<p class="jove_content"&gt; Biz elektroporasyon gösterim amacıyla Dr Yuval Gottlieb-Dror teşekkür ederim. Bu çalışma İsrail&#39;de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitüsü ve Niedersachsen-İsrail Araştırma işbirliği programından DSD için hibe tarafından ve İsrail Bilim Vakfı, sağlık İsrail bakanlığı ve Mükemmeliyet Legacy Mirası Merkezi&#39;nden AK hibe tarafından desteklenmiştir Biyomedikal Bilim ortaklık.</p&gt;

1. Beyin Elektroporasyon 1.1 Yumurta taşıma <ol><li> Nemlendirilmiş bir inkübatör (37-38,5 ° C) yatay olarak yumurta yerleştirin. Embriyolar onlar 16-17 (HH) evre (25-30 Somitlerin) ulaştığınızda, inkübasyon 65-70 saat sonra electroporated vardır. </li><li> Inkübatör yumurta kaldırmak, onlar yatay konumda kalır. </li></ol> 1.2 Hazırlıklar <ol><li> Cam kılcal (0.5 mm çapında) çekin. </li><li> Puls üreteci için bir adaptör sahibi ile bükülmüş L şeklinde altın Genetrodes elektrotlar (3 mm çapında) bağlayın. Elektroporasyon parametreleri 25 volt, 5 darbe sayısının, 45 msn darbe uzunluğu, 300 msn darbe aralıklarla içerir. </li><li> Bir ağız pipet, 10 ml şırınga iğnesi, parafilm şeritler, yumuşak bir fırça, keskin diseksiyon makas ve 25 ml steril PBS çözeltisi hazırlayın. Bu miktar genellikle yumurta kabı (18 yumurta) işlemek için yeterlidir. </li><li> DNA plazmid yeterli bir karışımı (5 mg / ml her biri) hazırlayın veDNA enjeksiyon görselleştirmek için 0.025% Hızlı Yeşil boya hakkında ekleyin. Ortalama 4 ul bir hacmi bir tepsi enjeksiyon için yeterlidir. </li></ol> 1.3 Pencereleme, Enjeksiyon ve Elektroporasyon <ol><li> % 70 etanol ile yumurta kabukları temizleyin. </li><li> Havaya embriyonik maruz kalma süresi en aza indirmek için her seferinde bir yumurta tutun. </li><li> Makas uçları ile yumurta kutbunda bir delik açın ve şırınga ile albumin 3-4 ml kaldırın. Bu canlılığı azaltır olarak albümin daha büyük bir miktarda çıkarmayın. </li><li> Diseksiyon makas kullanarak yumurta kabuğu üst merkezinde küçük bir oval pencere (2,5 x 2 cm boyutlarında) açın. </li><li> Tüm süreç boyunca kuruyana önlemek için embriyonun üst PBS birkaç damla damla. </li><li> Bardağa DNA karışımı, az miktarda yük bir ağız pipet kullanarak kılcal. </li><li> Eğer yönelik arka ucu ile embriyo yerleştirin. Embriyo açıkça görünür olduğu gibi mürekkep püskürtme bu aşamada gereklidir. Mürekkep püskürtme artar kaçınmakembriyonik hayatta. ~ 45 ° kılcal tutarak kuyruk arka beyin nüfuz. Embriyo etrafında herhangi bir membran çıkarmayın. Hava kabarcığı oluşturmadan Beyin lümen ve nefes dikkatle DNA çözümü enjekte edilir. DNA çözüm öne yayılır. </li><li> Hemen DNA enjeksiyonu sonrası, kesin AP ve hedef hedefliyoruz DV Beyin pozisyonda paralel elektrotlar yerleştirin. Bu canlılığı azaltabilir gibi, kalp dokunmadan biraz ventral elektrotlar itin. Elektroporatör darbe. Elektrotlar (Şekil 1A) elektriksel iletkenlik belirtmek için kabarcıkları ile örtülmelidir. </li><li> Dikkatlice elektrotlar ve embriyo soğutmak için ve kabarcıklarını çıkarmak için PBS birkaç damla damla. Inkübasyon sırasında kurumasını önlemek için bir parafilm şeridi düzgün açılması yumurta Seal. Yumuşak bir fırça ile PBS içinde elektrotlar yıkayın. </li><li> Istenen zaman uzunluğu için inkübatör yumurta yerleştirin. Embriyoların hayatta kalma 2-3 gün sonra yaklaşık% 90elektroporasyon, ve 50% elektroporasyon takip eden 12 gün öncesine kadar azaltır. </li></ol> 2. Embriyolar Analizi 2.1 Düz montaj hazırlanması ve immunofloresan <ol><li> Beyin düz-montaj hazırlıkları kolayca bir mikroskop ya da stereo-mikroskop altında aksonlar görselleştirmek için E6.5 kadar yapılabilir. </li><li> Zarlarında ve kan damarları ayrılarak dikkatlice embriyo ayır. PBS içeren kaplı Petri kabı - küçük bir silikon embriyo yerleştirin. Dorsal karşı karşıya tungsten işaretçilerine ile çanak embriyo takın. Beyin keskin cam kapilerleri kullanarak çatı plakalı bir dorsal yarık gerçekleştirin. </li><li> Keskin cımbız ve mikro-makas kullanılarak başın üst kısmını tutun ve rostral gelen kaudal çok dikkatli bir şekilde arka beyin dokusu çekin. Beyin ayrılmasından sonra temiz bir hazırlık ulaşmak için kalan ventral doku çıkarın. </li><li> 4 Beyin inkübeOda sıcaklığında 1-2 saat boyunca% paraformaldehid (PFA) çözeltisi (RT). PFA kaldırmak için PBT (PBS/0.1% Triton X-100) ile arka beyin yıkayın. </li><li> Düz monte hindbrains içinde İmmünofloresan için engelleme çözüm 500 ul (4 ON 1. antikor ° PBT ile C Yıkama (15 dakika x 3) ile oda sıcaklığında inkübe az 2 saat PBT ve inkübe keçi serumu% 5 ekleyin. Inkübe oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 nci antikor ile. PBT (15 dakika x 3) ile yıkayın. </li><li> Bir cam slayt dorsal bakan arka beyin yerleştirin. Beyin üzerine floresan montaj medya ekleyin. Slaytta arka beyin düzleştirmek için cam kapiller veya tungsten iğne kullanın. </li><li> Kapak kayma ile doku sıkma önlemek için her köşesinde yağ az miktarda ekleyin. Beyin üstüne bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin ve hava kabarcıkları kaçının. Yapışma için cam kenarlarını kaplayacak şekilde tırnak cilası ekleyin. </li></ol> 2.2 Cryo-bölümleri ve İmmünofloresan <ol><li> Beyin sapı ca Cryo-bölümlerin aksonal yörüngeleri görselleştirmek için herhangi bir aşamada gerçekleştirilebilir. Ancak, E6.5 sonra bu çok kalın olur düz monte edilmiş embriyo, içinde aksonlar görselleştirmek için zorluk nedeniyle tercih edilen yöntem olmalıdır. Ayrıca, sinaps gösteri doku ve mikroskop altında bir yüksek büyütme bakış kesit gerektirir. </li><li> Embriyo incelemek ve tüm çevre dokulara çıkarın. PBS ile durulayın. Mikro-makas ve keskin cımbız kullanarak medulla kuyruk kısmında embriyo kesin. Beyincik ve orta beyin arasında geniş bir kesi yapmak ve tüm beyin sapı çıkarın. Doku medulla, pons ve beyincik içermelidir. </li><li> PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın, 4 gece için% 4 PFA (ON) ° C beyin sapı düzeltmek ve ON 4 ° C batan kadar% 30 sakaroz ile kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> OCT (Optimal Kesme Sıcaklık) bileşik bir cryo-kalıp Beyin Embed ve dondurma gibi başka bir yerde 11 açıklandığı kadar -20 ° C&#39;de yerleştirin. </li><li&gt; İstenen kesit eksende kriyostat içinde OCT blok yerleştirin. Kesit genişliği 12 mm. </li><li> Slaytlar kurulayın. Oda sıcaklığında 2 saat için her bir slayt üzerine 100 ul blokaj solüsyonu eklenir. Antikor 100 ul (istenen konsantrasyonu için engelleme çözeltisi içinde seyreltilmiş) ilave edilir. 1. ve 2. antikorlar için kuluçka süresi 4 de AÇIK sırasıyla oda sıcaklığında ° C veya 2 saat,. Her inkübasyon süresi için, hafifçe kuruluğu önlemek için slayt üstüne parafilm şeridi ekleyin. Antikorlar arasında PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın. Gerekirse, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde 1:1000 seyreltilmiş Dapi (4&#39;-6-Diamidino-2-fenilindol) ekleyin. PBS ile durulayın. </li><li> Floresan montaj medya ile slayt monte edin. Analizden önce 1 saat kurumasını bekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li><li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord.">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons.">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21 (2009).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain.">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining.">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm,+Pectinophora+gossypiella.">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li><li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis.">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li><li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain:+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition.">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li><li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain.">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li><li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content"Çıkar&gt; çatışması ilan etti.</p

Ovo elektroporasyon civciv sinir sistemi gelişimi 20 sırasında hücre özellikleri ve aksonal rehberlik incelemek için uygun bir, güvenilir ve etkili bir araçtır. Bu protokolde özel internöronlar koşullu etiketlenmesini sağlayan güçlendirici elemanlar kullanarak E2.75 de civciv Beyin içinde elektroporasyon bir modunu tanımlamak. Bu strateji embriyogenez ileri aşamalarında aksonal yolları, projeksiyonlar ve sinaptik siteleri izleme sağlayan civciv genom, yabancı genlerin eklemek i?...

Beyin artan ve nöron ağları inen ile merkezi ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişim kurarak sinir sisteminin önemli bir röle merkezi temsil eder. Bu solunum, bilinç, işitme ve motor koordinasyon 1-3 gibi temel fonksiyonlarını düzenler. Erken embriyonik gelişimi sırasında, omurgalı Beyin geçici farklı nöronal hücre tipleri oluşan ve çoklu beyin sapı çekirdekleri merkezleri 4 oluşturmak olduğu tekrarlayan rhombomeres, içine ön-arka (AP) ekseni boyunca bölünmüştür. Beyin de ayrık nöronal ataları belirtilen olmak ve farklı DV yerlerde 3,5,6 ayırt hangi bir bazal ve alar plaka, içine dorsal-ventral (DV) ekseni boyunca ayrılmıştır. Erken AP ve DV özel nöronal modelleri fonksiyonel beyin devrelerin kurulması yöneten nasıl büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu temel üzerinde bilgi sahibi olmaksoru, araçları erken Beyin nöronların belirli alt etiketlemek için ve daha ileri aşamalarında kendi aksonal yörüngeleri ve bağlantı takip etmek için gereklidir. Daha önce özel resim geliştirme elemanları kullanılan ve erken civciv embriyo 7-9 dorsal spinal internöron aksonal yörünge takip etmek için Cre / LoxP tabanlı koşullu ifade sistemi var. Mevcut yazıda; Beyin hedef ve değiştirilmiş bir elektroporasyon stratejisi ve piggyBac kullanarak, geç embriyonik arka beyin internöronlar, akson ve sinaptik hedefleri etiketleme için deneysel paradigma yükseltilmiş - aracılı DNA aktarılması. Yeni strateji 2 en fazla 12 gün arka beyin ve aksonal projeksiyonlar ve çeşitli embriyonik aşamalarında sinaptik sitelerin takibi bir tarafında belirgin nöronal alt tiplerinin etiketleme, elektroporasyon takip sağlar. Bu yöntem dayanarak, arka beyin internöronlar dorsal-en alt (dA1/Atoh1 + etiketli </skadar&gt; hücreleri) ve iki taraf artan aksonal projeksiyon modelleri ortaya, her bir ayrı kordon farklı bir AP konumu ve uzar kaynaklanmaktadır. dA1 akson proje ve işitsel çekirdekleri, orta beyin ve beyincik 10 çok katmanlı form sinaps bulunmuştur. Civciv elektroporasyon kombinasyonu, genetik nöronlar ve gelişme çok daha ileri aşamalarında projeksiyon sitelerinin analiz izleme beyindeki nöronal ağların oluşması ile çalışma ve devre oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için benzersiz bir platform sağlar.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

Piliç embriyonik nöral tüpün elektroporasyon gibi nöronal hücrelerde yabancı genlerin sentezlenmesi için hızlı ve verimli olması gibi birçok avantajı vardır. Bu yazıda biz, özel olarak nöronal ataları bir alt etiket için E2.75 de kuş Beyin içine DNA electroporate nasıl benzersiz gösteriyor yöntemi ve ne gelişme çok ileri evrelerde kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri takip etmek sağlamak kadar E14.5 için. Tabanlı plazmid ve arka beyin hücreleri (internöronlar, dA1 dorsal en alt grubu) bir alt GFP ifade sürücü piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi - Biz özel resim geliştirme elemanları, Cre / Lox dahil olmak üzere yeni genetik araçları kullanmış olurlar. Aksonal yörüngeleri ve dA1 akson hedefleri çeşitli beyin bölgelerinde erken ve geç embriyonik aşamalarında takip edilmektedir. Bu strateji embriyonik Beyin ilgi hücreleri hedef için ve tra için gelişmiş teknikler katkıdagelişim çeşitli aşamalarında devre oluşumu dans ediyorum.

Bu protokol son zamanlarda civciv Beyin 10 internöron dA1 alt grubu aksonal desen ve projeksiyon siteleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Özellikle bu aksonlar etiketlemek için, önce spinal DI1 nöronlar 8,12,13 için özel olarak karakterize edilmiş bir arttırıcı elemanı (Atoh1), arka beyin dA1 hücreleri 10 olarak ifade edilmesi doğrulandı. Eleman Cre recombinase ve plazmid bir Cre bağımlı sitoplazmik GFP muhabiri (; Şekil 1BI pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Video: Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Nörobilim

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

Farklı bölge ve lamina gelişmekte olan ve yetişkin beyninin ortaya çıkarmak için sinaptik çinko Histochemistry kullanımı

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...