Bu çalışma, Pittsburgh NIH hibe AG028977 Üniversitesi ALF tohum fonları tarafından desteklenen

Genel bakış Geleneksel olarak transgenik solucanlar C. transgen DNA microinjecting tarafından oluşturulan elegans germline 1,2,3,4. Başarılı olsa da, bu yaklaşım, özel ekipman ve solucan anatomi ve mikroenjeksiyon tekniği ile deneyim geliştirilmesi gerekli. Daha yakın zamanlarda Biyolistik bombardımanı germline 5,6 içine yabancı DNA tanıtmak için DNA kaplı altın parçacıkları kullanan bir alternatif yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, uygulama açısından başarılı olmak için daha az zaman yatırım gerektirir. C. Biyolistik bombardımanı transgenik solucanlar oluşturmak için elegans başarı hayvanların büyük bir miktar gerektirir böylece, bireysel solucanın düzeyde, düşük verimlilik vardır. Bu çeşitli yollarla yetiştirilen, ancak ilgili plakaların çalışma ve sayısını azaltmak için yumurta plakları kullanmayın olabilir. Bizim protokol yumurta plakaları ve solucanlar hazırlanması ile başlar ve daha sonra Bio-Rad PDS-1000/He yedi Sistemi kullanarak bombardımanı protokol üzerinde duruluyor. Biz Berezikov ve ark 7 iş kısmen bizim protokol uyarladı. Bombardımanı ile, unc-119 gen genellikle transgenik hayvanlar için bir belirteç olarak kullanılır. Bu mutasyonu taşıyan Worm suşları ciddi koordinasyonsuz ve zorlukla hareket, görünüm dumpy ve Dauer larva formu 8 için mümkün değildir. Dauer olumsuz koşullar altında üreme yetişkin gelişimini geciktirmek için kullanılan bir alternatif larva aşamasında olup, birden fazla genin 9 Dauer girmesinden tarafından düzenlenir. Unc-119 geni taşıyan birçok suşları C. edinilebilir. elegans Genetik Merkezi (CGC, Minneapolis, MN). Orijinal DP38 suşu (unc-119 (ED3)) ayrıca mansap deneyler etkileyebilecek alakasız bir Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutasyon taşıyor. Çeşitli laboratuvarları bu mutasyon outcrossed ve HT1593 gerginlik CGC edinilebilir. Transgenik hayvanlar DP38 suşu ile biraz daha kolay belirlenir ve bu gerginlik transgenik hayvanlar oluşturmak için kullanma eğiliminde. Gerekli olduğunda, daf-c mutasyon kaldırmak için transgenik solucanlar outcross HT1593 kullanın. Transgenlerin hazırlarken büyüyen plakalarının stok tutmak için DP38 solucanlar büyümeye protokolde yavaş adımları biridir. İfade ilgi gen ile birlikte unc-119 marker normal motilite ve vücut büyüklüğü 5 kurtarma dayalı transgen ifade hayvanların kolay tanımlama sağlar. Unc-119 gen, küçük bir C için çeşitli kaynaklardan ve vektörler unc-119 genomik DNA kullanarak unc-119 organizatörü ve cDNA ve genomik DNA elde edilebilir briggsiae gen 8,10 kullanılır. Biz son zamanlarda bir unc-119 kaset homolog rekombinasyon 11 ve Cre-lox rekombinasyon unc-119 geni taşıyan transgenik hayvanlar üretmek için 12 solucan fosmids değiştirmek için bir yöntem ampisilin direnç geninin içeren herhangi bir plazmid eklemek için basit bir protokol nitelendirdi . Plazmid Addgene A.Ş. (Cambridge, MA) mevcuttur. Tek bir bombardıman gerçekleştiren yer çaba önemli ama yönetilebilir olmasına rağmen, tek bir günde birden fazla bombardımanları yer alan ek iş az. Sonuç olarak, rutin olarak her getirici iş azaltmak için, transgenik solucanlar üretim küme. 1. Yumurta Plaka Hazırlık Unc-119 mutant solucanlar, çünkü bir tabak parçaları plaka diğer bölgelerinde hala yiyecek içeren süre açlıktan eğilimindedir engelli hareketlilik ile standart NGM plakalar üzerinde büyümek zor. Yumurta plakalar üzerinde kalın gıda tabakası unc-119 solucanlar daha kolay tarama ve tüm plaka 7 devralmaya izin Yumurta plakaları bu sorunu çözebilir. Yumurta plakaları da, solucanlar çok sayıda az plakaları 13 ihtiyaç vardır böylece büyümeyi destekleyen yararı var . Genellikle 5 yumurta plakaları, bir bombardıman için solucanlar büyümek için yeterli. Aşağıda tarif yaklaşık 50 plaka yapar ama, istenirse daha az yapmak için yarıya olabilir. Plakalar, antibiyotik ve antifungal ilaçlar kullanın ve sadece tabak tohumlama için hipoklorit tarafından üretilen yumurta kullanın, böylece yumurta plakaları kolayca kontamine olabilirler. 1. Gün: <ol><li> 500ml şişe LB (400 mL) hazırlayın. Otoklav için 20 dk. </li><li> ~ 50% 2 agar ile 1 litre NGA kullanarak 10 cm NGA plakaları dökün. 200 mg / ml 13 litre ve streptomisin başına nistatin 10 ml ekleyin. </li><li> 200 mg / ml streptomisin, LB OP50-1 40 ml gecede kültür büyütün. Bu gerginlik, streptomisin dirençli ve CGC edinilebilir. </li><li> 500ml şişe OtoklavErtesi gün. </li></ol> 2. Gün: <ol><li> Ayrı steril şişeye 10 tavuk yumurtası sarısında bulunur. Biz bir yumurta sarısı ayırıcı (Hedef de dahil olmak üzere ev mağazalar, mevcuttur) kullanın. Çalkalayınız. </li><li> LB ile 400ml hacim kazandırın. Sallamak </li><li> 1 saat 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında soğutun. </li><li> OP50-1, 40ml ekleyin. Sallamak </li><li> Plaka başına 5-8 ml karışımı dağıtın. </li><li> Plakalar gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmek için izin verin. </li></ol> 3. Gün: <ol><li> Plakaları kalan sıvı yavaşça dökün. Gece boyunca oda sıcaklığında kapakları ile kurumasını bekleyin. </li></ol> 4. Gün: <ol><li> Gerekli ° C kadar bir kutu ya da plastik torba ve mağaza, 4 tabak koyun. Bu plakalar, 1-2 ay kullanmak için Tamam gibi görünüyor. </li></ol> 2. Yumurta Tabaklar Seeding <ol><li> Konsantre OP50 son açlıktan plakaları ekleyerek 6 cm NGA plakalar üzerinde DP38 solucanlar genişletin. Tek bir bombardıman için, tohum 5 yumurta plaka ~ 6 küçük tabak kullanın. Birden fazla bombardımanları için, biz, yumurta plakaları ekim önce yerine tohum 2 zenginleştirilmiş pepton plakalar için küçük tabak kullanın. </li><li> DP38 solucanlar 13,14 hipoklorit kullanımı ile yumurta Yalıtmak. Steril S-bazal veya M9 tamponlar 13,14 yumurta tekrar </li><li> Yumurta plakaların uygun sayıda yumurta (plaka başına 10.000) ekleyin. Bombardımanı kullanmak için 7-10 gün boyunca 20 ° C&#39;de yumurta plakalar üzerinde solucanlar büyütün. Plakalar, solucanlar, yemek tabakları temizlemek için bir kez başladıktan sonra kullanıma hazır olacaktır. Bu plakalar, açlıktan ve daha uzun süreler için büyüyen solucan verimi artıracak gerçekten zor. </li></ol> Bombardıman Önümüzde zaman altın stoku hazırlamak ve 4 ° C kullanılmak üzere saklanır tutmak. Ayrıca gerekli lekesiz ve 10 cm NGA tabak fark vardır. Lekesiz plakaları önceden iyi dökülür ve iyice kurumasını solucanlar ile eklenen sıvı emilimini kolaylaştırmak için izin verilmesi gerekir. DNA kaplı altın parçacıkları, ilk önce hazırlamaya başlamadan bombardıman gününde, solucanlar yıkayın. Biz lekesiz NGA plakaları sonra solucanlar ve altın parçacıkları yıkama ve macrocarriers aktararak bitirmek. Altın parçacık hazırlanması: <ol><li> 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları 60 mg tartılır ve 15 dakika için% 70 etanol içinde bekletin. Spin altın parçacıkları çöktürmek için kısaca. </li><li> 3 kez steril su ile yıkayın ve altın toplamak için kısaca her zaman döndürün. </li><li> % 50 steril gliserol 1mL altın süspanse edin. Bu stok altın parçacık çözümü ve 4 ay süreyle saklanabilir ° C </li></ol> Worms: <ol><li> S-bazal veya M9 tamponu ile yumurta plakaları kapalı DP38 solucanlar Float ve 50ml konik tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Tüpler, solucanlar alt kadar bankta tutun. Sonra tampon aspirat ve taze S-bazal veya M9 ekleyin. Tampon enkaz nispeten netleşene kadar, 2 veya 3 kere yıkayın. DNA kaplama işlemi tamamlanıncaya kadar, bu aşamada solucanlar tutun. </li><li> Aspire edin ve yaklaşık 2-3 ml bombardımanı ortalama tamponunda solucanlar bırakın. Buz üzerinde 10 cm lekesiz NGA plaka transfer. NGA plaka bombardımanı önce tamamen kuru olarak transfer hacmi en aza indirmek önemlidir. Solucanlar plakanın tüm yüzeyini kapsayacak şekilde emin olun. </li><li> Plaka buz üzerinde kurumasına izin verin. Buz kurutma sırasında topaklanma solucanlar önleyecektir. </li></ol> Bu adım önemlidir: tabak kuru olmalıdır ve solucanlar NGA plaka üzerinde eşit dağılmış. Solucanlar buz üzerinde tutulması, plaka üzerinde hareket eden ve yığınları içine bir araya engeller. DNA hazırlığı (bir bombardıman için): <ol><li> 1.7mL bir tüp içinde karıştırın: <ul><li> 50μl altın parçacıkları. Eklemeden önce iyice süspanse edin. </li><li> 50μl DNA (10-15ug). Biz dairesel veya doğrusal DNA arasında çok az fark görüyoruz. Genellikle (Qiagen Inc, Valencia, CA) DNA saflaştırılması için Qiagen midiprep kartuşlarını kullanın. </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Bu çözüm, oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca stabildir. </li><li> 20μl 0.1M spermidin. Spermidin sulu çözeltide kararsız. -20 ° C&#39;de 70μl spermidin alikotları ve mağaza olun Daha sonra bir 0.1M çözüm elde etmek için sağa kullanımdan önce su 1 ml ekleyin. Bu çözüm, her bombardımanı için taze hazırlanmış olmalıdır. Vorteks Biz genellikle vorteks sonra düşük bir hızda 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları ve CaCl 2, DNA ve spermidin / protamin damla damla ekleyin. Kalsiyum fosfat ile transfekte olan insanlar için bu tekniği tanıdık. Biz çok iyi sonuçlar 15 ile yerine spermidin protamin da kullanılır. Biz su taze bir çözüm (1mg/ml) hazırlayacak ve bizee 50μl yerine spermidin 20μl. Eğer protamin kullanımı, genellikle buz üzerinde yerleştirme yerine 10 dakika boyunca karışımı oda sıcaklığında inkübe edin. Protamin dondurulmuş tutulmalıdır gerekmez ve bir toz bir sıvı yerine. </li></ul></li><li> 30 dakika için buz karışımı inkübe ve süspansiyon altın parçacıkları tutmak için periyodik olarak karıştırın. Daha sonra kısaca spin ve süpernatant aspire. </li><li> 300μl% 70 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin. </li><li> 1 ml% 100 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin. </li><li> 170μl% 100 etanol içinde süspanse edin. </li></ol> Macrocarriers, hazırlanması: <ol><li> 2-propanol içinde 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durulayın. Kağıt mendil koyun ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Her macrocarrier merkezinde DNA / altın karışımı 20μl ekleyin. Süspansiyon altın tutmak için pipetleme önce vorteks sağ emin olun. </li><li> Buharlaşması etanol edelim. </li></ol> 3. Bombardıman Deney sistemi yoluyla helyum temizlemek için önce boş bir bombardıman gerçekleştirmek için emin olun. <ol><li> , Vakum pompası ve yakın vakum pompası kapanı açın. Biz yağsız vakum pompası kullanın. </li><li> Helyum tankı açın. Basıncı ≥ 2200psi kontrol edin. </li><li> 2-propanol içinde Islak rüptürü disk (1350 psi), yedi adaptör için istinat kap yerleştirerek. </li><li> PDS-1000 sistemi içine adaptörü Vida ve verilen tork anahtarı ile sıkın. </li><li> 7 sahibi ve koltuk onlara sağlanan bir aracı haline macrocarriers yerleştirin. Sonra sahibine yedi stop ekran ve alt koydu. Üst ikinci raf üzerinde yer tutucu ve çevirin. Macrocarriers altın benekli tarafı bu noktada aşağı bakacak şekilde olmalıdır. </li><li> Yedi adaptör çıkışları ile macrocarrier sahibinin üst deliklerini. </li><li> Bombardıman odasında en düşük raf solucanlar (kapak kapalı) ile kaplı NGA plaka koyun. </li><li> Tamamen PDS-1000 vakum debi topuzu açın. Vac düğmesine basın odası Hg olarak 26 ulaşana kadar. Sonra vakum korumak için konumda tutun geçmek. </li><li> Disk rüptürlerinin kadar yangın düğmesine basın ve basılı tutun. Basınç 1350psi ulaştığında bu olur. Bazen bu meydana 5-20 saniye sürer. Düğmesini bırakın. </li><li> Vakum odası (havalandırma pozisyon) bırakın ve plakasını çıkarın. </li><li> Vakum ve helyum kapalı açın. </li><li> Yangın hattı helyum (helyum göstergesi 0 psi işaretlemeniz gerekir) içermez kadar birkaç kez. </li><li> PDS-1000 sistemi kapatın. </li></ol> Bombardımanından sonra Worm kurtarma: <ol><li> 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca bombardımana plaka bırakın. </li><li> 10 ml S-bazal veya M9 tampon plaka solucanlar Float. </li><li> 20 - 10 cm benekli NGA plakaları 0.5mL solucanlar koyun. </li><li> Yaklaşık 2 hafta ° C ya da oda sıcaklığında (22-24 ° C) kurtarıldı solucanlar için kontrol etmeden önce 20 bırakın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile unc-119 (+) fenotipi ile solucanlar için ekran. Kurtarıldı solucanlar kurtarıldı olmayan solucanlar üzerinde sağkalım avantajı beri plakaları açlıktan sonra tarama için en uygun zaman. </li><li> Kurtarıldı solucanlar bulunan her 10 cm plaka tek bir hat oluşturun. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Transgenik hayvanlar elde etmek için ilgili protokolün başarısı özellikle transgen bağlıdır. Organizatörü: GFP muhabiri transgenlerin 20 satır kadar almış. Daha tipik bir sonucu 3-10 satır. Transgenik hatların% 30 entegre çizgiler, ancak bu rastgele ve entegre bir çizgi özellikle isteniyorsa, biz tek bir günde birden fazla bombardımanları gerçekleştirecek.

<ol>
	<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wormbook. , 1-15 (2006).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li><li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+unc-119,+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li><li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation.">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li><li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA.">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li><li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment.">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li><li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+robust,+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering.">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells.">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li><li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transformation:+microbes+to+mice.">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li></ol>

Biyolistik bombardımanı C. dahil olmak üzere, birçok organizma içine yabancı DNA tanıtmak için basit bir yöntem elegans 1,5,6,7,16. CaCl 2 varlığı DNA ile bir kompleks oluşturan altın parçacıkları dayanmaktadır. Katyonik poliaminler, böyle bir spermidin olarak, in vivo nükleaz bozulması DNA korur. Spermidin labil bir molekül olduğu için, küçük alikotları -20 ° C&#39;de saklayın ve sağ bombardımanı gerçekleştirmeden önce çözüm için önemlidir...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

Serbest yaşayan nematod C. kullanarak laboratuvarların sayısı elegans hızla büyüyor. Bu biyolojik model popülerlik hızlı bir nesil zaman ve kısa ömrü, kolay ve ucuz bakım, tam sıralı genom ve RNAi kaynaklarını ve mutant hayvanlar dizisi atfedilir. Ayrıca C, analiz elegans genom, solucan, araştırma yapılan çalışmalarda tüm fareler veya kültür hücreleri için önemli bir yardımcı olabileceğini düşündürmektedir solucanlar ve yüksek omurgalılar arasında büyük bir benzerlik ortaya koymuştur . Güçlü bir solucan araştırma ve önemli bir kısmı gen yerelleştirme ve fonksiyon çalışma transgenik hayvanlar kullanma yeteneği. Transgenik hayvanlar ya solucan germline mikroenjeksiyon yoluyla veya Biyolistik bombardımanı kullanmak suretiyle oluşturulabilir. Bombardıman yeni bir tekniktir ve laboratuarları bir dizi daha tanıdık geliyor. Burada Biyolistik Bio-Rad PDS-1000 sistemi kullanarak altın parçacıkları ile bombardımanı ile transgenik solucanlar oluşturmak için basit bir protokol açıklar. Hermafrodit germline içine DNA mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bu protokol solucan anatomisi tanımlanması veya mikroenjeksiyon performans açısından operatör özel beceri gerektiren bir avantaja sahiptir. Ayrıca birden fazla transgenik hatları genellikle tek bir bombardıman elde edilir. Ayrıca mikroenjeksiyon aksine, Biyolistik bombardıman ekstrakromozomal diziler ve entegre transgenlerin ile transgenik hayvanlar üretir. Entegre transgenik çizgiler elde etme yeteneği, yabancı DNA&#39;nın entegre mutajenik protokollerin kullanımını önlemek. Sonuç olarak, özellikle mikroenjeksiyon az becerikli olmak için gerekli olan zaman ve çaba yatırım ilgilenen araştırmacılar için Biyolistik bombardımanı, transgenik hayvan üretimi için cazip bir yöntem olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation at JoVE.com

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenik solucanlar yaygın olarak kullanılır<em&gt; C. elegans</em&gt; Araştırma. Açıklanan DNA kaplı altın parçacıkları ile Biyolistik bombardımanı kullanarak solucanlar transgenlerin tanıtmak için, basit ama etkili bir protokoldür. Transgenik hayvan üretimi için mikroenjeksiyon ile ilgili çaba ve bombardıman sonuçları olumlu karşılaştırın.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. Transgenik solucanlar yaygın olarak kullanılır C. elegans Araştırma. Açıklanan DNA kaplı altın parçacıkları ile Biyolistik bombardımanı kullanarak solucanlar transgenlerin tanıtmak için, basit ama etkili bir protokoldür. Transgenik hayvan üretimi için mikroenjeksiyon ile ilgili çaba ve bombardıman sonuçları olumlu karşılaştırın.

Video: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Kültürleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Temel

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem

Antikor boyamasında

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli

Kültürleme

Transgenik Üretimi