This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

NOT: Lab Güvenlik Endişeleri Standart laboratuvar iyi uygulamalar doğrultusunda, aşağıdaki gözlemlemek. Uygun yerlerde bütün organik çözücüler saklayın. Kimyasal bileşimleri açık etiketleme ile kimyasal atık kaplarda tüm atık malzemelerini saklayın. Bu protokollerde kullanılan çeşitli reaktifler gibi potansiyel kanserojen veya, uçucu yanıcı gazlar oluşturur havalandırma ile bir davlumbaz tüm reaktifler anlaştım. Organik çözücüler ile çalışırken eldiven, laboratuvar önlüğü, ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> -Jel O-Glikomik 1. Prosedürü Şekil. Çevrede bulunan (A), proteinler, uygun boyama prosedürleri (Coomassie ya da gümüş) tarafından tespit edilen, SDS-PAGE ile çözülmüş ve çıkarılır. Kesilen jel adet dilimlenmişküçük küpler halinde, boyası, ve daha sonra MS analizi müdahale kirletici maddeleri azaltmak için etil asetat ile yıkanmıştır. Jel diliminin bir kısmı LC-MS / MS ile-jel triptik sindirime ve ardından proteomik karakterizasyon için rezerve edilebilir. (B) O-bağlantılı glıkanlar-jel indirgeyici β-eliminasyonu ile çözüldü glikoproteinlerin salınır. Başlıca adımlar tuz giderme ve metanol ile azeotrop borat gidermeyi içerir. Permetilatlı ve daha sonra, sulu ve organik faz halinde bölünmüştür (C) indirgeyici β-gidermede glikanları O-bağlıdır. Sulfoglycans kantitatif olarak, üst (sulu) faz içinde geri kazanıldığı alt (DCM), bir tabaka halinde nötr ve siyalilleştirilmiş glıkanlar bölümü ise. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> -Jel Glikomik için Şekil 2. Detay akış şeması. Her experimenŞekil 1 &#39;de gösterilen Tal adımı ayrı ayrı gösterilmektedir. (A) jel destaining ve EtOAc çıkarma, (B) jel indirgeyici O bağlantılı glıkan serbest bırakılması için β-eliminasyon, ve doğrudan (C) permethylation ve faz bölüm. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1. Jel Eksizyon ve Jel-türetilmiş Kontaminantların Kaldırma <ol><li> Işlemine başlamadan önce, Malzeme Listesi&#39;nde yer kimyasallar ve reaktifler hazırlamak. </li><li> Standart Tris-Glisin tampon sistemleri kullanarak, SDS-PAGE jeli üzerinde protein giderin. Leke CBB veya Gümüş Boyası ile ya proteinleri çözüldü. Genel olarak, gümüş lekeli jeller, O-bağlantılı glıkanların geri Coomassie ulaşılan kurtarma yaklaşık% 80-90 jelleri lekelendi. </li><li> Elektroforezisten sonra, bir cam levha ve tüketim t jel yerleştirintemiz bir neşter veya ustura kullanılarak ilgi o bölge. </li><li> O-glıkanların verimini artırmak bir cam levha üzerine, ilgi konusu jel bant transferi ve yaklaşık olarak 2 mm küpler halinde kesilerek çıkarılmış jel parçasını kesmek için. Glıkan iyileşme azalır çünkü Jel parçacıkları 1 mm&#39;den küçük küpler kaçının. Paslanmaz çelik microspatula ile Üstü yivli bir cam tüp (13 x 100 mm) içine küçük jel parçaları aktarın. </li><li> Örnek tüpü 25 mM amonyum bikarbonat (AMBIC, 3 NH 4 HCO) 1 ml, Teflon kaplı vidalı üst kapağı ile cam tüp kap ekleyin ve yavaşça 10 dakika bekledikten önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları müthiş önlemek için güçlü bir ajitasyon istihdam etmeyin. </li><li> Dikkatle Pasteur cam pipet veya ekstra-uzun plastik ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak cam tüp AMBIC çıkarın. Çökertilmesi ve AMBIC çözüm çıkarırken küçük jel parçaları transfer kaçının. </li><li> Asetonitril (ACN) 1 ml ekleyincam tüp, kap, ve yavaşça 10 dakika standı icar önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları tamamen solvent ile kaplıdır emin olun. Gerekirse, tüp duvar kapalı ve pipet ile çözücü içine jel parçaları itin. </li><li> Cam tüpten ACN Pipet ve parlak mavi renk kaybolana kadar tekrarlayın 1,5-1,7 adımları. Gerekirse, beş ardışık AMBIC / ACN yıkama az tekrarlayın. Gümüş lekeli jeller için, bir destain kiti kullanın. Jel parça ACN muntazam beyaz süre döndüğünde bir sonraki adıma geçin. </li><li> , Cam tüp herhangi bir sıvıyı pipetle tüp Özetlemek, AMBIC 1 ml ekleyin ve 5 dakika bekletin. </li><li> AMBIC çıkarın ve cam boru, etil asetat (EtOAc), 2 ml ilave ediniz. Alternatif ucu-üzerinde-uç çalkalama ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Teflon kaplı bir kapakla ve yer ile Özeti tüpü 30 dakika her biri için, oda sıcaklığında üç kez EtOAc ile yıkanarak gerçekleştirin. Daha EtOAc yıkaması, kirleticilerin daha etkili kaldırılması. </li><li> KaldırSon EtOAc yıkama ve H2O, 2 ml ile üç yıkama her birini yerine EtOAc&#39;nin komple kaldırma sağlam indirgeyici β-eliminasyon reaksiyonu sağlayacaktır. </li><li> H2O Pipet ve ACN&#39;den 1 ml ile bir kez yıkanarak jel dihidrat. Not: Kurutma işleminden sonra, susuz jeller-jel β-ortadan kaldırılması için hazırdır. Susuz Jel parçaları, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Bağımsız olarak jele tatbik edildiği geçici bellek ya da çözelti, herhangi bir aşamada yıkama işlemini durdurmak ve gece boyunca 4 ° C&#39;de jel parçaları saklamak (AMBIC, ACN, H2O). Önümüzdeki 2 gün içinde her zaman örnek hazırlama yeniden başlatın. </li><li> Standart proteomik yaklaşımlar ile protein kimliği destained ve susuz jel parçaları bir kısmını kullanın. </li></ol> Indirgeyici β-Eliminasyon 2. In-jel O-glukanıdır Yayın <ol><li> Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de% 50 NaOH veya katı NaOH ve mağaza ile 1 M sodyum hidroksit (NaOH) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. <ol&gt; <li> % 50 NaOH (ya da katı NaOH 4 g) ihtiva eden 5.2 ml alın ve 1 M NaOH solüsyonu yapmak üzere, 100 ml hacim ayarlayın. İndirgeyici β-eliminasyon reaksiyonları etkinlik kaybı olmaksızın 6 aya kadar 4 ° C&#39;de saklanabilir 100 mM NaOH, ile, 1 M NaOH stok çözeltisi ile seyreltilir. </li></ol></li><li> 100 mM NaOH içinde 2 M sodyum borohidrid (NaBH4) konur. 100 mM NaOH, 0.5 ml, NaBH4 38 mg eritin. Genel olarak, her bir örnek için borohidrür çözeltisi 0.5-1.0 ml kullanmak. Aşama 1 &#39;de hazırlanan kurutuldu jel parçalarının miktarına reaksiyon çözeltisinin hacmi 1-2 kesilmiş jel parçalarının (adım 1.3) için borohidrür çözeltisi 0.5 mi kullanmak için beklemek değişir. </li><li> Hidratı giderilmiş jel parçaları, 100 mM NaOH, 500 ul ilave edin ve glıkan geri kazanımını artırmak bazik koşullar için jel dengeye getirilmesi amacıyla, buz üzerinde 3-5 dakika boyunca bekletin. </li><li> 1 M NaBH nihai konsantrasyonlarda elde edilen, 100 mM NaOH içinde 2 M, NaBH4 500 ul ekle <sub100 mM NaOH&gt; 4. Tüpü yavaşça karıştırın ve 18 saat 45 ° C&#39;de inkübe edin. <ol><li> İnkübasyonun ilk saat esnasında, hafifçe tüpün her 15 dakikada karıştırılır. Bu jel parçaları parçalanabilir, çünkü güçlü ajitasyon kaçının. Iyi dengelenmiş bir inkübatör / fırın ya da bir ısıtma bloğu içinde, reaksiyonun gerçekleştirilmesi. Jel parçacıkları, reaksiyon çözeltisi ile kaplanmıştır emin olun. </li></ol></li><li> Kuluçka veya ısıtma bloğundan numune tüpü kaldırma ve buz üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun. Not: β-eliminasyon reaksiyonu 18 saat ilerlemesine izin verdikten sonra, tuz giderme işlemi, aynı gün içinde gerçekleştirilmelidir. </li></ol> Katyon değişimli kromatografi ile 3. Tuzdan arındırma <ol><li> Buz üzerinde numune tüpü muhafaza aşırı ısı oluşumunu önlemek için de, yavaş yavaş baz nötralize etmek için% 10 asetik asit (AcOH) damla damla ilave edildi. Yavaşça AcOH&#39;nin eklemeler arasında numune tüpü vorteks. Yavaş yavaş asit eklemek için dikkatli olun ve Additi gibi damla damlaasit kabarcıkların bir &quot;volkan&quot; üretecek. Gerekirse, kabarcıklar ortadan kaldırmak ve sonra akışının önlenmesi için tüp santrifüjleyin. <ol><li> Reaksiyon karışımı içinde sodyum büyük miktarda ortadan kaldırmak için, küçük bir katyon-değiştirme sütunundan (Dowex veya Ag-50W-X8 reçine H + biçimi) içinden, reaksiyon karışımına geçmesi. </li><li> 1 M NaOH ile katyon değiştirme reçinesi yıkayın 1 M HCI reçine, analitik sınıftadır olsa bile, MS analizi müdahale işleme kirleticileri çıkarmak amacıyla kullanılmadan önce. </li><li> 1 M NaOH içinde reçine daldırın ve kaptan kaba aktarma ile uzaklaştırın. Daha sonra 1 M HCI ekleme, su çıkarmak, de-iyonize edilmiş su ilave edilir. </li></ol></li><li> Reçine Yukarıdaki çözelti renksiz olana kadar bu adımları tekrarlayın. 4 ° C&#39;de% 5 AcOH deiyonize su ve mağaza ile temizlenmiş reçine yıkayın. </li><li> Küçük bir cam kolon, çizik ve pipet konik yaklaşık 1 cm uzunluğunda böylece seramik kesici kullanılarak Pasteur cam pipet ucu kırmak için. Cam yünü, bir fiş ayrı kadar dalga ve reçine, yatak için bir destek oluşturan ucuna doğru itin. Bir cam test tüpü üzerinde bir kelepçe veya clothespin ve yer ile pipet sütun sabitleyin. </li><li> 1 ml metanol (MeOH) ve 3 ml% 5 AcOH ile boş pipet yıkayın. Girdap H +, Dowex ya AG50 katyon değiştirme reçine cıvık çamuru% 5 AcOH içinde depolanır ve bir Pasteur pipeti sütununda bir 1 ml yatak hacmi elde etmek için bulamacın yeterli aktarın. </li><li> % 5 AcOH beş hacim kullanılarak sütun durulayın. Reçine parçacıkları bir görünüm için içinden akar ve reçine algılanırsa, sütun kullanmayın edin. </li><li> Yeni bir vidalı kapaklı cam borunun (16 x 125 mm) ve yük numune üzerinde sütun. Yoluyla akışı toplamak ve aynı tüp içine,% 5 AcOH en az 3 hacim glikanları elüte. </li><li> Parafilm ile tüp örtün ve bir iğne ile küçük bir delik açmak. -80 ° C&#39;de ya da kuru buz üzerinde numune tüpü yerleştirin. Dondurulmuş sonra liyofilizasyon ile örnek kurutun. -20 ° &#39;de kurutuldu, malzemenin saklayınKullanılana kadar ° C. </li></ol> 4. Borat Kaldırma <ol><li> MeOH içinde% 10 AcOH hazırlayın. Buzlu asetik asit, 10 ml alın ve metanol ile, 100 ml hacim ayarlayın. 6 aya kadar Teflon-kaplı bir kapakla bir cam şişe içerisinde, bu reaktif saklayın. </li><li> Kurutulmuş, liyofilize örnek tüpü ve girdaba MeOH içinde% 10 AcOH 300 ul ekle. Bir N2 akımı altında buharlaştırma ile elde edilen trimetil borat çıkarın. Not: asidik koşullar altında, metanol ile borat tuzları karıştırma, uçucu bir bileşik olup, trimetil borat üretir. </li><li> 37 ° C de N2 akımı altında kurutulur. Aşama 4.2 de tarif edildiği gibi kurutma işleminden sonra, MeOH içerisinde AcOH ayrı bir bölüntüsünün ilave edin. Nitrojen altında, 5 dakika (N2) altında, 37 ° C&#39;de akışı için sıvıyı kurutun. <ol><li> Tekrar yeniden süspansiyon, kurutma en az 3 kez. Kullanılana kadar -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın. </li></ol></li></ol> 5. C18 Temizlik-up <ol><li> Bir C18 kartuşu kolonu dengeyeACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim ile (boyut 1 mi, 100 mg reçine). Hafif pozitif hava basıncı uygulanması ile dengeye çözümlerin geçişini hızlandırmak. </li><li> Tuzdan arındırılmış ve borat-ücretsiz numune tüpüne% 5 AcOH&#39;nin 500 ul ekleyin ve girdap tarafından çözülür. </li><li> Dengelenmiş C18 kolonu üzerine yeniden süspansiyon haline getirildi örnek yükleyin ve bir cam vidalı somunlu bir tüpe (13 x 100 mm) içine doğru akışını toplamak. Zehir, O-glıkanlar, aynı tüp içine,% 5 AcOH 3 ml. </li><li> , Tüp parafilm küçük bir iğne ile küçük delikler yapmak veya tüp kapağı gevşek kapalı PTFE-kaplı tapa kullanın ve -80 ° C&#39;de veya kuru buz üzerinde örnek dondurmak. Liyofilizasyon ile ayrılması için kullanılabilir. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de kurutuldu örnek saklayın. </li></ol> Permethylation 6. Taban hazırlanması NOT: sağlam permethylation ulaşmak NaOH bulamaç taze hazırlamak için. Permethylation reaksiyonları için kullanılan bütün cam yaygın temizlenmelidir. <ol><li> , Permethylation için temel reaktif hazırlamak temiz bir cam vidalı kapaklı bir tüp (13 x 100 mm),% 50 NaOH, 400 ul ekleyin. Susuz MeOH ve girdap 800 ul ekleyin. </li><li> Ve beyaz bir çökelti oluşturmak üzere susuz dimetil sülfoksit (DMSO) ve vorteks 4 ml ilave edilir. </li><li> Çökeltiyi pellet haline getirmek üzere, 1 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant Pipet ve atın. Pelet susuz DMSO içerisinde fazladan bir 4 ml ilave edilir. Vortex. </li><li> Adımı yineleyin 6.2 ve üç kez ya da hiç beyaz çökelti oluşana kadar 6.3 minimum. </li><li> 3 mi susuz DMSO içinde topak taban çözülür ve yavaşça temiz bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. </li><li> Depolanan olamaz gibi aşağıdaki permethylation reaksiyon için hemen tabanını kullanın. </li></ol> Çıkış glıkanların 7. Permethylation <ol><li> C18 arıtıldı numunesi ve girdap veya süspansiyon haline getirmek için sonikasyon susuz DMSO içerisinde 200 ul ekle. </li><li> Resusp 300 ul ekleörnek uçlu taban bulamaç hemen iyodometan 100 ul (Mel) ekleyin. Teflon astarlı kapakla boru mühürleyin ve kuvvetli bir şekilde girdap 5 dakika için karıştırın. </li><li> , Permethylation reaksiyonu durdurmak buz ve vorteks% 5 AcOH&#39;nin 2 ml ekleyin. Pipet çözüm yukarı ve aşağı 5 kat buharlaşma ile Mel kalan hacmini azaltmak için. NOT: AcOH solüsyonu nötralize ve Mel çıkarılması faz-bölme sırasında su fazına sülfatlanmış glıkanların ekstraksiyon verimini artırır. </li><li> Diklorometan (DCM) ve vorteks 2 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj sulu ve organik fazlar ayrıldı. </li><li> Yeni bir cam boru (13 x 100 mm) içine üst tabaka (permetilatlı sülfatlanmış glıkanların çoğunluğu içeren sulu faz) aktarın. </li><li> Organik faz ve vorteks H2O 2 ml ilave edilir. 600 x 1 dakika süreyle santrifüj, sulu ve organik fazların ayrılması ve köknar ile ikinci bir sulu faz birleştirmekst sulu faz (aşama 7.5). </li><li> Adımı tekrar 7.6 ile 7.5 üç defa daha, fakat daha sonraki bölümlerinde ortaya çıkan sulu faz kaydetmek için bir ihtiyaç vardır. </li><li> Alt tabaka (organik faz) mümkün olduğu kadar nihai üst tabaka (sulu faz) çıkarın ve temiz bir Pasteur pipeti kullanılarak, ayrı yeni bir cam tüp içine alt katman (organik faz) aktarın. </li><li> 42 ° C de N2 akımı altında, organik faz kurutun. </li><li> Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de Parafilm ile tüp ve mağaza örtün. </li></ol> Sulu Faz permetilatlı Sülfatlanmış O-glıkanların 8. C18 Temizleme <ol><li> ACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim bir C18 kartuşu kolonu dengeye getirin. </li><li> Toplanmış ve adımlar kolona 7.5 ve 7.6 kombine sulu fazlar yükleyin. </li><li> Duyunun tuzunun giderilmesi amacıyla H2O ile 10 ml sütun yıkayın. </li><li> Zehir permetilatlı sülfatlanmış 2 ml yeni bir cam tüp içine, O-glıkanlar% 50 ACN. Daha büyük oligosakaritlerde permetilatlı sülfatlanmış O-glıkanların geri kazanımını artırmak için% 85 ACN ile ek bir elüsyon kullanın. </li><li> 42 ° C&#39;de, azot akımı altında kuru yıkama sıvıları. </li><li> MS analizi öncesinde 6 ay -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın. </li></ol> Permetilatlı O-glıkanların 9. Kütle Spektrometre <ol><li> 210 ° C sıcaklıkta kılcal 0,40-0,60 ul / dakikalık bir şırınga akış oranında bir nanoelectrospray kaynağı kullanılarak uygun bir kütle spektrometresi içine doğrudan infüzyon ile permetilatlı O-glikanlar analiz edin. MS / MS ve bir iyon tuzağı enstrüman MS n CID tarafından parçalanma,% 30-40 çarpışma enerjisini geçerlidir. </li><li> Negatif iyon kipi için, yeniden yapılandırmak permetilatlı sülfatlı, O-glıkanlar, metanol / 2-propanol / 1-propanol, 50 ul / 13 mM sulu amonyum asetat (16: 3: 3: 2 hacim itibarı ile). Pozitif iyon modu için, 1 mM sodyum hidro 50 ul / nötr siyalilleştirilmiş O-glikanlar permetilatlı tekrar oluşturmakmetanol / su içinde xide (1: 1). </li><li> Bireysel O-glıkan yapılara 13,19 karakterize etmek MSn analiz için Xcalibur yazılım paketi sürüm 2.0 toplam iyon eşleme (TİM) ve nötr kayıp tarama (NL tarama) işlevini kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+roles+of+oligosaccharides:+all+of+the+theories+are+correct.">Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct.</a> Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease.">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li><li>Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+protein+glycosylation:+diversity,+synthesis+and+function.">Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).</li><li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function.">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).</li><li>Yan, A., Lennarz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+mechanism+of+protein+N-glycosylation.">Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).</li><li>Washburn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilisation+of+proteomics+datasets+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology+(MudPIT).">Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT).</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).</li><li>Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+of+proteins+for+internal+sequence+analysis+after+one-+or+two-dimensional+gel+electrophoresis.">In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).</li><li>Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+an+'In-Gel'+digestion+procedure+for+the+micropreparation+of+internal+protein+fragments+for+amino+acid+sequencing.">Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing.</a> Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).</li><li>Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mass+spectrometry+for+the+proteomic+analysis+of+glycosylation.">The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation.</a> Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).</li><li>Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+glycosylated+interferon-gamma+variants+separated+by+gel+electrophoresis.">Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).</li><li>Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+N-linked+oligosaccharides+directly+from+protein+gels:+in-gel+deglycosylation+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+and+normal-phase+high-performance+liquid+chromatography.">Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).</li><li>Kuster, B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O-labeling+of+N-glycosylation+sites+to+improve+the+identification+of+gel-separated+glycoproteins+using+peptide+mass+mapping+and+database+searching.">18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching.</a> Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).</li><li>Aoki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+O-linked+glycans+expressed+during+Drosophila+melanogaster+development+reflects+stage-+and+tissue-specific+requirements+for+cell+signaling.">The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).</li><li>Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+peeling+during+the+release+of+O-glycans+by+hydrazinolysis.">Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis.</a> Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).</li><li>Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+analysis+of+O-linked+oligosaccharides+from+glycoproteins+and+mucins+separated+by+gel+electrophoresis.">Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis.</a> Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).</li><li>Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5B+glycosylation+in+human+saliva+reflects+blood+group+and+secretor+status.">MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status.</a> Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).</li><li>Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+O-linked+glycans+released+directly+from+glycoproteins+in+gels+using+in-gel+reductive+&#946;-elimination.">Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive &#946;-elimination.</a> Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).</li><li>Anumula, K. R., Taylor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+procedure+for+preparation+of+partially+methylated+alditol+acetates+from+glycoprotein+carbohydrates.">A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates.</a> Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).</li><li>Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo.">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates.">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

Glikosilasyon organizma fizyoloji, doku patolojisi ve hücre tanıma 1-3 katkıda bir esas teşkil eden protein translasyon sonrası değişiklik. Analitik Glycoscience büyük ilerlemelere rağmen, belirli bir protein glıkanların tam çeşitliliği tanımlamak özellikle temel biyolojik kaynaklardan izole edilmiş protein ile ilgili olarak, son derece zorlu bir iştir. Bununla birlikte, glikoprotein glıkanların mikroheterojenlik sıklıkla diğer proteinler ile fonksiyonel etkileşimlerin etkiler. Bu nedenle, glıkan çeşitlilik karakterizasyonu hücre ve doku glikosilasyon 4,5 &#39;fizyolojik önemini anlamak için gereklidir. Doku fizyoloji ve patofizyoloji, sağlam, hassas ve kapsamlı glycomic analitik teknikleri glikoprotein glycosylation&#39;nin katkılarını anlamak için giderek daha önemli hale gelmiştir. Proteomik analizde, protein, teşhisi genellikle LC-MS ile elde edilir/ Triptik peptitler 6 MS analizi. Protein sindirimi gibi 7-9, tripsin gibi proteazlar ile jel yumuşatıldıktan sonra, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş saflaştırılmış bir protein ya da proteinleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. SDS-PAGE ile protein karışımı Önzenginleştirme proteini numarası derinliğini ve doğruluğunu arttırır. Glikoprotein Glikosillenmenin glycomic analizi için benzer stratejilerin geliştirilmesi Glycoscience ön planda yer alır. Glıkanların iki ana sınıfı, N-bağ ya da O-bağlantısı yoluyla ya proteini omurgalarına bağlanır. N-bağlantılı glikanları asparagin bağlıdırlar (Asn), Asn-X-Ser / Thr / Cys olarak tanımlanan bir sequon kapsamında bulunan tortular (X, prolin dışında herhangi bir amino asittir) ve peptit N ile enzimatik sindirme ile serbest bırakılabilir -glycanase (PNGaseF veya A), ya da çözelti içinde,-jel ya da açık-blot 10-12. O-bağlantılı glıkanlar, esas olarak serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntılarına eklenir. Ancak, sadece bir enzim iden edilmiştirglikoproteinin, O-bağlantılı glikanları salabilen ve sadece basit O-bağlantılı glikanlar salan, son derece sınırlı bir glıkan özgüllüğe sahiptir giderilene. Chemical Release stratejileri glikoproteinlerden O-bağlantılı glıkanların kapsamlı serbest bırakılması için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Indirgeyici ya da indirgeyici olmayan β-kaldırılması veya hidrazinolize İyi karakterize edilmiş kimyasal tahliye etme teknikleri ve glikoproteinlerin 13,14, O-bağlantılı glikanları salınması için en yaygın olarak kullanılan tedavi alanında bulunmaktadır. İndirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinlerden O-bağlantılı glikanlar serbest bırakmak için kullanılmış olmasına rağmen, daha önceki yaklaşımlar sonraki analiz 15-17 HPLC ayırma gereklidir. Çok Boyutlu MS (MS n) analizi şu anda en çok biyolojik kaynaklardan beklenen miktarlarda izole glikoproteinlerden serbest glikanları karakterize yapısal verilerin zengin kaynağı sağlar. MS derinliğimerkezli bir yapısal karakterizasyon büyük ölçüde önce analizleri için salınan glikanlar permethylating ile kolaylaştırılır. Permethylation iyonizasyon artırır ve glıkan yapıları 18,19 geniş bir aralığı boyunca mol sinyal tepkilerinin eşitlemeye çalışır. Buna ek olarak, permethylation açıkça böylece yapısal açıklanmasını 20-23 arttırıcı özgü kitleler terminal ve yer değiştirmiş monosakkarit kısımları, etiketler. Örneğin, asidik glıkanlar MS non-permetilatlı türler olarak tespit etmek için, genellikle zordur. Asidik glıkanlar MS ile de negatif iyon modunda tespit edilebilir, ancak, aynı iyon modunda hem asidik hem de nötr glikanların, tespit etmek mümkün değildir. Glıkan permethylation önemli bir avantajı, permetilatlı bir glıkan en monosakarit ikame üzerindeki serbest hidroksil gruplarının (OH) her bunları tespit yapmak, bir metil grubu (OCH3 ya da OMe), bu şekilde sialilatlı bir glıkan ücretlerini nötrleştirilir başlıklı hale olmasıdır nötr (asyalo) glıkanlar. Bununla birlikte, sulfoglycans sülfatlanmıştır kısımların hidroksil iyonizasyonunu ve hassasiyetini azaltır anyonik şarj, retansiyonu ile sonuçlanır permethylation dayanıklıdır. Bu bastırma anda sülfatlı glikanların 24-26 yüksek bir bereket taşımak gibi müsinlerin gibi çok karmaşık glikoproteinler, kapsamlı glycomic analizini önler. Arındırıcı sülfatlı Glikanların dair son raporlar ters-faz saflaştırmak için kromatografi ve MALDI analizden önce ayrı permetilatlı glikanlar, ücret kullanılmıştır. Bu yöntem, organik faz bölümleme daha az kesin olarak bulduk, elüsyon için farklı mobil fazlar kullanılarak sülfatlı ve sülfatlı olmayan glıkanların tamamen ayrılmasına dayanır. Bu nedenle, sulfoglycans saptanması ve zenginleştirilmesi için uygun olan yeni bir teknik burada sunulmuştur. Bu teknikler, su ardından sulu faz içinde sülfatlanmış glıkanların kantitatif iyileşme sağlar: DCM (diklorometan)rutin glıkan permethylation reaksiyonlar 27 sonunda gerçekleştirilir ekstraksiyon. Ayrıca, MS 2 parçalanma desen basitleştirirken Önemli olarak, permetilatlı sülfatlanmamış glıkanların karışımından permetilatlı sulfoglycans bu sağlam ayrılması eş zamanlı olarak yüklü türler için zenginleştirir. Geliştirilmiş-jel O-bağlantılı glıkan analizi için kapsamlı bir protokol de sunulmuştur. Geliştirilmiş protokol, glıkan iyileşmeye katkıda MS ile elde edilebilen N permetilatlı glikanların analiz yapısal bilgi arttırır, ve biyolojik kaynaklardan izole edilmiş temel glikoproteinlerine uygulanan sulfoglycomic analiz duyarlılığını arttırır. Bu protokol, tüm glikoprotein özleri O-bağlantılı glıkan analizi ya da SDS-PAGE ile çözülmüş, ilgilenilen belirli bir glikoproteini amaçlanmıştır üç deney prosedürleri oluşmaktadır; A) jel temizlik, B) jel indirgeyici β-eliminasyon, ve C) glukanıdır permethylation. Amaç, biyolojik açıdan ilgi (Şekil 1), başlıca kaynaklarından hasat glikoproteinler için kapsamlı bir O-bağlantılı glycomic verileri elde etmektir. SDS-PAGE ile ayrılmış Glikoproteinler boyama ve ilgili bantlar kesilir ve elde edilen jel bant küçük parçalar halinde dilimlenir tarafından görüntülenmiştir. Jel parçaları boyası ve jel kirletici maddelerin (Şekil 2A) ortadan kaldırılması için etil asetat yıkamaya tabi tutulur. Glikan serbest-jel indirgeyici β-eliminasyon (Şekil 2B) ile elde edilir ve salınan glikanlar permetilatlı edilir. Sulu organik ekstraksiyon takip permethylation kantitatif uzaklıkta, sülfatlı olmayan nötr glikanların (Şekil 2C) için anyonik sülfatlanmış glikanları böler. -Jel sulu-organik ekstre bağlanmış indirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinin küçük miktarlarda serbest O-bağlantılı glıkanların ve sulfoglycans karakterizasyonu sağlar. Stratejik bakış hülâsa ​​olduğunuŞekil 1 ve ayrıntılarda kanşımının, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Buna ek olarak, boyası ile yıkandı, jel parçalarının bir kısmı, standart bir LC-MS / MS teknikleri proteomik protein numarası için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

In-jel İndirgemeli β-Eleme Etil Asetat Tedavisinin Etkisi önce -Jel indirgeyici β-eleme kullanarak müsin sığır serbest permetilatlı O-bağlantılı glıkan numune temsili kütle spektrumu, Şekil 3 de gösterilmiştir. Jel parçalarının EtOAc yıkama etkin bir sonraki MS analizi 27 müdahale SDS içinde ve poliakril kirletici maddeleri ortadan kaldırır. <img alt="Şekil...

Watch this Scientific Journal Video about Improved In-gel Reductive Î²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry at JoVE.com

Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

improved-gel-reductive-elimination-for-comprehensive-o-linked-sulfo

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Unit 1

Nucleophilic Substitution and Elimination Reactions of Alkyl Halides

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Görüntüleme.  University of Georgia.   

Video: Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Kimya

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

Elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi ile Dicysteinyl tetrapeptidlerle ile Merkür (II) kompleksinin Bir Çalışma

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Kümelenme Sonucu Desorpsiyon/İyonlaşma Kütle Spektrometresi Yoluyla Karmaşık Moleküllerin ve Yüzeylerdeki Reaksiyonlarının Analizi

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...