Ce travail a été soutenu par les National Institutes of HealthGrants DK85035 et DK074797 (IH).

1. Souches de vers <ol><li> Obtenir C. elegans de type sauvage souches Bristol N2 du Centre de Génétique Caenorhabditis (CCG) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) et de les maintenir sur des plaques NGM ensemencé avec E. coli souche OP50 7. Remarque: le ver transgénique souches IQ6011 (PHRG-1 :: GFP) utilisés ont été générés comme décrit précédemment 11. IQ6011 peut être demandé à l&#39;auteur correspondant. </li></ol> 2. Préparation de modification C. elegans Habitation et Reproduction moyen (mCeHR) Préparez le support de liquide mCeHR comme décrit ci-dessous 12. Ce support liquide axénique permet aux vers de se développer sans sources de nourriture. Effectuer toutes les manipulations de milieux liquides axéniques et vers axéniques en utilisant des conditions strictement stériles comme une hotte à flux laminaire. <ol><li> Obtenir ultra lait pasteurisé d&#39;une épicerie sans gras. Utilisez le pro réfrigéréconduit pas et le produit de la température ambiante. Avant de procéder au mCeHR moyen, zèbrent le lait sur cœur-cervelle (BHI) plaques de gélose et incuber pendant 3 jours à 30 ° C et 37 ° C pour vérifier la stérilité. Transvaser le lait à 50 ml tubes stériles et conserver à -80 ° C </li><li> Préparer chacun des éléments suivants et de les combiner dans l&#39;ordre et les montants proposés pour préparer 1 L de mCeHR (Tableau 1A): 10 ml d&#39;mM choline diacide citrate 2, 10 ml de vitamine et facteur de croissance mélange (voir la recette dans le tableau 1B), 10 ml de 2,4 mM de myo-inositol, 10 ml de 2 mM de chlorure de l&#39;hémine, 250 ml d&#39;eau désionisée. Appliquer le vide et le filtre à travers une unité de filtre de 0,22 um. </li><li> Ajouter 20 ml de mélange d&#39;acide nucléique (recette dans le tableau 1C), 100 ml de mélange minéral (recette dans le tableau 1D), 20 ml de 170 mg / ml d&#39;hydrolysat de lactalbumine, 20 ml d&#39;acides aminés essentiels, 10 ml d&#39;aminé non essentiel acides, 20 ml de 450 mM KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucose, 10 ml de HEPES 1 M, sel de sodium, 250 ml d&#39;eau désionisée. </li><li> Appliquer le vide pour filtrer stériliser les composants. Retirez le filtre et ajouter 1 ml de 5 mg / ml cholestérol. Assurez-vous que le pH du milieu est d&#39;environ 6-6,5. Remarque: cette solution peut être stockée à -80 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li><li> Ajouter 20% (v / v) ultra lait écrémé pasteurisé organique au milieu mCeHR avant utilisation. Utiliser une technique scrupuleusement stérile (par exemple dans une hotte à flux laminaire) lors de l&#39;ouverture et aliquotage le lait. Conservez le support à 4 ° C. </li></ol> 3. Préparer C. elegans pour la culture en milieu liquide Axenic mCeHR <ol><li> Grandir vers sur dix de 60 mm plaques NGM jusqu&#39;à il ya beaucoup de vers gravides et une quantité minimale de OP50 E. coli sur les plaques. </li><li> Retirer les vers à partir de chaque plaque en rinçant avec 5 ml de tampon M9 (recette dans le tableau 1F), et combiner dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Autoriser les vers à settle en laissant le tube reposer pendant 5 à 10 min puis retirez délicatement le surnageant contenant le E. coli. </li><li> Répéter les étapes 3.2 et 3.3, 2x pour enlever autant de bactéries résiduelles que possible avant de poursuivre la procédure. </li><li> Remettre en suspension les vers dans 0,1 N de NaCl dans un volume qui est un multiple de trois, par exemple 1,5 ml, 3 ml ou 6 ml dans lequel les vers individuels peuvent être vus dans le tube. </li><li> Blanchir les vers de terre en ajoutant du NaOH 5 N et de l&#39;hypochlorite de sodium à 5% (eau de Javel) dans un rapport de 01:02:06 pour la suspension à vis sans fin. Par exemple, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml 5% d&#39;hypochlorite de sodium: 6 ml de la suspension de la vis sans fin. Mélanger le NaOH et l&#39;eau de Javel avant d&#39;ajouter à la suspension de ver. </li><li> Vortex la solution vigoureusement jusqu&#39;à ce que les vers gravides sont dissous et que des œufs sont visibles au sein de la suspension (environ 5 à 10 min). Surveiller le processus en utilisant un microscope à contraste de phase avec un objectif 10X. </li><li> Après les vers sont complètement dissous, culot immédiatement leœufs à 800 g pendant 45 sec à 4 ° C. Enlever le surnageant et rincer le culot deux fois avec 10 ml d&#39;eau stérile par centrifugation le culot à 800 g pendant 45 sec à 4 ° C. </li><li> Après le blanchiment, transférer le culot d&#39;oeuf à un ballon de 25 cm de tissu 2 de culture contenant 10 ml de milieu mCeHR supplémenté avec 100 ug / ml de tetracycline. Effectuer cette procédure en utilisant des techniques stériles. Si vous le souhaitez, ajouter d&#39;autres antibiotiques, y compris 250 pg / ml d&#39;acide nalidixique, à prévenir la croissance bactérienne dans les cultures liquides axéniques. </li><li> Incuber les cultures liquides à 20 ° C sur un incubateur à agitation par secousses à environ 70 tours par minute. </li><li> Vérifier les vers tous les jours de noter le stade de développement et le taux de croissance. Remarque: Worms seront d&#39;abord se développer lentement et nécessitent 7 à 10 jours pour devenir gravide. Cependant, comme les vers s&#39;acclimater au milieu liquide le temps de génération diminue à environ 4 jours pour type sauvage (N2) vers. </li><li> Après les vers ont développé au stade gravide en milieu liquide, transférer la culture à vis sans fin à un tube conique et un culot les vers à 800 xg pendant 5 min à 4 ° C en utilisant un rotor à godets oscillants. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre le culot en douceur à vis sans fin dans un volume égal de 0,1 M de NaCl. Par exemple, utiliser 10 ml de NaCl 0,1 M pour les vers cultivées dans 10 ml de mCeHR. Autoriser les vers de se contenter de 5 min sur la glace. </li><li> Effectuer la procédure de blanchiment tel que décrit ci-dessus dans les étapes 3.5 à 3.8, et permettre aux vers de se développer pour une deuxième génération dans les milieux liquides axéniques. Si nécessaire, ajouter à nouveau de l&#39;antibiotique pour inhiber la croissance bactérienne. </li><li> Encore une fois les vers permettent de devenir gravide alors culot et remettre les vers dans 0,1 M de NaCl comme décrit dans les étapes 3.12 et 3.13, puis blanchir à nouveau comme décrit dans les étapes 3.5 à 3.8, pour produire une population synchronisée. Cultiver les vers larvaires L1 dans des milieux liquides sans antibiotiques à partir de maintenant. </li></ol> 4. Synchronisation Worms de liquideCulture <ol><li> Pellet et remettre les vers dans 0,1 M de NaCl, comme décrit ci-dessus dans les étapes 3.12 et 3.13. Bleach comme décrit ci-dessus dans les étapes 3.5 à 3.8. </li><li> Remettre en suspension le culot de l&#39;oeuf dans 10 ml de tampon M9 et laisser les larves éclosent O / N à 20 ° C sur un agitateur à plateau tournant. Remarque: Les œufs éclosent en larves L1, mais ne seront pas développer davantage, la synchronisation des vers au stade L1. </li><li> Pour maintenir et vers la sous-culture, culot L1 larves à 800 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les larves dans 10 ml de mCeHR et transférer dans une fiole de 25 cm 2. Autoriser les vers de se développer à 20 ° C sur une plate-forme tournante. Maintenir une densité maximale de 3000 vers / ml / cm 2 pour assurer une nutrition adéquate pour les vers. Remarque: A ce stade, les antibiotiques ne sont pas nécessaires pour maintenir des conditions axéniques lorsque les procédures sont effectuées en utilisant des techniques stériles dans une hotte à flux laminaire. Worms doivent être contrôlés quotidiennement pour surveiller la croissance. </li></ol> 5. Gratuitzing et de décongélation pour Worms cultures axéniques moyennes <ol><li> Geler les cultures de vers ou de larves axéniques asynchrones de L1 synchronisée dans l&#39;azote liquide. vers de granulés à 800 g pendant 5 min, puis remises en suspension dans un tampon de S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146.25) en utilisant 0,5 ml de chaque flacon. Ajouter un volume égal de tampon S avec 30% v / v de glycérol à chaque flacon et transférer les vers à -80 ° C avant l&#39;entreposage à long terme dans du N2 liquide. Congeler environ 1 x 10 6 par ml de vers dans chaque flacon. </li><li> Décongeler les vers en incubant les flacons à 37 ° C pendant environ 2 min jusqu&#39;à ce que la quasi-totalité de la glace est fondue. Dans une hotte à flux laminaire, transférer les vers dans un flacon stérile contenant mCeHR et placez-les à 20 ° C. </li></ol> 6. Déterminer l&#39;effet de Hemin concentration sur la croissance et la reproduction dans mCeHR <ol><li> Utiliser les médias mCeHR axéniques pour doser la croissance dépend de nutriments C. elegans. Pour déterminer l&#39;effet of concentration héminique sur la croissance du ver et le développement, l&#39;utilisation synchronisée vers N2 axéniques ou d&#39;autres souches d&#39;intérêt. Synchroniser les larves de L1 comme décrit ci-dessus à la section 4. </li><li> Le lendemain, granulés et compter les larves L1 synchronisé et diluer à 1 ver par ml de médias axéniques. Faire 10 mM de chlorure de hémine dans 0,3 M NH 4 OH et ajuster le pH à 8 avec HCl concentré. </li><li> Ajouter 800 ul de milieu mCeHR à une plaque de 24 puits. Ajouter 100 vers à chaque puits dans 100 ul de milieu. Ajouter le chlorure d&#39;hémine à chaque puits à des concentrations allant de 0 uM, 1,5 uM à 1,000 uM, en triple exemplaire. Assurez-vous que tous les puits contiennent la même concentration de 0,3 M NH 4 OH. Remises en suspension doucement les vers avant pipetage afin de s&#39;assurer que 100 larves L1 sont ajoutés à chaque puits. </li><li> Examiner les vers tous les jours et noter la croissance dans chaque concentration dans chaque puits. Comptez le nombre de vers après 9 jours d&#39;incubation et tracer le nombre de vers de terre / ml correspondant à chaque hèmeconcentration (Figure 1). </li></ol> 7. Effet de Hemin Concentration sur hème capteur Worms <ol><li> Incuber L1 vers des capteurs de l&#39;hème synchronisés (PHRG-1 :: GFP) dans mCeHR contenant 4 uM, 8 uM, 10 uM et 20 uM hémine. </li><li> Image les vers utilisant la microscopie confocale de fluorescence, 48 heures après l&#39;incubation (Figure 2). </li></ol> 8. Utilisant mCeHR pour générer transgénique C. elegans utilisant un bombardement de microparticules Remarque: La procédure pour générer et effectuer un bombardement de microparticules en utilisant les vers adultes dans mCeHR unc-119 (ed3) est décrit à la figure 3 13. <ol><li> Préparation de Worm <ol><li> Transférer environ 1 x 10 6 asynchrones unc-119 (ed3) vers dans 90 ml de milieu mCeHR dans un 175 cm 2 flacon une semaine avant le bombardement. Autoriser les vers de se développer à 20 ° C ona secouant plate-forme à ~ 70 min (figure 3-1). Remarque: Une semaine plus tard, la densité de la vis sans fin doit être significativement plus nombreux vers adultes gravides. Environ 3 x 10 7 vers seront nécessaires pour un bombardement de microparticules. </li><li> Froid JM109 E. coli ensemencé 10 cm de plaques NGM sur la glace. </li><li> Transférer les vers axéniques à deux tubes de 50 ml coniques et centrifuger les vers à 800 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et remettre les vers dans chaque tube 50 ml de tampon M9 (figure 3-2). </li><li> Laissez les vers adultes de granulés par gravité pendant 10 à 15 min sur la glace. Remarque: Le 2 ml culot doit maintenant contenir&gt; 90% vers adultes. Ce 2 ml culot doit avoir environ 5 x 10 6 vers et est suffisant pour un bombardement de microparticules. </li><li> Manteau de toute la surface de la JM109 réfrigérés ensemencée plaque NGM avec 2 ml de culot vers. Laisser le liquide soit complètement absorbé puis laisser la plaquependant 30 min sur la glace avant de poursuivre (figure 3-3). </li></ol></li><li> Préparation de particules d&#39;or <ol><li> Peser 30 mg de particules d&#39;or dans un tube à centrifuger siliconé. Ajouter 1 ml de 70% d&#39;éthanol et vortex le tube pendant 5 min. </li><li> Laisser le tube reposer pendant 15 min, puis centrifuger à 6000 g pendant 10 secondes pour sédimenter les particules d&#39;or. Retirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette en touchant soigneusement la pointe sur le côté du tube opposée à des particules d&#39;or. </li><li> Laver les particules d&#39;or avec 1 ml d&#39;eau stérile, vortex pendant 1 min et centrifuger brièvement le tube à 6000 g pendant 10 sec. Répéter l&#39;étape de lavage deux fois, puis remettre en suspension les particules d&#39;or dans 0,5 ml de glycerol à 50% stérile. Remarque: La concentration finale des particules d&#39;or sera de 60 mg / ml et il peut être stocké pendant 1 à 2 mois à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer le mélange de particules d&#39;ADN d&#39;or <ol><li> Moissonneuse 10 pg de l&#39;ADN de plasmide désiré avec 10 &amp;# 956; g de l&#39;unc-119 de sauvetage plasmide dans un tube de 1,5 ml microtubes siliconé. Ajouter 50 ul d&#39;eau DI et 100 ul de solution de particules d&#39;or et ensuite remises en suspension à vortex pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 150 ul de 2,5 M de CaCl2 et le vortex à nouveau la solution pendant 1 min. A cette solution, ajouter 60 ul de 0,1 M de spermidine et vortex pendant 3 à 5 min. </li><li> Pulse centrifuger la solution à 6000 g pendant 10 sec, éliminer le surnageant et ajouter 300 ul d&#39;éthanol à 70%. Vortex bien pendant 1 min, impulsion centrifuge à 6000 xg, enlever le surnageant et remettre en suspension dans 170 ul d&#39;éthanol 100%. Vigoureusement vortex la solution pendant 5 à 10 minutes, puis pouls centrifugeuse et enlever le surnageant. </li></ol></li><li> Bombardement (figure 3-3) Remarque: Ce protocole est réalisé avec le système de délivrance de particules indiquée dans le tableau des matériaux / équipement. Suivez les instructions de l&#39;instrument de délivrance de particules disponibles. <ol> &lt;li&gt; Placez une feuille de papier de soie dans une plaque de 15 cm. L&#39;aide de pinces, tremper sept macrocarriers individuellement dans 100% d&#39;éthanol et les poser sur le tissu à sécher. </li><li> Bien nettoyer la chambre biolistique, titulaire macrosupport, et la plaque de la cible avec 70% d&#39;éthanol. Nettoyer et stériliser à l&#39;autoclave les écrans d&#39;arrêt avant chaque procédure de bombardement. </li><li> Chargez les macrocarrriers dans le support en utilisant des pinces et appuyez sur le support en utilisant l&#39;outil de coin. </li><li> Répartir uniformément 20 pl de l&#39;ADN des particules recouvertes d&#39;or dans le centre de chaque macrosupport puis laisser la solution sécher complètement. </li><li> Nettoyer les deux parties du diviseur de pression avec de l&#39;éthanol et de l&#39;éthanol à assembler nettoyé disques de rupture. Visser le diviseur de pression assemblés et des disques de rupture dans la chambre de bombardement. </li><li> Assembler un écran d&#39;arrêt à l&#39;autoclave avec le support de macrosupport et placer l&#39;appareil sur le plateau de métal nécessaire et verrouillage en place. </li><li> Insérez le macr assembléAppareil ocarrier dans la chambre biolistique dans l&#39;emplacement alloué au-dessous du diviseur de pression et de s&#39;aligner avec le diviseur de pression. </li><li> Collez la plaque NGM ouvert avec les vers sur le plateau de plaque cible et fermer la porte de la chambre. </li><li> Pour bombarder vers, ajuster la pression de ce qui est nécessaire pour casser les disques de rupture. Allumez le vide à 28 pouces de Hg, puis appuyez sur le bouton de tir jusqu&#39;à ce que les disques se rompent. </li><li> Relâchez le vide et retirer la plaque NGM de l&#39;appareil. Laver les vers de la plaque et de les redistribuer dans vingt dix plaques cm de NGM ensemencées avec JM109 E. coli (figure 3-4). </li><li> Autoriser les vers de se développer pendant 10 à 14 jours à 25 ° C et mourir de faim les plaques. Worms sauvés du défaut unc-119 auront mouvement normal et peuvent être identifiées à ce moment. Choisissez au moins 10 vers &quot;de type sauvage&quot; de plaques séparées pour une analyse plus approfondie que celles-ci représentent des lignées transgéniques indépendantes (Figure 5.3). </li></ol></li></ol>

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	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent il n&#39;y a aucun intérêt ou conflit d&#39;intérêts financiers concurrents.

Dans ce protocole, nous présentons une mCeHR liquide axénique modifié médiatique qui permet rapide C. génération elegans avec production d&#39;un grand nombre de vers. Ce support présente plusieurs avantages que les vers sont cultivés sans contaminer E. coli ou des sous-produits bactériens et peuvent être exploitées dans les études nutritionnelles et toxicologiques. L&#39;utilisation de E. coli ou d&#39;autres bactéries dans ces études a plusieurs inconvénients. Par exe...

Le nématode du sol, Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle puissant utilisé dans de nombreuses études de la génétique à la toxicologie. En raison de sa taille de 1 mm, le temps de génération rapide de quatre jours, de facilité de culture, et un grand nombre de descendants, ces nématodes ont été utilisés dans un certain nombre de cribles génétiques et pharmacologiques 1, 2. Les chercheurs profitent de ce ver à identifier les molécules et les voies conservés dans les systèmes vertébrés. Ces voies comprennent des signaux de mort cellulaire, les voies de vieillissement et de métabolisme et du système nerveux 6.3. En outre, la transparence de C. elegans permet la génération de lignées transgéniques en utilisant des protéines reporters fluorescents, qui peuvent être visualisées directement pour analyser les modèles d&#39;expression génique et la localisation des protéines. Dans de nombreuses études ce nématode est cultivée sur une surface à base d&#39;agar-solide en utilisant un milieu de croissance de nématodes (NGM) ou de plaques dans liquid cultures ensemencées avec Escherichia coli en tant que source d&#39;alimentation 7,8. Ces sources alimentaires bactériennes peuvent confondre les études biochimiques et toxicologiques avec l&#39;interférence de sous-produits bactériens qui affectent l&#39;interprétation des résultats. Afin d&#39;éviter ces effets combinés, C. elegans peuvent être cultivées dans un milieu liquide axéniques qui est dépourvu de bactéries en tant que source de nourriture. L&#39;utilisation de ce média, nous avons cultivé avec succès des millions de vers très synchronisées pour beaucoup norme C. protocoles elegans, y compris l&#39;analyse des microréseaux de gènes régulés de manière différentielle dans C. elegans exposée à différentes concentrations d&#39;hème, et la production des vers transgéniques en utilisant un bombardement de gène. Ce support est chimiquement défini et modifié à partir d&#39;une recette originale formulée par le Dr Eric Clegg 9. L&#39;utilisation de ce média mCeHR, nous avons réussi à identifier les gènes impliqués dans l&#39;homéostasie de l&#39;hème, parlé à des gènes sensibles comme l&#39;hème (hrg s) 10, ce qui seraitont pas été possible dans des conditions de croissance réguliers qui utilisent des plaques de gélose NGM ensemencé avec E. coli. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour l&#39;introduction et le maintien C. elegans cultivés sur E. coli à la mCeHR axénique et d&#39;utiliser cette méthode pour obtenir un grand nombre de vers de production transgénique C. lignes elegans utilisant un bombardement de microparticules. Nous avons également des études actuelles qui montrent l&#39;utilité de l&#39;utilisation des médias axéniques pour déterminer les besoins nutritionnels de C. elegans en utilisant, par exemple, l&#39;hème. Ces études montrent que l&#39;utilisation de supports mCeHR permet une croissance rapide d&#39;un grand nombre de C. elegans pour de nombreuses applications en aval utilisés par les chercheurs de vers.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

Dans ce protocole, nous présentons les matériaux nécessaires, et la procédure de mise C modifié. Legans e habituation et de reproduction médias (mCeHR). En outre, les étapes de l&#39;exposition et l&#39;acclimatation C. elegans cultivés sur E. coli à axéniques milieux liquides sont décrits. Enfin, des expériences en aval qui utilisent axénique C. elegans illustrent les avantages de cette procédure. La capacité d&#39;analyser et de déterminer C. besoins nutritionnels elegans a été illustrée par la croissance N2 vers de type sauvage dans des milieux liquides axéniques avec des concentrations variables de l&#39;hème. Cette procédure peut être reproduit avec d&#39;autres substances nutritives afin de déterminer la concentration optimale pour la croissance et le développement de la vis sans fin ou, pour déterminer les effets toxicologiques des traitements médicamenteux. Les effets des concentrations d&#39;hème variées sur la croissance des vers de type sauvage ont été déterminés par l&#39;observation microscopique qualitative et en quantifiant til nombre de vers qui poussaient dans chaque concentration de l&#39;hème. En outre, l&#39;effet des concentrations de nutriments variés peut être testée en utilisant des vers qui expriment capteurs fluorescents qui répondent à l&#39;évolution du nutriment d&#39;intérêt. En outre, un grand nombre de vers de terre ont été facilement réalisée pour la génération de C. elegans transgéniques en utilisant un bombardement de microparticules.

La culture de C. elegans dans axéniques aides milieu liquide dans la détermination des éléments nutritifs qui sont requis par les vers, sans ingérence des métabolites secondaires produits par E. coli. Vers de type sauvage N2 s&#39;acclimater aux médias mCeHR dans les trois générations et montrent une croissance comparable à des vers adultes sur des plaques bactériennes NGM. En effet, ces vers deviennent gravides dans les 4 jours que comparativement à 3,5 jours pour les vers adultes sur les ...

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d&#39;applications en aval.

Culture<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En Axenic Liquid Media et création d&#39;transgéniques Worms par bombardement de microparticules

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.8K vues.  University of Maryland.  C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval. 

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Recherche

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

L&#39;isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un criblables<em&gt; In Vivo</em&gt; Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

la culture de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En trois dimensions dans le laboratoire

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...