Bu çalışma 2009 yılı Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası ile verilen fonların ANI R01 GM56244 NIH tarafından desteklenen ve NIH R01 GM87130 JARP

1. Embriyoların izolasyonu Not: fareler içeren tüm işlemler uygun hayvan bakımı ve kullanım ilkeleri ve protokolleri doğrultusunda yapılmalıdır <ol><li> Sabah çiftleşmeden sonra dişi fare, bir çiftleşme fişi varlığı için kontrol edin ve onlara farklı bir kafese koyarak damızlık erkek evlendirilen kadın ayrı. Çiftleşme fişi görülmektedir gün Noon embriyonik gelişim günde 0.5 (E0.5) olarak kabul edilir. </li><li> E8.5, (ya da istenen sahne, eğer farklıysa), onaylı bir protokolü kullanarak fare kurban. </li><li> % 70 etanol ile ötenazi hayvanın karın Islak ve karın boşluğu açmak. Gelişmekte olan embriyolar varlığını gösteren uygulama yerlerinin her rahim boynuz uzunluğu boyunca (Şekil 1A) bir ipe boncuk &quot;düzenleme&quot; olarak görülüyor. Makaslar kullanılarak, hem de rahim boynuzları kaldırmak ayrı ayrı ayrı her implantasyon sitesi kesmek (Şekil 1B) ve oda sıcaklığında (RT) içeren bir 100 mm petri koyun diseksiyonu orta (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 20 mM HEPES pH 7.4 60 mcg / ml penisilin, 2 mM streptomisin). </li><li> Forseps kullanarak, rahim dokusu (Şekil 1C) her embriyo ve çevresindeki membranlar kaldırmak ve taze diseksiyonu orta koyun. </li><li> Forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında bireysel embriyolar izole edin. Geliştirme Bu aşamada, embriyoların, paryetal yolk kesesi, rehber deciduum doku, visseral yolk kesesi ve amniyon. Ile çevrili Amniyon embriyo ile doğrudan temas halinde olan şeffaf bir zar. Visseral sarısı kesesi, amnion ve paryetal yolk kesesi arasında yer alır ve kolayca E8.5-E9.5 embriyolar embriyo beslemek önde gelen kan damarlarının varlığı ile ayırt edilir. Çevresindeki membranlar, her embriyo çıkarın ve aşırı kan çıkarmak için diseksiyon medya içeren yeni bir plaka içine ayrı ayrı transferi. Gelişimsel aşamada, embriyo embriyoya litre arasında değişebilir; temsilcisi E8.5 embriyo ve bir temsilcisi E9.5 embriyo Şekil 1D gösterilmiştir. </li><li> 200 ul diseksiyonu medya (yukarıdaki 4. adımda açıklandığı gibi) içeren 1.5 ml Eppendorf tüp her embriyo transferi. </li></ol> 2. İzole Embriyo, Homojenizasyon <ol><li> Her Eppendorf tüpüne 200 ul hacmi (DPBS 1X Dubbecco Fosfat seyreltilmiş Tamponlu Salin) 20 adet kollajenaz tip II ekleyin. </li><li> 37 ° C çalkalayıcı numune 100 rpm&#39;de 20 dakika süreyle hafifçe sallayın. </li><li> Hücre kümeleri bozabilir pipetleme iyi süspanse edin. </li><li> Hücre süspansiyonu, 1.5 ml Eppendorf tüp üzerine yerleştirilir steril hücre süzgeç (40 mikron mesh boyutu) üstüne sürün. </li><li> Ayrımını tamamlamak için oda sıcaklığında hücre süzgeç üstüne 1X DPBS 600 ul hemen geçerlidir. Süzgeç atın. </li><li> 4 örnekleri Santrifüj ° C, 5 dakika için 4000 xg&#39;de. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> RT 1X DPBS 1 ml pelletini tekrar. </li><li> Örnekleri oda sıcaklığında 1 dakika için 4000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> 200 RT diseksiyon medya ul pelletini tekrar. </li><li> Embriyonik hücre sayımı. Ortalama 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embriyo vardır. </li></ol> 3. Çapraz bağlantı Kromatin <ol><li> % 1 lik formaldehit nihai konsantrasyonu 200 ul örnekleri% 37 formaldehit 5.6 ul ekleyin. </li><li> Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> 4 ° C ile 3 dakika 4000 xg&#39;de numuneleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> 80 ul / ml proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) içeren soğuk 1X DPBS hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> 4 örnekleri Santrifüj ° C, 3 dakika 4000 xg&#39;de. </li><li> Süpernatantı atın. Bu aşamada, numuneler -80 dondurulmuş ° C Dondurulmuş, çapraz örnekleri, birkaç ay boyunca stabildir. </li></ol> 4. Sonikasyon <ol><li> RT SDS lizis tamponu (taze eklendi PIC 1 ul PIC/800 ul toplam hacmi 50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA ve% 1 SDS) 100 ul hücre pelletini tekrar. Yeniden süspanse, RT SDS lizis tamponu tabanda teşvik etmek için ek bir 100 ul ekleyin. Pipetleme ve tersine çevirerek iyice karıştırın. </li><li> 10 dakika buz üzerinde hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> 200 ile 500 basepairs Diagenode Bioruptor kullanarak kesme DNA parçalanmış hücreleri sonikasyon ™ UCD200 (5 dak x 8 kez 30 sn on/30 sn: yüksek (320 watt) güç genlik ayarı). Örnekleri bir buz bulamaç çevrili olmalıdır. Örnekler 4 ° C üzerinde sıcak veya dondurmak için izin vermeyin. Kullanılabilir sonicators birçok türü vardır. Yaklaşık 500 bp uzunluğunda çapraz bağlı DNA makaslama sonucu her sonikatör Sonikasyon koşulları için optimize edilmelidir. </li><li> 4 sonicated örnekleri Santrifüj ° C&#39;de 10 dakika süreyle 14000 xg&#39;de. </li><li> Ttaze bir Eppendorf tüp buz üzerinde önceden soğutulmuş süpernatant ransfer. </li><li> 5 alikotları maksimum sonicated örnek bölün. Ampirik bir E8.5 embriyo 5 alikotları ayrılabilir olduğunu tespit ettik. Küçük veya büyük örneklem büyüklüğü buna göre ölçeklendirilebilir. Bu aşamada, örnek -80 ° C daha sonra kullanmak kadar saklanabilir. </li><li> Rezerv çapraz bağ tersine dönecek kadar -20 ° C adım 6 giriş ve deposu olarak kullanmak için bir kısım. Seyreltik 1 μl/800 taze eklendi PIC içeren ChIP seyreltme tamponu (16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA,% 1.1 Triton X-100, 167 mM NaCl ve% 0,01 SDS) 10 kat, diğer alikot ul tampon. </li></ol> 5. Ön temizleme ve Immunoprecipitation <ol><li> Pre-açık Salmon-Sperm DNA / Protein 4 A veya Agaroz G-50% bulamaç ° C, döndürme, 1 saat 75 ul ile seyreltilmiş süpernatant. A veya Protein G boncuk ChIP için kullanılacak antikor tespit edilmelidir iki Protein kullanın. Örneğin, protein G boncuk keçi antikorları veya fare IgG 1 antikorlar için önerilen ise protein A boncuk, tavşan antikorları için önerilir. Daha ayrıntılı bilgi için, boncuk üreticisi tarafından yapılan tavsiyelere bakın. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika için 2500 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yeni bir ön soğutmalı Eppendorf tüp süpernatantı aktarın. </li><li> Önceden temizlenmiş kısım antikor (4 mikrogram / örnek) ekleyin ve 4 gece inkübe ° C dönüş. </li></ol> 6. Çamaşır Kromatin-protein-boncuk Kompleksi <ol><li> 4 ° C rotasyon ile 1 saat süreyle inkübe içine her şişe ve Somon Sperm DNA / Protein A veya G agaroz bulamaç 60 ul ekleyin. 3. adımda ön temizleme için kullanılan aynı boncuk türü kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika için 1000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. DNA-protein-boncuk kompleksi buz üzerinde tutun. </li><li> Süspanse edin ve yıkama tamponlar 1, 2 ile aşağıda yönettiği pelet, 3, ve 4 yıkayın. 1-3, 4 ° C ve bu tamponlar ile yıkama yapılmalıdır 4 soğutulmuş olmalıdır tamponlar ° C yıkayın Tampon 4 oda sıcaklığında yapılmalıdır oda sıcaklığında ve bu tamponu ile yıkar olmalıdır yıkayın. Her yıkama uygun sıcaklık rotasyon ile 5 dakika boyunca. 4 ° C (4 yıkama yıkama tamponu oda sıcaklığında) 1 dakika için 1000 xg&#39;de her yıkama, santrifüj, daha sonra dikkatlice aspire veya süpernatantı kaldırmak. </li></ol> Tampon 1: Düşük tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100, 150 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar. Tampon 2: Yüksek tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100, 500 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar. Tampon 3: LiCl tuz yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA,% 1 IGEPAL-CA630 0.25 M LiCl ve% 1 deoxycholic asit (sodyum tuzu)), 1 ml x 1 yıkama. Tampon 4: TE tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 yıkar. 7. Kromatin-antikor Kompleksi, Elüsyon <ol><li> Taze hazırlanmış elüsyon tamponu (1% SDS, 0.1 M NaHCO 3) 250 ul yıkanmış kromatin-protein-boncuk kompleks tekrar 5 saniye sonra rotasyon ile 15 dakika oda sıcaklığında inkübe şiddetle vorteks örnek. </li><li> 1 dakika için 2500 xg&#39;de RT Santrifüj ve yeni bir Eppendorf tüp içine eluat aktarmak. </li><li> 1. ve 2. adımları tekrarlayın ve aynı Eppendorf tüp Eluatlar birleştirmek. Eluatlar oda sıcaklığında tutulmalıdır. Eluatlar bu adımın tamamlanmasından sonra, daha sonra kullanmak kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 8. Ters Cross-Link ve DNA Kurtar <ol><li> 500 ul eluat (giriş kontrolü için 40 ul / ml) 20 ul 5 M NaCl ekleyin. </li><li> Bir gecede 4 saat süreyle su banyosunda 65 ° C Eluatlar ısıtın. </li><li> (Giriş kontrolü de dahil olmak üzere) her bir numune 10 ul DNA parçası boyutunu kontrol etmek için 0.1 ile 1 kbç kapsayan boyutu işaretleri yanında% 2 agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir. DNA bir karalama olarak görünür ve keskin bir grup değil. Örneklerin geri kalanı 65 bırakılabilir ° C jel çalışırken. </li><li> QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (Qiagen) kullanılarak her örnek DNA kurtarın. QIAquick spin kolon ve 500 ul örnek içine izopropanol 200 ul silika membran ile DNA adsorpsiyon optimize etmek için 600 ul QG tampon (kit verilen) ekleyin. QG tampon numunenin pH kolay belirlenmesi sağlayan bir pH indikatörü içerdiğini unutmayın. Numunenin rengi mor sarı çıkarsa (pH&gt; 7.5) karıştırıldıktan sonra, 3 M NaAcetate 10 ul örnek ve karıştırmak için (pH 5.2) ekleyebilirsiniz. Bu sütunda boncuk bağlayıcı DNA en üst düzeye çıkarmak için karışımın pH azaltır. </li><li> Sütun yüklemeden önce, herhangi bir SDS çökelti olup olmadığını belirlemek için karışımı kontrol edin. SDS yağış meydana gelmişse, örnek bir ısıtılmalıdır.42 ° C su banyosu çökelti kaybolana kadar. </li><li> Karışımı 700 ul QIAquick spin kolon (kit mor sütun) içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg&#39;de santrifüj. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın ve numunenin geri kalanı ile bu adımı tekrarlayın. </li><li> Sütun yıkamak için 500 ul QG tampon ekleyin. 2 dakika süreyle 14000 xg&#39;de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın. </li><li> Sütun üretici tarafından talimat olarak etanol eklendiği PE yıkama tamponu 700 ul (kit verilen) ile yıkayın. 1 dakika için 14000 xg&#39;de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın. </li><li> Sütun PE tampon kalanı tamamen kaldırmak için santrifüj adımı yineleyin. Üzerinden akışı ve toplama tüpüne atın. </li><li> 60 ul EB tampon (elüsyon tampon kiti) ekleyerek, yeni bir Eppendorf tüp içine sütun Zehir DNA. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg&#39;de santrifüjleyin. Elue edilmiş DNA tespiti kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. Kurtarılan malzemenin genellikle 260 okuma ~ kısım ortalama 6-7 ug toplam kurtarma için 90-120 ng / ul konsantrasyonları göstermektedir. Ancak, RNA örnek olduğunu düşündüren bu örnekler A 260/280 oranı, genellikle&gt; 1.8. Böylece atık DNA tam miktarı düşük olabilir. </li></ol> 9 - Kurtarılan DNA Analizi <ol><li> SDS PCR Taq polimeraz aktivitesini engelleyebilir. SDS PCR performans önce tamamen çıkarılmalıdır. 14000 xg&#39;de 1 dakika için 4 herhangi bir kalıntı SDS ve santrifüj ° C çöktürmek için buz üzerinde DNA inkübe edin. Yeni bir eppendorf tube.This adım süpernatant transfer şiddetle tavsiye edilir. </li><li> DNA Eluatlar geleneksel PCR ile analiz edilmesi için her sırası için spesifik primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (Q-PCR) tarafından da tespit edilebilir. Toplam DNA eluat 5-10 ul bir PCR veya Q-PCR reaksiyonu için kullanılıyor olabilir. PCR ile giriş kontrolü, diğer örneklerin miktarı ile karşılaştırıldığında DNA 5-10 kat seyreltme yapılabilir. Ancak, PCR ve Q-PCR koşulları değişecektir, başlangıç ​​materyalinin sınırlı miktarda ek PCR döngüsü gerektirir. Konvansiyonel PCR için 40 döngü ile başlayan ve gerektiği şekilde ayarlanması önerilir. </li></ol> 10 Temsilcisi Sonuçlar Biz E8.5 ve E9.5 embriyolar (Şekil 2) hem de ChIP gerçekleştirmek için bu protokol kullandık. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü mevcut olduğunu göstermektedir. ChIP saflaştırılmış DNA&#39;lar geleneksel PCR (Şekil 2A) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (Şekil 2B) tarafından analiz edildi. Buna karşılık, myogenin ifade değildir yolk kesesi, myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin hiçbir belirti yoktu. Interferon-γ (IFNγ) myogenin bağlayıcı site eşleşen dizileri içeren organizatörü, negatif bir dizi kontrol olarak kullanıldı. Beklendiği gibi, myogenin test edilen doku örneklerinde herhangi bir IFNγ organizatörü bağlı değildi. Iskelet kas öncüleri; E8.5 ve 9.5 embriyolar myogenin özellikle hücre grubu (6,10 Şekil 3) ifade edilir. Böylece sonuçları myogenin E8.5 ve E9.5 Somitlerin myogenin organizatörü bağlı olduğunu göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 E8.5 embriyo diseksiyonu. (A) İzole uterin horn (üst panel, alt panel gösterilen yüksek büyütme). (B) uterin horn, bireysel embriyoları içeren bireysel uygulama yerleri ayrı makasla kesilir. (C) Embriyolar Diseksiyon sırasında rahim dokusundan çıkıntılı. Oklar embriyoların hala ekstra embriyonik doku ile kaplı işareti. (D) İki aynı çöp E8.5 embriyolar. Soldaki embriyo dönüm süreci başlamamıştır. Sağdaki embriyo dönüm geçiyor. Uzak sağ temsilcisi E9.5 embriyo. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 ChIP tahlil E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin gösteren. Myogenin antikor veya non-spesifik IgG transkripsiyon başlangıç ​​sitesine myogenin organizatörü -79 - 69 göreli bir kısmını yükseltmek primerler ile yapıldı kullanarak ChIP deneylerden elde edilen arıtılmış DNA 5 ul (Üst) Konvansiyonel PCR analizi -12 veya IFNγ organizatörü ~ 1075 bp upstream transkripsiyon başlangıç ​​sitesinde yer alan myogenin bağlayıcı site ile eşleşen bir dizi içeren bir kısmını yükseltmek primerler bulunan bir myogenin bağlayıcı site içermektedir. IFNγ astar dizileri GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 &#39;ve 5&#39;-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3&#39;, 5&#39;-GCT edildi. (A) kullanılan aynı örneklerinin (Alt) Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR analizi.standart sapma - veri giriş + / -% olarak çizilir. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar Somitlerin ifade edilir. Tüm montaj myogenin in situ hibridizasyon Somitlerin spesifik mRNA ekspresyonu gösterir. 200 mikron - E8.5 görüntü Boyut bar. E9.5 görüntü Boyut bar - 500 mikron.

<ol>
	<li>Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epigenetic+alterations+to+chromatin+during+development.">Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development.</a> Genesis. 47, 559-572 (2009).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19, 425-433 (1999).</li><li>Johnson, K. D., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+long-range+transcriptional+mechanisms+by+chromatin+immunoprecipitation.">Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 27-36 (2002).</li><li>Yusuf, F., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eventful+somite:+patterning,+fate+determination+and+cell+division+in+the+somite.">The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite.</a> Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).</li><li>Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+skeletal+muscle:+from+somite+to+limb.">The formation of skeletal muscle: from somite to limb.</a> J Anat. 202, 59-68 (2003).</li><li>Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin,+a+factor+regulating+myogenesis,+has+a+domain+homologous+to+MyoD.">Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD.</a> Cell. 56, 607-617 (1989).</li><li>Edmondson, D. G., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+with+homology+to+the+myc+similarity+region+of+MyoD1+is+expressed+during+myogenesis+and+is+sufficient+to+activate+the+muscle+differentiation+program.">A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program.</a> Genes Dev. 3, 628-640 (1989).</li><li>Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+gene+disruption+results+in+perinatal+lethality+because+of+severe+muscle+defect.">Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect.</a> Nature. 364, 532-535 (1993).</li><li>Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+deficiency+and+neonatal+death+in+mice+with+a+targeted+mutation+in+the+myogenin+gene.">Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene.</a> Nature. 364, 501-506 (1993).</li><li>Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+myogenic+regulatory+factors+myogenin+and+MyoD1+during+mouse+embryogenesis.">Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis.</a> Nature. 341, 303-307 (1989).</li><li>Brennan, T. J., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+resides+in+the+nucleus+and+acquires+high+affinity+for+a+conserved+enhancer+element+on+heterodimerization.">Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization.</a> Genes Dev. 4, 582-595 (1990).</li><li>Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+enhancer+downstream+of+the+human+MLC1/3+locus+is+a+target+for+multiple+myogenic+determination+factors.">A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).</li><li>Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer.">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding.">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li><li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

University of Massachusetts Medical School IACUC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Açıklanan ChIP protokolde, miyojenik regülatör myogenin tek E8.5 ve E9.5 embriyolar bulunan, iskelet kas habercisi dokusunda myogenin organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalar yoğun, 11-20 hedef gen düzenleyici dizilerinin ilgili kısmı kodlama in vitro tercüme veya bakteriyel myogenin ve radyoaktif DNA kullanan in vitro jel vardiya deneylerde ilk başlayan, dizileri içeren E kutusuna bağlayıcı myogenin belirlemiştir . Konvansiyonel C...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

1-3 canlı hücreler bağlamında ortaya çıkan kromatin etkileşimleri: Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu teknik yaygın birincil doku, doku kültürü hücrelerinde daha az bir ölçüde istismar ve olmuştur. ChIP kemirgen embriyonik gelişimin erken dönemlerinde özellikle doku, uygulaması, sınırlı miktarda doku ve embriyonun hücre ve doku tiplerinin heterojenite karmaşıktır. Burada ayrışmış bir embriyonik gün 8.5 (E8.5) embriyo kullanarak ChIP gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Kromatin etkileşimleri tek bir E8.5 embriyo makaslanmış kromatin beş alikotları, denetimleri ve özel protein soruşturma için müfettiş yeterli malzeme sağlar içine kadar bölünmüş olabilir. Özellikleri, doku-spesifik gen ekspresyonu programlar sırasında kromatin etkileşimleri: Biz protein belge başlamak için bu tekniği kullanmış olması. Kromatin etkileşimleri tüm etkileşimler meydana olsun ayrım yapmadan, bir alt kümesidir, ya da tek bir hücre tipi (ler): Sonuç protein saptanması, çünkü bir embriyo hücre tiplerinin heterojenite mutlaka bu tekniğin uygulama kısıtlar. Ancak, sırasında doku spesifik genlerin incelenmesi veya doku belirli bir gen ekspresyonu başlangıcını izleyen iki nedenden dolayı mümkün. İlk olarak, doku spesifik faktörlerin immunoprecipitation mutlaka faktör ifade edilen hücre tipi kromatin izole eder. İkincisi, gen aktivasyonu ile ilişkili olan post-translasyonel modifikasyonlar içeren koaktivatörleri ve histon, immunoprecipitation sadece gen olan hücre tipi genler ve gen düzenleyici dizileri olmalıdır ya da aktif olmuştur. Tekniği, doku-spesifik gen aktivasyonu olayları incelemek için geçerli olmalıdır. Örneği aşağıda tarif edilen, bağlayıcı faktör incelemek için bir iskelet kas belirli bir gen promoter E8.5 ve E9.5 fare embriyoları kullanılmıştır. E8.5-9.5 4,5 Somitlerin, gövde, kol ve bacakların iskelet kaslarının formunu hangi habercisi dokularda bulunur. Myogenin iskelet kası farklılaşması 6-9 için gerekli düzenleyici bir faktör. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar kendi organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Myogenin sadece 6,10 gelişme bu aşamada Somitlerin ifade olduğundan, veri kendi organizatörü myogenin etkileşimleri zaten E8.5 embriyolar iskelet kas öncü hücrelerinde meydana gelmiş olduğunu göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Video: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biyoloji

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...