CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1. electroporate HH12-13 Tavuk Embriyolar Sinir Tüpler ovo yılında İlgi Construct Bir transfeksiyon tatmin edici seviyelere sahip bireylerin hemen tespit edilmesini sağlamak için, tercihen bir bisistronik transkriptte, bir flüoresan raportör kullanarak ya da araya giren virüs 2a peptit 11 ile ilgi proteinine. NOT: Bu aşamada tipik inkübasyon süresi 37.8 ° C&#39;de yaklaşık 48 saat olduğunu. <ol><li> Bir 18 G x 1 1/2 iğne bağlanmış bir şırınga ile albümini 3 ml çıkardıktan sonra yumurta küçük bir pencere açar. Embriyo görünümünü geliştirmek için, embriyo 1-4 altında steril Ringer çözeltisi içinde 1:50 seyreltilmiş ve Hint mürekkebi az miktarda enjekte edilir. </li><li> Steril Ringer solüsyonu ile embriyo kat ettikten sonra, 2.5 ug nöral tüpün arka ucundan bir DNA doldurur kadar / ul ihtiva eden, 10 mM Tris-HCI, pH 8.2 ve% 0.1 bir gıda boyası (K, D &amp; C) çözelti enjekteBeyin bölgeye kadar. , Dış yan yüz bölgesi boyunca, 4 mm, 1 ile ayrılmış pozisyonlar platin elektrotları (çapı 0,5 mm) elektroporasyona ve bunların 4 ila 100 msn bir aralık ile 5 ila 50 ms arasında bakliyat ve 20 V sunmak. </li><li> Elektroporasyondan sonra, bu aşamada HH23 ulaşana kadar daha fazla 48 saat için manipüle embriyolar inkübe ve flöresanlı bir stereomikroskop altında dış yan yüz bölgesinde transfeksiyon yüksek düzeyde sunulması bireylerin belirlenmesi. Not: Elektroporasyondan sonra inkübasyon süresi Deneyin amacı bağlıdır. Electroporated plazmidler 2 saat sonra 2 anlamlı ifadesi düzeyleri oluşturabilirsiniz. İlgi erken başlangıçlı gen içinde ise Böylece sonrası elektroporasyon Kuluçka süresi azaltılabilir. </li></ol> 2. Hasat Başarıyla Embriyolar Geçiştirilmiş ve Electroporated Omurilik yarıları teşrih NOT: Bu işlem her 10 embriyo ve verimleri 1 2-3 saat sürer-2 Embriyo başına mikrogram toplam RNA. Nöral tüp diseksiyonu ince hareketlerini gerektirir ve bazı antremanları deneysel örnekleri uygulamadan önce gerekli olabilir. <ol><li> RNaz dekontaminasyon solüsyonu ya da 4 saat 12 boyunca 150 ° C&#39;de fırınlanması ile metalik diseksiyon araçları dekontamine ve DEPC ile muamele edilmiş PBS hazırlar. Sadece yeni sertifikalı RNazsız plasticware kullanın. NOT: Hasattan sonra, o diseksiyonu sırasında Rnase bulaşmasını önlemek için standart bakım takip etmek önemlidir. </li><li> Ince kesici bir makas ve bir elenmiş toplama kaşık kullanarak embriyoların hasat. 100 mm Petri kabındaki soğuk DEPC ile muamele edilmiş PBS içinde embriyolar tutun. </li><li> Ince bir cımbız ile, (ön bacak tomurcuk ve arka bacak tomurcuk ön sınırı posterior sınırı arasında) bütün yan bölgeyi kesip ve soğuk DEPC tedavi PBS içeren yeni bir çanak için bu bölümü aktarmak. </li><li> Üç farklı at delmek için iki ince cam iğneler kullanınnöral tüp ve paraksiyel mezoderm arasında embriyonun her dorsolateral tarafında işaret ediyor. </li><li> Merkez perforasyon iki cam iğneler tanıtmak ve yavaş yavaş nöral tüp ön-arka eksen boyunca onlardan birini uzağa taşıyın. İlk hareketlerin ulaştığı değil deliklerden için bu işlemi tekrarlayın. Ince bir cımbız ile müstakil paraksiyel mezoderm çıkarın. </li><li> Yanlara embriyo çevirin nöral tüp ve Notokordun arasında cımbız ipuçları yerleştirin ve iki yapıyı ayırmak için ön-arka eksen boyunca ters yönlerde kaydırın. Not: Bu aynı zamanda mezodermin çoğu hala nöral tüp takılı kaldırmanız gerekir. </li><li> Gerekirse, hafifçe cımbız başka bir çift nöral tüp tutarken bir çift cımbız ile çekerek bağlı kalır mesodermic dokusunun herhangi bir büyük parçaları çıkarın. Bittiğinde, yavaşça kullanılarak soğuk DEPC tedavi PBS içeren başka bir kaba nöral tüp transferiRNazsız cam Pasteur pipet manuel pipet pompasına bağlanmış ve tüm tüpler disseke kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Ikiye sinir tüpleri bölün. Bunun için, lümeninde cımbız kapalı bir çift keskin ucu takın ve içinden cımbız dışarı taşıyarak çatı plakasını açın. Bundan sonra, cımbız uçları ile taban plakasını keserek yarısını ayırmak. </li><li> Sıralama buz soğukluğunda DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile doldurulmuş bir 1.5 ml&#39;lik tübe floresan bir diseksiyon kapsam ve transfer altında olmayan elektroporasyona yarıları elektroporasyona. Gerekirse, plastik duvarlarına bağlı herhangi bir dokuyu çıkarmak için ve bu tüplerin tortulaşmayı teşvik etmek için hafifçe mikrotüpler hafifçe vurun. </li><li> 3 sn 100 xg&#39;de Spin ve 1 ml mikropipet ile mümkün olduğu kadar PBS gibi çok yavaşça kaldırın. Herhangi bir embriyonik malzeme pipet emilir eğer izlemek için mikrotüpünden parlar bir ışık kaynağına bakarak bu süre yapmak; Bu olursa, yavaş yavaş deşarj ve centrifuga tekrarlayınyon. </li><li> Nöral tüp devre başına RNA ekstraksiyonu için lizis çözeltisinin 70 ul ekleyin ve içerikleri karıştırmak üzere tüp hafifçe vurun. Kuvvetli bir şekilde 5 dakika ve vorteks oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika inkübasyondan sonra, vorteks iki kez daha tekrarlayın. -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir sonraki aşama için yeterli bir verimi sağlamak için, numune başına en az sekiz nöral tüp yarıyı toplayın. Birkaç elektroporasyon / diseksiyon oturumları nöral tüp yeterli sayıda biriktirmek için gerekiyorsa daha küçük örnekler havuzu. Her durum için çiftleri veya üçlülerdeki için yeterli örnekleri saklamak. </li></ol> 3. Arındırıcı RNA ve Illumina dizinleri için Kütüphaneler hazırlayın <ol><li> -80 ° C&#39;de depolama ile ilgili örnekleri çıkarın ve 15-30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Tamamlanıncaya kadar oda sıcaklığında çözülme devam edin. </li><li> Girdap de ve 5 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 1 dakika 15.000 xg&#39;de tekrar karıştırın ve santrifüj çözünmeyen malzeme peletlendi. </li><li> Yeni bir tüpe süpernatant aktarınve toplam RNA izolasyon kiti kullanım talimatlarına uygun olarak RNA ekstraksiyonu geçin. Konsantrasyonunu arttırmak için önerilen minimum hacimde Zehir. NOT: Temiz-up sonra DNaz tedavi RNA-Dizi veri kümelerinde genomik DNA dizilerinin potansiyel kontaminasyonu önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Içerikleri karıştırmak ve kalite kontrol analizi için 5 ul nin uzaklaştırılması için boru hafifçe vurun. Kütüphane hazırlanana kadar -80 ° C de, geri kalan örnek Mağaza; Bu örneklerin RNA bozulmasını önlemek için sadece bir kez çözdürülmelidir. </li><li> RNA 6000 Nano kiti kullanarak Bioanalyzer enstrüman saflaştırılmış RNA çalıştırın; RIN değeri en az 7, yukarıda devam etmek gerekir. </li><li> Bir Illumina uyumlu bir RNA-Dizi kütüphane hazırlama kitini kullanarak kütüphaneleri oluşturmak ve tek okur 100 bp oluşturmak için ayarlanmış bir HiSeq aletinin bir şeritte 4 kütüphanelere kadar multipleks. Mümkünse, potansiyel teknik eserler en aza indirmek için aynı vadede tüm örnekleri yer alıyor. NOT: Bu 50 milyon r kadar verim gerekirçoğu genler 13 kapsama almak için fazlasıyla yeterli olduğunu numune başına EADS. </li></ol> 4. Galaxy Kamu Server 10 RNA-Dizi Veri Kümeleri karşılaştırın. NOT: Server depolama alanı sınırlı olduğu ve birçok örnekleri karşılaştırarak deneyler filtreleme adımda oluşturulan ara dosyaların silinmesini isteyebilir. <ol><li> (Galaxy kamu sunucusunda bir kullanıcı hesabı oluşturun <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) ve FTP fastq formatında Illumina veri setlerini yükleyin. </li><li> NGS altında FastqGroomer 14 aracı ile yüklenen dosyaları hazırlayın: QC ve manipülasyon menü; kalite puanları zaten Phred + 33 (Sanger) olarak kodlanmış ise, basitçe her veri kümesi için Öznitelikler altında fastqsanger için dosya türünü değiştirerek bu adımı atlayın. </li><li> QC ve manipülasyon beni: genel NGS altında FastQC aracını kullanarak her veri kümesi kalitesini analiznu. Not: Bu okur uçlarını düzeltmek için kullanılan parametreler için tahminler sağlayacak gibi özel dikkat, baz dizisi kalite başına ve her baz dizilimi içerik için çıkan grafik verilmelidir. </li><li> Trim &#39;3 atmak için okur aracını NGS altında fastq Kalite Giyotin 14 kullanılarak düşük kaliteli veri ile biter: QC ve manipülasyon menü. Sadece 3 &#39;20 altında kalite puanı biter işlemek için aracı ayarlayın. </li><li> Klip aracını kullanarak (okuduğunda adaptör dizilerinin kaldırmak <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> QC ve manipülasyon menüsü: NGS altında). Az kalan 45 bp, giriş kullanılan adaptörün dizisi ile okur atmak ve hem de kısaltıldı olmayan kırkılmış dizileri ihtiva çıkışını seçmek için aracı ayarlayın. Ayrıca, en düşük kaliteli bazlar zaten son adımda çıkarıldı beri bilinmeyen üsleri ile dizileri atmak değil tercih. </li&gt; <li> Aracı Trim dizileri (kullanarak <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> NGS altında): FastQC tarafından algılanan 5 &#39;dizisi önyargı (genellikle 10) kaldırmak için okur QC ve manipülasyon menüsü, ilk üsleri kırpın. NOT: Bu noktada, tekrar FastQC çalıştırın ve veri kümesi kalitesinin düzeldiği olmadığını belirlemek için önceki analizi ile karşılaştırmak için iyi bir fikirdir. </li><li> Download ve Illumina iGenomes gelen UCSC genom tarayıcı için son tavuk genom aksamını paketinden ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) ve tüm genom Fasta biçimi dosyası ve genler açıklama GTF biçimi dosya upload Veri Al menüsü altında araç Dosya Yükle kullanarak Galaxy tarihine. </li><li> Harita altında hizalama TopHat2 15 kullanılarak tavuk genomunun her bir numune için okumaNGS: RNA Analizi menüsü. Tarih bir genomu kullanmayı tercih (adım 4.7 yüklenen Fasta dosyasını seçin). </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Kol Düğmeleri 16 kullanılarak her bir örnek için bir tahmin transcriptome oluşturun. Bir rehber olarak referans notu kullanın (adım 4.7 yüklenen GTF dosyayı seçin) ve seçenekleri açmak (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin ve çok okumak doğru kullanın seçin. </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffmerge 16 kullanan tüm örnekler için tahmin transcriptomes Birleştirme. (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyasından) ve sekans verileri (adım 4,7 GTF dosyası) referans notu kullanın seçin. </li><li> RNA Analiz menüsünde: NGS altında Cuffdiff 16 kullanılarak her bir örnek için TopHat2 tarafından oluşturulan BAM dosyalarını karşılaştırın. Alan Kopyalarıyla de beni seçinrged transcriptome Cuffmerge tarafından oluşturulan ve seçenekleri (Tarih, adım 4,7 Fasta dosyadan) Eğilim Düzeltme gerçekleştirin açmak ve çoklu-okuma doğru kullanın. </li><li> Sıralama diferansiyel ifade Filtresi altında araç Sıralama kullanarak sayısal sütun 13 (q değeri) olarak artan tabloları test ve menü sıralayın. Not: Genler / düşük q değerlerinin sunacak deneysel koşullar arasında anlamlı bir diferansiyel ekspresyonu gösteren transkript. </li><li> Kapsama grafikler ile görsel olarak sonuçları kontrol etmek için, öncelikle aracı BEDTools menüsü altında genom kapsama 17 bir BedGraph kullanarak oluşturun bedGraph formatında BAM dosyalarını dönüştürebilirsiniz. Kapsama olmadan bölgelerin bildirimini devre dışı, farklı aralıklarla olarak eklenmiş girişleri tedavi ve tüm gerçekleştirmede karşılaştırılan için sıralama derinliği normalleştirir bir faktör tarafından kapsama ölçek seçin. </li><li> Kullanarak kodaman formatında çıkan bedGraph dosya dönüştürmearacı Peruk / BedGraph-to-kodaman ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) Dönüştür Biçimleri menüsü altında. UCSC genom tarayıcı (özel parça olarak kodaman dosya upload <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> galGal4 montaj için) ve veri kümelerinde kapsama görselleştirmek için ilgilenilen geni arayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).</li><li>Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+approaches+in+the+chick+embryo.">Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo.</a> Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).</li><li>Ghadge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+wild-type+SOD1+and+FALS-linked+mutant+SOD1+cause+neural+cell+death+in+the+chick+embryo+spinal+cord.">Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord.</a> Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).</li><li>Megason, S. G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitogen+gradient+of+dorsal+midline+Wnts+organizes+growth+in+the+CNS.">A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS.</a> Development. 129 (9), 2087-2098 .</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Cloonan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+transcriptome+profiling+via+massive-scale+mRNA+sequencing.">Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing.</a> Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+Team.+Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).</li><li>Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viral+2A+peptide+for+bicistronic+expression+in+transgenic+mice.">Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.</a> BMC Biol. 6, 40 (2008).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+coverage+and+depth+of+transcriptome+by+RNA-Seq+in+chickens.">Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens.</a> BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Vieceli, F. M., Sim&#245;es-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+chicken+Scratch2+is+expressed+in+a+subset+of+early+postmitotic+neural+progenitors.">The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors.</a> Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo.">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+novel+players+in+the+cranial+neural+crest+gene+regulatory+network.">Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network.</a> Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tavuk omuriliğin elektroporasyon sonra etkilerini analiz etmek için yönergeler sağlamak. DNA vektörlerine elektroporasyonu daha sık ilgi konusu bir geni fazla-sentezlemek üzere kullanılmasına rağmen, tek bir gen fonksiyonu yok etme koşulları 19-21 oluşturmak üzere siRNA&#39;lar dominant negatif, quimeric proteinler veya öncülerini kodlayan yapıları kullanabilir. Aslında, gain- ve kayıp fonksiyon-analiz hem kaynaklanan transcriptome profilleri karşılaştırılması farklı şekilde...

Ovo elektroporasyon DNA 1-5 yapıları ile kısmen in vivo embriyonik yapıların transfect için hızlı ve ucuz bir şekilde temsil ettiği için canlı organizmalar üzerinde genetik araştırmalar sık sık bir model olarak tavuk embriyo kullanın. Örneğin pCIG 6 veya 7 PMES gibi, ilgi konusu gen ile birlikte, bir flüoresan raportör ihtiva eden ve bir transkript şifreleyen bisistronik ekspresyon vektörleri, alt analizi için embriyolar işlemeden önce bir stereo mikroskop altında arzu edilen bir bölgede transfeksiyon kalitesinin hızlı doğrulama sağlar. DNA dizilimi son gelişmeler ile, RNA-seg 8,9 kullanılarak RNA örneklerinden dijital tüm transcriptome ifade profillerini elde etmek artık mümkün. Bu yüzden, bunun yerine örneğin, in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve qPCR, cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için olduğu gibi paralel olarak sadece birkaç gen ürünlerinin, analizine imkan veren zaman alıcı bir yöntemYüksek verimli sekanslama, tüm transcriptome bilgi sağlayabilir. Her bir genin ekspresyon seviyeleri üzerindeki deneysel etkilerinin gözlenmesi da kullanılan yapı tarafından değiştirilmiş yolları üzerinde güçlü bir anlayış temin edebilmektedir. Bu, kullanılan organizma için bir genomik montaj varsa özellikle kolaydır, böylece civciv embriyo yine uygun bir modeldir. Kullanıcı güvenilir bir genom dizileme merkezine erişimi varsa, ana konu yüksek kaliteli RNA örnekleri elde edilir. Bu çalışma, elde edilen veri setleri in silico analiz için RNA sekansına uygun transfekte sinir tüpleri, hem de alt adımları RNA örnekleri elde etmek için bir yöntemi gösterir. 48 saatlik bir inkübasyon takip HH12-13 de Elektroporasyon işleminden sonra, transfekte edilen gövde omurilik yarısı, ribonükleaz içermeyen koşullarda kesilmiş, hemen yok edilmekte ve daha fazla RNA saflaştırma işlemi ve kütüphane preparatın kadar ultra-düşük donma bozulmaya karşı korunaniyonu temsil etmektedir. Galaxy public server 10 yüksek verim sıralama verilerini analiz etmek için ücretsiz kaynaklara erişim sağlar. Kayıtlı kullanıcılar için sunulan alan miktarı böylece lokal hesaplama altyapısı için ihtiyacı ortadan kaldırarak, küçük deneyler için yeterli. RNA Dizi veri analizi filtreleme, uyum ve gen ekspresyonunun nicelendirilmesi / karşılaştırmayı içermektedir. RNA-Seq veri analizi için genel kurallar olmasına rağmen, filtreleme parametreleri dizileme kalitesine bağlı olacaktır ve ham verilerin kalite kontrol analizinden sonra tespit edilmelidir. Bu protokol almak ve in vivo transfekte tavuk embriyonik omurilik RNA-Dizi profillerini karşılaştırmak için adımları açıklar. Temsili bir sonucu olarak, bir boş vektör ile transfekte edilmiş iki farklı kontrol numunelerinden elde edilen veri setlerinin karşılaştırılması yöntem, yeniden üretilebilir ve farklı olarak Expres tanımlanmasına olanak gerektiğini gösterdiDeney örneklerindeki SED transkript. Bu nedenle, bu yöntemin uygulanması büyük ölçüde tek bir deneyde sonra keşiflerin sayısını artırmak ve böylece müteakip soruşturma için büyük bir veri kümesi sağlamak potansiyeline sahiptir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indian &#236;nk</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18G x 1 1/2 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F D &#38; C Blue 1</td>
			<td>Spectra Colors Corporation</td>
			<td>5.FC.0010P0</td>
			<td>Food Dye used to visualize DNA injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ringer&#39;s solution (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 7.2 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.37 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.225 g CaCl2.2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.217 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.02 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Filter and autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 8 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1.15 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L and filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sieved spoon</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZap RNase decontamination solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine point surgical scissors</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Straight fine point tweezers</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>40A502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9&#39;&#39; glass Pasteur pipette</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Manual pipette pump</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAlater solution for RNA stabilization</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAqueous total RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Biology Grade Ethanol</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001/RS-122-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Anlatılan yöntem doğrulamak için, iki kontrol numuneleri, boş vektör PMES 7 ve uç tavuk SCRT2 18 çinko-parmak sahalarını kodlayan SCRT2-ZNF, yapıyı içeren aynı vektör ile transfekte edilmiş embriyolar, bir örnek ile elektropore edildi embriyolardan elde edilmiştir. Her 11-22 ug toplam RNA elde edildi Örnekler 8-12 embriyo havuzlarından elde edilmiştir. Her üç numune, yüksek kaliteli, RNA bu protokol ile elde edilebileceğini gösteriyor, Bioanalyzer cihazı (Şekil 1...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Görüntüleme.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Video: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...