Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids at JoVE.com

Yazarlar Bay Michael Connolly ve Dr. Ronald Zuckermann (moleküler dökümhane, Lawrence Berkeley National Laboratory) peptoid sentez teknik desteği için teşekkür etmek istiyorum. Ulusal Bilim Vakfı (CHE-1301505) desteğinden anıyoruz. Tüm kütle spektrometresi deneyler Pasifik Üniversitesi'nde kimya kütle spektrometresi tesisinde yapılmıştır.

1. Peptoid sentezi
Not: Bir sentez reçine şişme ve koruma grubunu kaldırarak reçine etkinleştirme ile başlar. Bu yinelenen monomer ek döngüler aracılığıyla reçine üzerine peptoid zinciri büyüyen tarafından takip ediyor. Reçine birleştiğinde ilk monomer C-terminal kalıntı olduğunu. Peptoid C-terminus N-terminus için uzamış. İstenen peptoid sıra elde sonra reçine kapalı i ciddi ve peptoid ürün arıtılmış.
<ol><li>Reaktifler hazırlanması Not: Bir micropipette kullanarak sıvı reaktifler ölçülür ve katı reaktifler bir analitik denge kullanılarak ölçülür.<ol>
<li>N, N 6.2 mL karışımı '-diisopropylcarbodiimide (DIC) ve 43.8 mL n, N-dimethylformamide (DMF) 0, 8 M DIC/DMF çözüm hazırlamak için.</li>
		<li>BMA 5.56 g 0.8 M BMA/DMF çözüm hazırlamak için DMF 50.0 mL içine geçiyoruz.</li>
		<li>2 mL Piperodin (PIP) ve % 20 Pip/DMF çözümü elde etmek DMF 8 mL karıştırın.</li>
		<li>Npe 1,9 mL 1.0 ulaşmak için DMF 13.1 mL içine dissolve M Npe/DMF.</li>
		<li>Nme 1.3 mL 13,7 mL DMF 1.0 ulaşmak için içine dissolve M Nme/DMF.</li>
		<li>Nae 0,32 mL DMF 1.0 ulaşmak için 2 mL içine dissolve M Nae/DMF. Dikkat: Sentezinde kullanılan kimyasalların tehlikeli çoğu. Trifluoroacetic asit (TFA), DIC, Pip ve BMA cilt, gözleri ve solunum yolu tehlikeli. DMF ve diklorometan (DCM) kanserojen şüphelisiniz. Bütün tepkiler-meli var olmak kılınmak duman kukuIeta ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) sentezinde kullanılan tüm kimyasalların kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Reçine etkinleştirme
	<ol>
<li>Rink Amid reçine (reçine, 0,56 mmol/g yükleme 0,047 mmol) 84 mg ölçmek ve 10 mL polipropilen katı faz yanıtı gemi ekleyin. Pistonu geminin yerleştirin.</li>
		<li>DMF 2 mL tepki taşıyıcıyı ekleyin ve gemi ile bir basınçlı kap kap. Bir shaker taşıyıcıyı yerleştirin ve kapağı kaldırma ve reaksiyon teknesinin pistonu iterek gemi atık bir kapsayıcı hareket yaklaşık 12 derece ve 385 salınımlarını/dk 30 dk. drenaj çözüm için bir açıyla oda sıcaklığında kışkırtmak.</li>
		<li>Gemi 2 mL % 20 Pip/DMF çözeltisi ekleyin ve gemi kap. Shaker 2 min için üzerinde tahrik ve drenaj atık konteyner çözüm.</li>
		<li>Gemi 2 mL % 20 Pip/DMF çözeltisi ekleyin, gemi, kap ve kap, oda sıcaklığında 12 dk. Kaldır için kışkırtmak ve drenaj atık konteyner çözüm.</li>
		<li>DMF gemi, kapatma, 1 mL ekleyerek reçine yıkama ve gemi Tantanacı 1 dk. kapağını çıkarın ve pistonu iterek çözüm drenaj. Reçine ile DMF için 4 ek kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Monomer toplama ve N-terminal asetilasyon Not: Her monomer ek döngüsü iki reaksiyon adımları, bromoacetylation ve yer değiştirme içerir.<ol>
<li>Form Nme-reçine ilk monomer ek döngüsüne yerine getirir.</li>
		<li>Bromoacetylation reaksiyon gerçekleştirin. 1 mL 0.8 M BMA/DMF çözüm ve 0.8 M DIC/DMF çözüm bir ölçek 1 mL karıştırın. Karışım reçine içeren bir reaksiyon gemi aktarmak ve gemi kap. Taşıyıcıyı shaker yerleştirin ve kapağı, oda sıcaklığında 20 dk. Kaldır için kışkırtmak ve atık konteyner çözüm drenaj.</li>
		<li>DMF 1 mL ekleyerek, gemi kapatma, 1 dk. için Tantanacı ve pistonu iterek çözüm boşaltma reçine yıkayın. Reçine DCM 1 mL ekleme, 1 dk. için gemi Tantanacı ve çözüm boşaltma yıkayın. Bir kez daha reçine DCM ile yıkama ve sonra iki kez DMF ile yıkayın.</li>
		<li>Bir yer değiştirme reaksiyonu gerçekleştirmek. 1 mL 1.0 M Nme/DMF çözeltisi ekleyin, gemi kap, gemi 60 dk. Kaldır için oda sıcaklığında kap kışkırtmak ve pistonu iterek çözüm drenaj.</li>
		<li>1 mL DMF ekleyerek, 1 dk. için gemi Tantanacı ve pistonu iterek çözüm boşaltma reçine yıkayın. Reçine 1 ml DCM, 1 dk. için ajitasyon çizim ve çözüm boşaltılmasına yıkayın. DMF ile iki kez yıkayarak takip DCM bir kez daha, yıkayın.</li>
		<li>Monomer ek döngüsü 1.3.2-1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4oluşturmak için adımları yineleyin-reçine. Yer değiştirme reaksiyonu (1.3.4) adım yinelenen peptoid sırasına göre belirli Amin çözüm kullanın. Not: Peptoid zinciri için reçine bağlı C-terminal kalıntı ile N-terminus için C-terminus elongated.</li>
		<li>Ac-Nae-(Npe-Nme)4oluşturmak için N-terminal asetilasyon gerçekleştirmek-reçine.</li>
		<li>Mix 92 µL of asetik anhidrit, N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ve 2 mL DMF bir ölçek yaklaşık 2 mL asetilasyon kokteyl yapmak için 43,5 µL.</li>
		<li>Asetilasyon kokteyl 2 mL reçine içeren kap ekleyin, gemi kap ve 60 dk. kapağını çıkarın ve pistonu iterek çözüm drenaj için oda sıcaklığında kışkırtmak.</li>
		<li>DMF 1 mL ekleyerek, 1 dk. için gemi Tantanacı ve pistonu iterek çözüm boşaltma reçine yıkayın. Reçine DCM 1 mL ekleme, 1 dk. için gemi Tantanacı ve çözüm boşaltma yıkayın. Tekrar yıkama reçine DCM ile bir kez daha, sonra yıkayın DMF ile iki kez daha.</li>
		<li>DCM 1 mL ekleyerek, 1 dk. için gemi Tantanacı ve pistonu iterek çözüm boşaltma reçine yıkayın. Yıkama DCM ile iki kez tekrarlayın. Kapağını çıkarın ve izin reçine kuruması tepki gemi 10 dk içinde.</li>
	</ol></li>
	<li>Bölünme ve arıtma
	<ol>
<li>3.8 mL, TFA, triisopropylsilane (ipuçları) 100 µL ve HPLC sınıf H2O bir ölçek 100 µL 4 mL dekolte kokteyl yapmak için karıştırın.</li>
		<li>4 mL taze bölünme reçine içeren gemi kokteyl yapılmış eklemek, gemi kap ve 2 h için oda sıcaklığında kışkırtmak.</li>
		<li>Kapağını çıkarın ve filtrate çözüm bir 50 mL polipropilen santrifüj tüpüne toplamak. TFA 1 mL gemi ekleyin, o kap ve 1 dk. toplamak filtrate çözüm aynı santrifüj tüpü içine kışkırtmak.</li>
		<li>TFA yaklaşık 1 mL viskoz çözüm terk edene kadar azot gazı akışında hafifçe esen buharlaşır.</li>
		<li>15 mL Dietil eter kalan ekleyin, santrifüj tüpü kap ve bir gecede 2 h için-20 ° C dondurucuda kuluçkaya. Ham peptoid gibi beyaz katı precipitates.</li>
		<li>Bir santrifüj 4,427 x g 10 dk. Kaldır kullanarak katı santrifüj tüpü kap cips ve Dietil eter bir ölçek dikkatle katı kaybetmeden dikkatle boşaltmak. Dikkat: yanıcı organik çözücü Dietil eter var. Dietil eter güvenli santrifüj kullanınız.</li>
		<li>Tüp kapatma ve santrifüje yerleştirerek buz gibi Dietil eter 10 mL santrifüj ekleyerek katı tüp katı içeren yıkama. Santrifüjü 4,427 x g, 10 dk santrifüj santrifüj tüp ve Dietil eter bir ölçek dikkatle katı kaybetmeden dikkatle boşaltmak Kaldır gerçekleştirir.</li>
		<li>Katı azot gazı akışında hafifçe esen kuru.</li>
		<li>Kurutulmuş katı çözülmeye HPLC sınıf H2O 10 mL ekleyin. Naylon şırınga filtrenin gözenek boyutu 0,45 µm ile çözüm geçmesine ve filtrate önceden ağırlıklı 50 mL polipropilen santrifüj tüpüne toplamak.</li>
		<li>Kabuk yerleştirip santrifüj tüpü içeren bir 12-ons, Çift yığılmış genişletilmiş polistiren bardak 1/3 peptoid çözüm sıvı azot ile dolu döner çözüm dondur. Donmuş çözüm gecede katı peptoid vermeye lyophilize.</li>
		<li>Katı peptoid HPLC sınıf H2O 10 mL çözülerek lyophilization bir kez daha tekrarlıyorum, kabuk sıvı azot içinde buz gibi ve bir gecede lyophilizing. Elde edilen peptoid kütle spektrometresi tarafından dizi analizi için yeterince saf.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS ölçümleri ve dizi analizi
Not: MS/MS deney bir electrospray iyonlaşma (ESI) kaynağına birleştiğinde bir triple quadrupole Kütle Spektrometre içinde gerçekleştirilir. Veri toplama araç ile birlikte veri toplama yazılımı kullanılarak denetlenir. 1) tam tarama kütle spektrometresi deneme gerçekleştirme genel yordamı içerir ve kütle spektrumu kayıt, deneme 2) gerçekleştirme CID MS/MS MS/MS spektrum kayıt ve 3) MS/MS spektral verileri teorik ile karşılaştırma parçalanma düzeni tahmin dayalı peptoid yapısal özelliği.
<ol><li>Örnek çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>1.0-2.0 mg katı peptoid 3-5 mL cam şişe içinde dışarı tartın. Peptoid çözülmeye karışık 1 mL çözücü Asetonitril ve su (ACN/H2O, 1:1, v/v) ekleyin. Bu yaklaşık 10-3 M bir konsantrasyon ile hisse senedi örnek çözümü sağlar.</li>
		<li>Hisse senedi çözüm 20 µL 1,5 mL santrifüj tüpüne nakletmek ve yaklaşık 10-5 M seyreltilmiş örnek çözeltisi vermeye ACN/H2O karışık 1 mL çözücü eklemek.</li>
		<li>Başka bir 1,5 mL santrifüj çözüm üst kısmı yaklaşık 700 µL 3 dk. aktarmak için aralıklarla 4,427 x g de gerçekleştirerek seyreltilmiş örnek çözüm herhangi bir olası erimeyen parçacıklar tüp peptoid MS çalışma çözümü ile yapmak için Kaldır yaklaşık 10-5 M konsantrasyon.</li>
		<li>Kütle spektrometresi ölçümler sırasında gözlenen sinyal yoğunluğu dayalı MS çalışma çözüm konsantrasyonu ayarlayın.</li>
		<li>Örnek çözüm 0.20 µm şırınga filtreden geçmek ve filtrate çalışan çözüm yaklaşık 10-5 MS peptoid yapmak bir 1,5 mL santrifüj tüpüne toplamak mümkün herhangi bir erimeyen parçacıklar seyreltilmiş örnek çözümü kaldırmak için alternatif bir yol olduğunu M.</li>
	</ol></li>
	<li>Kitle spectra kayıt
	<ol>
<li>ACN/H2O (1:1, v/v) karışık solvent electrospray iyonlaşma (ESI) kaynak aracılığıyla çalıştırın ve standart bir pozitif iyon araç, tam tarama kütle spektrometresi modu bir kitle ücret oranı (m/z) aralığı 100-1500 ayarlayın. Not: Tipik işletim parametreleri: ESI iğne gerilim, 5 kV Kapiller gerilim, 40 V Gaz (azot gazı) sıcaklık, 200 ° c kurutma</li>
		<li>Peptoid MS çalışma çözüm (yaklaşık 10-5 M) yaklaşık 300 µL 500 µL veya 1 mL şırınga eklemek ve şırınga ESI koya kapiller polieter eter keton (göz) boru kullanarak bağlanın. Şırınga şırınga pompa üzerine yerleştirin ve örnek çözümü ESI giriş demleyin 10 µL/dk akış oranını ayarlamak.</li>
		<li>ESI işlemi etkinleştirmek için ESI iğne gerilim ve belgili tanımlık bulmak açın. Ekran tercihi modundan ve 100-1500 m/z aralığını ayarlayın. Profil penceresinde gösterilen bir kütle spektrumu profili görüntüleyin. M/z (m/z 1,264.6 görüntülenir) 1,265 zirve peptoid iyon veya protonated peptoid karşılık gelir.</li>
		<li>MS spektrum 2 min için kaydedin. İçinde "penceresi" yöntemi 2 dk "çalışma zamanı" kullanılır. Kayıt penceresini açın ve uygun dosya adı alanına doldurun ve spektrum kaydetmeye başlayın. Not: Elde edilen kitle spektrum şekil 3' te gösterilmiştir.</li>
		<li>M/z 1,265 zirvesinde yoğunluğunu en iyi duruma getirme. 1150-1350 için m/z aralığı ayarlayın ve kapiller gerilim mV profil penceresinde gösterilen en yüksek yoğunluk görüntülerken ayarlayın. Örneğin, 50 V kapiller voltajı yükseltin veya daha yüksek ve en yüksek yoğunluk değişikliği görüntülemek. En iyi en yüksek yoğunluk civarındadır 150-200 mV. Not: kılcal gerilim ayarlama önemli ölçüde bazı iyonların bereket değiştirebilirsiniz. Kapiller gerilim artan peptoid iyon yoğunluğu artırabilir. Ancak, yüksek kapiller gerilim da ayrılma peptoid ION İyon kaynağı, ikna etmek ve gözlenen yoğunluğu azaltmak. Gaz kurutma sıcaklığı ayarlama m/z 1,265 zirvesinde yoğunluğu artırabilir ama kapiller gerilim ayarlama daha az etkilidir. M/z 1,265 zirvesinde en uygun yoğunluk ulaşmazsa, numune konsantrasyon (veya örnek, çift MS çalışma çözüm konsantrasyonu) ayarlayın.</li>
		<li>Araç MS/MS moduna geçin. MS/MS aralığı 100-1400 m/z, kütle ve öncü iyon m/z 1,265 ayarlayın. Penceredeki"yöntemi," m/z 1,265 "Q1 ilk Mass" kullanmak ve "Q1 Son kitle" boş bırakın. M/z 100 m/z 1400 ve "Q3 ilk Mass" "Q3 son Mass" kullanın Not: MS/MS modunda, ilk quadrupole birimi (Q1) işlevleri peptoid iyon habercisi iyon olarak izole etmek için toplu bir filtre olarak ikinci quadrupole (S2) bir çarpışma hücre ve üçüncü quadrupole birimi (Q3) işlevleri toplu bir Çözümleyicisi birimidir.</li>
		<li>1,5 mTorr basınç çarpışma enerji, 40 eV ve çarpışma gaz (argon, bu durumda) küme.</li>
		<li>Profil penceresinde görüntülenen bir kütle spektrumu profili görüntüleyin. M/z 1,265 zirve peptoid iyon için karşılık gelen ve daha düşük m/z değerleri ile doruklarına peptoid iyon parçaları temsil eder.</li>
		<li>Parçalanma spektrum görüntüsünü optimize etmek için çarpışma enerji ayarlayın. Örneğin, 45 eV için çarpışma enerji artırmak ve spektrum profil değişikliği görüntüleyin. Not: genel olarak, çarpışma enerji artan parçası iyonları bolluğu arttırmak ve peptoid iyon bolluğu azaltmak. Çarpışma gaz basıncı artırarak parçası iyonları bolluğu da artıracaktır. Dikkat: çarpışma gaz basıncı 2 mTorr ötesinde artırmayın.</li>
		<li>MS/MS spektrum 2 min için kaydedin. "Yöntemi penceresi içinde" 2 dk "çalışma zamanı" kullanılır. Kayıt penceresini açın ve uygun dosya adı alanına doldurun ve spektrum kaydetmeye başlayın.</li>
		<li>1 - 2 kez kayıt yineleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid dizi analizi Not: CID koşul altında peptoid iyon Amid Tahvil B-iyonları denilen N-terminal parçaları bir dizi ve Y-iyonları denilen C-terminal parçaları bir dizi üretmek için peptoid omurga boyunca, parçalara ayırması<ol>
<li>Acetylated peptoid kimyasal yapısı sol tarafında ve C-terminus sağ tarafında N-terminus yerleştirerek çizmek ve şekil 2agösterildiği gibi bir parçalanma düzeni oluşturmak için her Amid bağı, kesikli çizgi çizin. Bir proton şarj taşıyıcı belirtmek için kesik bir daire çizin. Yapısı sol taraftan başlayarak, B1, B2, B8olarak N-terminal parçaları göstermek için kesik çizgiler etiketleri yerleştirin. Sağ taraftan başlayarak, etiketleri Y olarak1Y2, Y8C-terminal parçaları göstermek için kesik çizgiler üzerine yerleştirin. Not: Kimyasal bir çizim yazılımı peptoid yapısı çizmek için yararlı olabilir.</li>
		<li>Parçalanma 4th Amid bağı sol tarafta, hayal ve N-terminal parçası ve C-terminal parçası şekil 2bgösterildiği gibi uygun resmi suçlama yapılar çizin. Etiket B4 N-terminal parçası üzerinde yerleştirin ve etiketin Y5 C-terminal parçasını yerleştirin. 580 değeri vermeye yapı elemanlarında nominal kitlelerin özetliyor tarafından B4 m/z değeri hesaplamak ve m/z 580 N-terminal parçasını yerleştirin. Y5 m/z değerini hesaplamak ve m/z 685 C-terminal parçasını yerleştirin.</li>
		<li>Bütün sekiz B iyonları ve tüm sekiz Y iyonları m/z değerlerini hesaplamak ve bunları bir tabloda, Tablo 1' de gösterildiği gibi monte. Not: M/z değerleri parçalar yazılım çizim bir kimyasal kullanılarak hesaplanabilir.</li>
		<li>Araç ile birlikte veri inceleme yazılımı kullanarak peptoid kayıtlı MS/MS spektrumu açın. "İyon etiketlerini göster" için etiketleme tercihleri ve etiket eşik % 3'e ayarlayın. Bu tepeler üzerinde etiketli m/z değerleri ile MS/MS spektrum oluşturur.</li>
		<li>MS/MS spektral verileri CSV metin dosyasında olarak biçimlendirmek ve veri işleme yazılımı kullanarak spektrum yeniden dışa aktarın. M/z değerlerini tepeler üzerinde yerleştirin. Elde edilen MS/MS spektrum şekil 4' te gösterilmiştir. Not: Bazı Kütle Spektrometreleri MS/MS spektrum oluşturmak için veri işleme yazılımı kapasitesine sahiptir ile donatılmıştır. Bu durumda, MS/MS spektral verileri verme gerekli değildir.</li>
		<li>MS/MS spektrum bu karşılık gelen B - ve Y-iyonları tanımlamak için Tablo 1 ' de gösterilen gösterilen m/z değerleri atayın. Örneğin, m/z 580 zirvesinde B4olarak tanımlanır-iyon ve m/z 685 Y5olarak tanımlanan-iyon. Tepeler spektrum üzerinde karşılık gelen B ile Y simgeleri ile şekil 4' te gösterildiği gibi etiketleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, J., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoid+Polymers:+A+Highly+Designable+Bioinspired+Material.">Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material.</a> ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function,+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).</li><li>Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoid-Peptide+Hybrids+as+Potent+Novel+Melanocortin+Receptor.">Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor.</a> J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).</li><li>Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potent+Transactivation+Domain+Mimic+with+Activity+in+Living+Cells.">A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).</li><li>Patch, J. A., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Peptoid+Mimics+of+Magainin-2+Amide.">Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).</li><li>Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifouling+Glycocalyx-Mimetic+Peptoids.">Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).</li><li>Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Mimetic+Peptoid+Nanosheets+for+Molecular+Recognition.">Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition.</a> ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).</li><li>Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+Hemolytic,+and+Cytotoxic+Activities+of+&#946;-Peptoid-Peptide+Hybrid+Oligomers:+Improved+Properties+Compared+to+Natural+AMPs.">Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of &#946;-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs.</a> ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).</li><li>Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Controlled+Polymers.">Sequence-Controlled Polymers.</a> Science. 341 (6146), 628 (2013).</li><li>Altuntas, E., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Polymeromics":+Mass+spectrometry+based+strategies+in+polymer+science+toward+complete+sequencing+approaches:+A+review.">"Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).</li><li>Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+Hydrophilic+Linker+for+One-Bead-One-Compound+Sequencing+of+Oligomer+Libraries+by+Tandem+Mass+Spectrometry.">Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).</li><li>Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+Peptoids+and+Peptide-Peptoid+Hybrids+by+Partial+Edman+Degradation+and+Mass+Spectrometry.">High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).</li><li>Sarma, B. K., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submonomer+Synthesis+of+A+Hybrid+Peptoid-Azapeptoid+Library.">Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library.</a> ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).</li><li>Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Multidimensional+Mass+Spectrometry+Methods+for+Synthetic+Polymer+Analysis.">Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis.</a> Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-substituted+glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+[oligo(N-substituted+glycines)]+by+submonomer+solid-phase+synthesis.">Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, sunulan protokolü kullanılarak sentez. Sentez aparatı bir şırınga benzeri polipropilen katı faz yanıtı gemi ve mekanik bir shaker içerir. Reaksiyon damarları ticari olarak kullanılabilir ve düşük maliyetli. Mekanik bir shaker kimya laboratuvarları ortak bir cihaz var. Bir şırınga benzeri reaksiyon gemi kullanımıyla, çözüm içine çizilmiş ve pistonu el ile hareket ettirerek geminin dışına itti. Bu teknik bir tek tepki gemi için...

Peptoids bir sıra kontrollü polimerler peptidler yapısını taklit omurga yapıları ile sınıfıdır. Peptoids çeşitli aminler, peptoids son derece ayarlanabilir özellikleri1,2sergilemek sağlayan sentez. Peptoids moleküler modelleri olarak terapötik ajanlar kabul ve ligandlar proteinler3,4,5,6olarak tasarlanmış biyofiziksel araştırma için kullanılmaktadır. Peptoids anti-fouling ve antikor mimetic malzemeleri, antimikrobiyal ajanlar ve enzim inhibitörleri7,8,9gibi biyolojik olarak aktif bileşikler çeşitli içine geliştirilmiştir. Son derece düzenli ve akort doğa ile peptoids Ayrıca, moleküler bilgi depolama10bir türü olarak düşünülmüştür. Bu farklı uygulamaların keşfi sırası karakterize etmek için verimli analitik yöntem geliştirme ve peptoids yapısı için çağırır. Tandem kütle spektrometresi tabanlı teknikleri söz peptoids11,12,13de dahil olmak üzere polimerler, sıra kontrollü sıra özelliklerini analiz etmek için seçtiğiniz yöntemi olarak göstermiştir, 14,15. Ancak, sistematik çalışmalar kaynaklanan peptoid iyon parçalanma desenleri birleştiriliyor kütle spektrometresi çalışmaları ve peptoids yapısal bilgi çok sınırlıdır.
Peptoids kolayca bir katı faz yöntemiyle sentez. İyi gelişmiş yöntem bir yineleme bir iki adım monomer ek döngüsü16,17içerir. Her ek döngüsünde bir reçine bağlı Amin haloacetic asit (genellikle Bromoasetik asit, BMA) tarafından acetylated ve bu birincil Amin ile yer değiştirme reaksiyonu tarafından takip ediyor. Her ne kadar otomatik sentez protokolleri peptoid sentezi için rutin olarak uygulanan, peptoids el ile mükemmel verimleri bir standart Kimya Laboratuvarı16,18,19, ile sentezlenmiş 20.
Laboratuarımızın manuel peptoid sentez yöntemi kabul ve varolan yöntemleri kullanılan aparat Basitleştirilmiş. Daha önce bir dizi kullanarak MS/MS teknikleri21,22,23peptoids parçalanma şekillerinin inceledik. Onlar çarpışma kaynaklı ayrılma (CID)21,23 için tabi olan veya elektron-ayrılma (ECD)22 deneyler yakalama peptoids karakteristik fragmentations üretmek bizim sonuçlar gösterir. Bu makalede, biz nasıl oligo-peptoids standart kimya laboratuarında sentez, nasıl bir triple quadrupole Kütle Spektrometre kullanılarak CID deneyler ve spektral verileri çözümlemek nasıl göstermek. Sentez ve karakterize için peptoid N-terminal asetilasyon ve C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2ile bir nonamer var. Peptoid yapısı şekil 1' de gösterilen.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids sıra tarafından denetlenen peptit taklit eden reaksiyonlar N alkylated glisin birimlerinin oluşan vardır. Birçok potansiyel uygulamalar arasında peptoids, moleküler bilgi depolama türü düşünülmüştür. Kütle spektrometresi analiz yönteminin seçimi için sıralama peptoids olarak kabul edilmiştir. Peptoids yolu ile yinelenen bir iki aşamalı reaksiyon döngüsü kullanılarak katı faz kimya sentez. Burada el ile oligo-peptoids sentez ve tandem kütle spektrometresi (MS/MS) yöntemlerle peptoids dizisini analiz etmek için bir yöntem mevcut. Örnek peptoid N-(2-methyloxyethyl) glisin (Nme) ve N-(2-Feniletil) glisin (Npe) yanı sıra bir N-(2-aminoethyl) glisin (Nae) N-terminus adlı alternatif oluşan bir nonamer var. Peptoid dizi formülü Ac asetil grup nerede Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2' dir. Sentez bir piyasada bulunan katı faz yanıtı gemi içinde yer alır. Pisti Amid reçine sağlam destek C-terminus adlı bir Amid grubu ile peptoid verim için kullanılır. Peptoid çarpım dizi analizi bir electrospray iyonlaşma kaynağına birleştiğinde bir triple quadrupole Kütle Spektrometre kullanılarak tabi tutulur. MS/MS ölçüm parçası iyonları şarj edilmiş peptoid ayrılma kaynaklanan bir spektrum üretir. Parça iyonları onların kitle ücret oranı (m/z) değerlere göre sıralanır. M/z değerleri parçası iyonlar karşı teorik olarak tahmin edilen parça iyonlar, kitleler nominal peptoid parçalanma şemasına göre karşılaştırılır. Analiz şarj edilmiş peptoid bir parçalanma desen oluşturur. Parçalanma desen tarafsız peptoid monomer dizi ilişkilidir. Bu bağlamda, MS analizi peptoids sırası bilgi okur.

9-mer peptoid ile N-terminal asetilasyon, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, yapısı şekil 1' de gösterilen. Peptoid el ile fritted polipropilen tepki damar yolu ile katı faz yaklaşım sentez. Pisti Amid reçine (0,047 mmol, 0,56 mmol/g yükleme ile 84 mg) bir amidated C-terminus ile peptoid verim için sağlam destek kullanılır. Peptoid zinciri monomer yanı sıra birden çok döngüsü tarafından inşa edilmiştir. Her monomer ek döngüs?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids at JoVE.com

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Bir iletişim kuralı oligo-peptoids dizi analizi tarafından takip manuel sentezi için kütle spektrometresi tarafından açıklanmıştır.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K Görüntüleme.  University of the Pacific. Bir iletişim kuralı oligo-peptoids dizi analizi tarafından takip manuel sentezi için kütle spektrometresi tarafından açıklanmıştır.

Video: Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Kimya

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biyokimya

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Bilgi taşıyan Peptoidlerin sentezi ve Dizi yönelimli Dinamik Kovalent Öz-montaj

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biyoloji

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.