyümeye ve plakalar açlıktan izin verin. Unc-119 kusur kurtarıldı Worms normal hareketi olacak ve şu anda tespit edilebilir. Bu bağımsız transgenik satırları (Figür temsil olarak daha fazla analiz için ayrı levhalar en az 10 &quot;Yabanitip&quot; solucanlar almake 3-5). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarları veya çıkar çatışması vardır beyan ederim.

Bu protokolde hızlı C. sağlayan bir modifiye aksenik sıvı medya mCeHR sunmak solucanlar, çok sayıda üretim elegans üretimi. Solucanlar E. kirletmeden yetişir gibi bu ortam birçok avantajları göstermektedir coli veya bakteriyel yan ürünleri ve beslenme ve toksikolojik çalışmalar istismar edilebilir. E. kullanılması E. coli ya da bu tür çalışmalarda diğer bakterilerin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, bakterilerin büyümesi çeşit...

Toprak nematod, Caenorhabditis elegans, toksikoloji genetikten çok sayıda çalışmalarda kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu 1 mm boyutu, dört gün, yetiştirme kolaylığı, hızlı bir üretim süresi ve büyük döl numaralarının bir sonucu olarak, bu nematodlar genetik ve farmakolojik ekranlar, 1, 2, bir dizi olarak kullanılmıştır. Araştırmacılar omurgalı sistemlerinde muhafaza molekülleri ve yolları belirlemek için bu solucanın yararlanmak. Bu yollar hücre ölümü sinyalleri, yaşlanma ve metabolizma yolları ve sinir sistemini 3-6 arasındadır. Buna ek olarak, C şeffaflık elegans doğrudan gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonu analiz etmek görselleştirilebilir floresan protein muhabir kullanılarak transjenik nesil için izin verir. Birçok çalışmada bu nematod nematod büyüme ortamı (NGM) plakalar kullanılarak, bir katı agar-bazlı bir yüzeye veya l kültürlenirJK monitörler kültürler bir besin kaynağı olarak 7,8 Escherichia coli ile tohumlandı. Bu bakteri gıda kaynakları tarafından ürünlerin sonuçların yorumlanmasını etkileyen bakteriyel müdahalesi ile biyokimyasal ve toksikoloji çalışmaları karıştırabilir. , C. Bu bileşik etkileri önlemek için, elegans bir besin kaynağı olarak bakteri yoksun olan bir aksenik sıvı ortam içinde kültive edilebilir. Bu medyayı kullanarak, başarılı birçok standart C için son derece senkronize solucan milyonlarca kültüre C. farklı olarak düzenlenen genlerin dahil olmak üzere, mikro-dizi analizi elegans protokolleri elegans heme farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve gen bombardımanı ile transgenik solucanlar üretimi. Bu ortam, kimyasal olarak tanımlanmış ve Dr Eric Clegg 9 formüle orijinal bir reçete modifiye edilir. Bu mCeHR medyayı kullanarak, başarılı heme homeostazda ilgili genleri tespit ettik, 10 (hrg ler) olarak heme duyarlı genlerin ifade yönelecekE ile ekim yapılmış olan NGM agar plakalar kullanmak normal büyüme koşullarında mümkün olmamıştır coli. Bu protokolde C tanıtmak ve korumak için prosedürü tarif E. yetiştirilen elegans coli aksenik mCeHR ve transgenik C üretmek için solucan çok sayıda elde etmek için bu yöntem kullanmak mikro-parçacık bombardımanı kullanılarak elegans hatları. C beslenme gereksinimini belirlemek için aksenik medyayı kullanmanın yararını göstermektedir biz de mevcut çalışmalar elegans bir örnek olarak heme kullanılmıştır. Bu çalışmalar mCeHR medya kullanarak C arasındaki bir sayıda hızlı büyüme sağlar olduğunu göstermektedir solucan araştırmacılar tarafından kullanılan birçok downstream uygulamalar için elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

Bu protokol, biz gerekli malzemeleri mevcut, ve modifiye C yapmak için prosedür. E Legans Alışma ve Üreme medya (mCeHR). Ayrıca, C teşhir ve acclimatizing için adımlar E. yetiştirilen elegans sıvı ortam aksenik coli açıklanmaktadır. Aksenik C kullanmaktadır Son olarak, alt-deneyler elegans Bu işlemin yararlarını gösterir. C analiz ve tespit yeteneği elegans besin gereksinimi değişen heme konsantrasyonları ile aksenik sıvı ortamda N2 yabani tip solucanlar büyüyen tarafından izah edildi. Bu prosedür, solucan büyüme ve gelişme için optimal konsantrasyonunu belirlemek için ya da ilaç tedavilerinin toksikolojik etkisini saptamak için söz konusu besin ile çoğaltılabilir. Yabani tip solucanlar büyümesi üzerinde çeşitli heme konsantrasyonlarının etkisi niteliksel mikroskopik gözlem yoluyla ve t ölçülmesi ile tespit edilmiştirHer bir heme konsantrasyonda büyüme solucanlar O sayısı. Buna ek olarak, çeşitli besin konsantrasyonlarının etkisi, ilgi konusu besin değişikliklere yanıt floresan sensörler ifade solucan kullanılarak analiz edilebilir. Ayrıca, solucan, çok sayıda mikro-parçacık bombardımanı ile kolayca transgenik C. elegans üretimi için üretilmiştir.

C Kültürleme E. tarafından üretilen ikincil metabolit müdahalesi olmaksızın, solucan için gerekli olan besin belirlenmesinde aksenik sıvı ortam yardımcıları elegans coli. Yabanitip N2 solucanlar üç kuşak içinde mCeHR ortama alışmak ve NGM bakteriyel plakalar üzerinde yetiştirilen solucanlar karşılaştırılabilir büyüme göstermektedir. Nitekim, bu solucanlar OP50 bakteriler üzerinde yetiştirilen solucanlar için 3.5 gün ile karşılaştırıldığında 4 gün için...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K Görüntüleme.  University of Maryland.  C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır. 

Video: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biyoloji

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Kültürleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler