This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

Not: Bu faktörler büyük kalitesi, değişkenlik ve AWF verimi (Şekil 1) etkileyebilir gibi yaprak malzeme ve bitki büyüme koşullarının standardizasyonu başlangıç ​​seçimi kritiktir. Dikkate parametreler Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir ve tartışma daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parametre </td><td colspan="3"> Örnek standardına </td></tr><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris </td><td> Solanum lycopersicum </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> Yaprak tipi </td><td> Ilk gerçek yaprak tam olarak genişletilmiş, sağlıklı </td><td> Alttan başlayarak 2. ve 3. yaprakları, 4 büyük broşürler apoplastı çıkarımı için kullanılan değil apikal broşür alınan </td><td> Tamamen genişletilmiş rozet yaprakları </td></tr><tr><td> Bitki yaşı </td><td> 21 gün </td><td> 7-9 hafta </td&gt; <td> 7 hafta </td></tr><tr><td> Günün Saati </td><td> Işık dönemi Orta (00:00) </td><td> Işık dönemi Orta (00:00) </td><td> Işık dönemi Orta (00:00) </td></tr><tr><td> Hidrasyon </td><td> Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan </td><td> Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan </td><td> Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan </td></tr><tr><td> Işık </td><td> 16 saat ışık, 400 umol m -2 sn -1 </td><td> 16 saat ışık, 400 umol m -2 sn -1 </td><td> Haftada 2 den 10 saat ışık (kısa gün), 400 mmol m -2 sn -1 </td></tr><tr><td> Nem </td><td> % 70 </td><td> % 70 </td><td> % 70 </td></tr><tr><td> Sıcaklık </td><td> 22 ° C Hafif, 18 ° C karanlık </td><td> 22 ° C Hafif, 18 ° C karanlık </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> Standart parametre tek Tablo 1. ÖrnekAWF çekimlerinde kullanılan yaprakları için ters. 1. Yaratma apoplast Yıkama Sıvı NOT: enfekte yapraklardan mikrobiyal patojenler inculding bu protokol tehlikeli materila sırasında boşa yıkanıp edilmemelidir; oldukça uygun bertaraf işlemleri kullanılmalıdır. <ol><li> Yaprak boyutuna göre aparatı seçin: <ol><li> Bir iğnesiz şırınga kullanarak küçük yaprakları (örneğin, Arabidopsis, fasulye) sızmak. Bir şırınga sığmayacak kadar büyük olan yaprakları sızmak için bir termos kullanın. Aynı anda birden fazla yaprak sızmaya termos yöntemini kullanın. </li><li> Bir jilet kullanarak küçük bölümlere mevcut infiltrasyon yöntemi için çok büyük yaprakları bölün. Damıtılmış su içinde iyice kesilmiş durulama yaprak bölümleri önce hasarlı hücrelerden terlemek sitoplazmik kirleri çıkarmak için süzülme için. </li></ol></li><li> 60 ml&#39;lik bir şırınga kullanılarak yaprağı süzme: <ol><li> Dan yaprak ayırınBir jilet kullanarak yaprak sapı bitki. Domates gibi bileşik yaprakları için, petiolule de broşürler ayırın. </li><li> Yaprak yüzey kirleri çıkarmak için distile su içinde dalma taze kesilmiş yaprak durulayın. Hafifçe emici dokusu veya kağıt ile lekeleme ile yaprak kurulayın. </li><li> Infiltrasyon önce yaprak ağırlığını ölçün. </li><li> Dikkatle döndürün ve / veya bir 60 ml şırınganın içine yaprak katlama ve damıtılmış su ile doldurun şırınga (diğer infiltrasyon sıvılar açıklamalara bakın kullanılabilir). Yaklaşık 40 ml işaretine pistonu düşürürken şırınga içinde herhangi bir hava çıkarma. </li><li> Eldivenli parmak veya Parafilm bir parça ile ya şırınga ucu Kapak, daha sonra 60 ml işaretine dışarı pistonu çekerek şırınga içindeki negatif basınç oluşturmak. Pistonu yavaşça serbest bırakın. NOT: hücre parçalama ve sitoplazmik kirlenmesine neden olabilir basıncı serbest Çabuk. </li><li> Şırınga ucu çıkarın ve herhangi bir hava çıkarma, sonra ucu ve basın replugpistonu ileri aşağı pozitif basınç mütevazı bir miktarda oluşturmak için. </li><li> Sızmış alanların karanlık renk ile görüldüğü gibi yaprak tamamen sızmış kadar 1.2.6 - Tekrar 1.2.5 adımları. </li><li> Şırınga yaprak çıkarın. Yavaşça ama iyice yüzey sıvıyı çıkarmak için emici kağıt yaprağı kurulayın. </li><li> Infiltre yaprak ağırlığını ölçün. Önce ve yakından sızma hacmini yaklaşan sızma sonra ağırlık farkı hesaplayın. </li></ol></li><li> Termos ile Yaprak infiltrasyonu: <ol><li> Bir jilet kullanarak yaprak sapı ile bitkiden yaprak ayırın. </li><li> Yaprak yüzey kirleri çıkarmak için distile su içinde dalma taze kesilmiş yaprak durulayın. Yavaşça emici kağıt blot yaprak kurulayın. </li><li> Infiltrasyon önce yaprak ağırlığını ölçün. </li><li> 250 ml veya daha büyük yan kol şişe co (birden çok yaprakları infiltre ise ya bırakır) yaprak yerleştirindamıtılmış su ntaining (diğer infiltrasyon sıvıları açıklamalara bakın kullanılabilir). Tamamen sıvı ile yaprakları kapsar. </li><li> Balona bir vakum uygulayın. Yavaşça yapraklarından hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalkalayın. Dikkatlice ve yavaşça vakumu boşaltmak. Not: hızlı bir şekilde vakum serbest hücre lizizi ve sitoplazmik kirlenmesine neden olabilir. </li><li> Sızmış alanların karanlık renk ile görülen yaprak kadar adımı yineleyin 1.3.5 tam sızmış edilir. </li><li> Şişeden yaprak çıkarın. Yavaşça ama iyice yüzey sıvıyı çıkarmak için emici kağıt yaprağı kurulayın. </li><li> Infiltre yaprak ağırlığını ölçün. Önce ve yakından sızma hacmini yaklaşan sızma sonra ağırlık farkı hesaplayın. </li></ol></li><li> Santrifüj ile AWF geri kazanımı: <ol><li> 4 inç (10 cm) genişliğinde Parafilm bir parça üzerinde yaprak yerleştirin. 5 ml&#39;lik bir pipet (ya da benzer boyutlu bir nesne) kullanılarak,Parafilm içinde yaprak rulo. </li><li> 20 ml&#39;lik enjektöre pipet ile sarılmış yaprak yerleştirin. Yukarı bakacak şekilde herhangi bir kesim yaprak kenarları yerleştirin. Temiz bir 50 ml&#39;lik polietilen veya polikarbonat tüp içine şırınga yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;da bir sallanan kepçeli rotor içinde 1000 x g&#39;de 10 dakika süre ile boru içinde şırınga santrifüjleyin. Not: santrifüj aşağıdaki yaprakların Görsel muayene sızma sıvının çoğunluğu sınır dışı edildiğini açığa çıkarmalıdır. Koyu yeşil yamalar ek santrifüj süresi gerekli olduğunu göstermektedir. </li><li> Yeni bir 1.5 ml tüpler içinde geri AWF Pipet. NOT: AWF hacmi yaklaşık bu yaprak için sızma hacmini aynı olmalıdır; hacim, ek santrifüj zaman daha az ise veya santrifüj hızı gereklidir. </li><li> 5 dk herhangi bir hücre veya partikül madde kaldırmak için 15.000 xg&#39;de AÇD örnekleri santrifüj. Seçenek olarak ise, remo 0.22 um filtre içinden AWF geçmesihücreleri ve partiküler madde ettik. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant Pipet. Depolama kadar buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> -80 ° C&#39;de AWF örnekleri saklayın. </li></ol></li></ol> Sitoplazmik Zehirlenme 2. Tahliller <ol><li> Santrifüj adımlar tamamlandıktan hemen sonra enzimatik reaksiyonları (örn, proteoliz) en aza indirmek ve analizleri gerçekleştirmek için buz üzerinde AÇD örnekleri tutun. Not: metabolit analizi için, numuneler hemen ekstre sonra dondurulabilir ve kullanılana kadar -80 ° C&#39;de saklandı. </li><li> Standart malat dehidrogenaz için (MDH) tahlil protokolü 15 bakınız; Aksi takdirde, bir ticari olarak temin edilebilir MDH deney kiti kullanmak. </li><li> Standart glikoz-6-fosfat dehidrogenaz için (G6PDH) tahlil protokolü 16 bakınız; Aksi takdirde, bir ticari olarak temin edilebilir G6PDH deney kiti kullanmak. </li><li> Örneğin glikoz-6-fosfat (G-6-P), GC-MS kullanımı gibi sitoplazmik metabolitlerin miktarının, adım 5&#39;te tarif edildiği gibi </stro&gt; ng. Aksi takdirde, G-6-P doğrudan tahlil için ticari olarak mevcut bir kit kullanılır. </li></ol> Apoplast Seyreltme Faktörü 3. Hesaplama <ol><li> Adım 1.2.4 veya 1.3.4 (örneğin, distile su) yukarıda kullanılan sızma sıvı iki cilt hazırlayın. 50 uM bir nihai konsantrasyona kadar bir çözeltisine Indigo Carmin tozu eklenir diğer hiç katkıda bulunmazlar. </li><li> Bir levha okuyucu ile Indigo Carmin infiltrasyonu çözeltisi 200 ul 610 nm (OD 610) de absorbansı ölçülür. Indigo karmin olmadan OD infiltrasyon solüsyonu 610 200 ul çıkarılarak bu değeri düzeltin. Aşağıdaki denklemi içine OD 610infiltrate olarak bu düzeltilmiş değeri değiştirin. </li><li> (Ve indigo carmine almadan) infiltrasyon çözümleri ile (adım 1.2 veya 1.3), yukarıdaki gibi en az üç kopya yaprak sızmaları yapın. </li><li> Infiltrasyon, r sonradamıtılmış su içinde yaprakların böcek ö dış yüzeyleri üzerinde herhangi bir geri kalan Indigo Carmin uzaklaştırmak üzere. </li><li> (Aşama 1.4), yukarıdaki gibi santrifüj ile devam edin. </li><li> Ortalama OD indigo karmin AÇD çekimi 610 200 ul belirleyin. Indigo karmin ücretsiz AWF 200 ul ortalama OD 610 değeri çıkarılarak bu değeri düzeltin. Aşağıdaki denklemi içine OD 610AWF olarak bu düzeltilmiş değeri değiştirin. </li><li> Olarak düzeltilmiş absorbans değerleri seyreltme faktörü (yani, seyreltme kat) hesaplayın: Apoplastı seyreltme faktörü = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) </li><li> Seyreltme faktörü ile AWF gelen çarpın konsantrasyon veya etkinlik değerleri planta&#39;daki apoplastik sıvıda konsantrasyon / aktiviteyi tahmin etmek. </li></ol> Freeze Kurutma Full Strength AWF 4. Konsantrasyon <ol><li> Donma-kurutucu ve a aççalışma sıcaklığı ve basıncında stabilize için llow. </li><li> Taze veya depolanmış AÇD numunelerinin istenilen miktarda Havuz. </li><li> 2 ml santrifüj tüplerine arasında eşit örnekleri dağıtın. </li><li> Sulandırma hacmi belirleyin: Sulandırma hacmi = dondurularak kurutma / apoplastı seyreltme faktörü önce volüm </li><li> Kapaklarının kapalı, sıvı azot tüpleri dondurma. </li><li> Bir veya daha fazla soğutulmuş dondurarak kurutma gemilere donmuş tüpler aktarın. Tüpler aktarırken, gaz alışverişini sağlamak için keskin bir nesne ile deldi olmuştur biriyle kapağı değiştirin. </li><li> Donma-kurutucu gemileri takın ve tamamen örnekleri lyophilize. </li><li> Makinenin numune alın ve damıtılmış su hesaplanan miktarının eklenmesiyle AWF sulandırın. </li><li> Delinmemiş kapağını çıkarın ve -80 ° C&#39;de örnekleri saklayın. </li></ol> Gaz Kromatografi Kütle Spektrometresi 17 ile 5. metabolit Analizi &lt;ol&gt; <li> 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine AWF Pipet 200 ul </li><li> Bir iç standart olarak 10 ug / ml ribitol ihtiva eden metanol içinde 700 ul ekle. </li><li> 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtın. </li><li> 11000 x g&#39;de 10 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe yüzer 700 ul aktarın. </li><li> 10 saniye soğuk kloroform ve vorteks 375 ul ekleyin. </li><li> 10 saniye DH 2 O ve vorteks 500 ul ekleyin. </li><li> 2,200 x g&#39;de 15 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine, üst sulu tabaka 150 ul transfer sonra ısı olmadan bir vakum yoğunlaştırıcısı tamamen örnekleri kurutun. </li><li> 20 mg / ml metoksiamin hidroklorür içeren piridin 30 ul numune içinde çözülür. </li><li> 2 saat boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalayarak 70 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifloroasetamid) 50 ul ekle. </li><li> 30 dakika boyunca çalkalayarak 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Aktarım örnekleri GC-MS için compatible cam şişe. </li><li> Örneklerin GC-MS analizi yapın. Lisec ark bakın. 2009 17 GC-MS ekipman kurulumu ve performans ile ilgili ayrıntılar için. </li></ol>

<ol>
	<li>Felle, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+during+low-oxygen+stress+in+barley.">Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley.</a> Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).</li><li>Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-M&#252;ller, J., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arbuscular+mycorrhization+by+apoplastic+invertases:+enhanced+invertase+activity+in+the+leaf+apoplast+affects+the+symbiotic+interaction.">Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction.</a> The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).</li><li>Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transpiration+rate.+An+important+factor+controlling+the+sucrose+content+of+the+guard+cell+apoplast+of+broad+bean.">Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean.</a> Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).</li><li>Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+the+plant+apoplast+by+plant+pathogenic+bacteria.">Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria.</a> Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).</li><li>Rico, A., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+uses+constitutive+and+apoplast-induced+nutrient+assimilation+pathways+to+catabolize+nutrients+that+are+abundant+in+the+tomato+apoplast.">Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).</li><li>Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nutrient+supply+of+pathogenic+fungi;+a+fertile+field+for+study.">The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study.</a> Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).</li><li>Brunner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+plants+and+animals:+emerging+parallels+between+the+recognition+of+general+elicitors+and+pathogen-associated+molecular+patterns.">Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).</li><li>Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+leaf+scald+(Xanthomonas+albilineans)+on+polyamine+and+phenolic+acid+metabolism+of+two+sugarcane+cultivars.">Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars.</a> European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).</li><li>Mill&#225;n, A. F., Morales, F., Abad&#237;a, A., Abad&#237;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+iron+deficiency+on+the+composition+of+the+leaf+apoplastic+fluid+and+xylem+sap+in+sugar+beet.+Implications+for+iron+and+carbon+transport.">Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport.</a> Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).</li><li>Dragi&#353;i&#263; Maksimovi&#263;, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filter+strip+as+a+method+of+choice+for+apoplastic+fluid+extraction+from+maize+roots.">Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots.</a> Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).</li><li>Baker, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+standard+technique+for+improved+quantitative+analysis+of+apoplastic+metabolites+in+tomato+leaves.">An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).</li><li>Nouchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+difficulties+in+collecting+apoplastic+fluid+from+rice+leaves+by+the+infiltration-centrifugation+method.">Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).</li><li>Boudart, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+proteins+in+apoplastic+fluids+of+Arabidopsis+thaliana+rosettes:+identification+by+mass+spectrometry+and+bioinformatics.">Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics.</a> Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).</li><li>Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+infiltration-centrifugation+technique+appropriate+for+the+isolation+of+apoplastic+fluid?+A+critical+evaluation+with+different+plant+species.">Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species.</a> Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).</li><li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+Dehydrogenase.">Malate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).</li><li>Lohr, G. W., Waller, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+Dehydrogenase.">Glucose-6-phosphate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).</li><li>Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography+mass+spectrometry-based+metabolite+profiling+in+plants.">Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants.</a> Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).</li><li>Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+and+bound+apoplastic+activity+for+peroxidase,+beta-d-glucosidase,+malate+dehydrogenase,+and+nonspecific+arylesterase,+in+barley+(Hordeum+vulgare+L.)+and+oat+(Avena+sativa+L.)+primary+leaves.">Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves.</a> Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).</li><li>Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+tobacco+leaf+apoplast+proteome+in+response+to+salt+stress.">Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress.</a> Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).</li><li>Shabab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+effector+protein+AVR2+targets+diversifying+defense-related+Cys+proteases+of+tomato.">Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato.</a> Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).</li><li>Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+in+the+free+space+of+growing+stem+tissues.">Solutes in the free space of growing stem tissues.</a> Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).</li><li>Husted, S., Schjoerring, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+and+ammonium+concentration+in+leaves+of+Brassica+napus.">Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus.</a> L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).</li><li>Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+converts+indigo+carmine+to+isatin+sulfonic+acid.">Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).</li><li>Bournonville, C. F. G., D&#237;az-Ricci, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+superoxide+in+plant+leaves+using+a+modified+NBT+staining+method.">Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method.</a> Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).</li><li>Speer, M., Kaiser, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+relations+of+symplastic+and+apoplastic+space+in+leaves+from+Spinacia+oleracea+L.+and+Pisum+sativum+L.+under+salinity.">Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity.</a> Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Bitki doku kaynağı Optimize Apoplastı çekimi yaparken Biyolojik ve teknik varyasyon büyük olabilir, böylece bir çok standart iş akışı (Şekil 1) deneyler arasında sürekliliği artırmak için yararlıdır. Önemli bir şekilde, bitki doku kaynağı yaprak tipi, yaprak yaşı, büyüme ve / veya çevresel koşullar ve gün (Tablo 1) zaman da dahil olmak üzere, standardize edilmelidir. Büyük farklılıklar yaprakları sızmış ve AÇD sonra santrifüj kurtarıldı hangi ile kolaylığı var; Bu farklılıklar stoma sayısı, açıklık boyutu ve mezofil direnci 12,14 ile ilişkilidir. Hatta P. farklı çeşitler arasında kolaylık ve AÇD çıkarma işleminin verimi büyük farklılıklar vardır vulgaris; Burada kullanılan Tendergreen çeşitli örneğin yaprak Kanada Wonder çeşidinde göre, bu yöntemi kullanarak AWF ekstre için daha uygundurlar. IçindeP. apoplastik ekstraksiyon için onlara bariz bir seçim yapmak, ilk gerçek yaprakları sızmak için en büyük ve en kolay vulgaris. apoplastik hava ve su hacmi AWF ekstrakte 12,14 farklılıklara yol açan çeşitli türlerde yaprak yaşma gösterilmiştir. P. vulgaris, yaşlı yapraklar önemli ölçüde daha zor sızmak ve santrifüj üzerine az AWF elde haline; tam genişleme eriştiğinde, bu nedenle yaprakları hasat edilmiştir. sonradan sızmak AWF kurtarmak için yüksek santrifüj hızları gerektiren zor Yapraklar. Bir nedenle dikkatli büyük ölçekli AÇD çekimi için bir doku kaynağı üzerine karar vermeden önce birkaç farklı yaprak türleri ve çeşitleri ekran gerekir. Bitki büyüme koşulları da deney kapsamında mümkün olduğu kadar standardize edilmelidir. Onlar izin gibi büyüme dolapları kullanılması tercih edilir tutarlı nem, sıcaklık ve aydınlatabilirizt yoğunluğu alayları muhafaza edilmesi. vb metabolitler, enzimler, konsantrasyonları gündüz döngüsü 14 boyunca değişir, çünkü yaprakların hasat her zaman günün aynı saatinde meydana gelmelidir. Son olarak, bitki benzeri tüm turgor basıncı bırakır sağlamak için, bitkiler (~ 1 saat) hasattan önce yakında sulanmalıdır. Yaprağı süzme ve santrifüj optimizasyonu Hücreler tarafından karşılaşılan mekanik gerilim infiltrasyonu veya santrifüj adımları sırasında çok yüksek ise, azalan kısmi hücre lizisine AWF istenmeyen sitoplazmik kirlenme neden olur. Bu nedenle, belirli bir yaprak türü için prosedür verimi maksimize ve AWF sitoplazmik bulaşmasını en aza arasındaki optimize edilmiş ticaret-off olmalıdır. Her durumda, bir AWF yaprak hücrelerinin olası mekanik kesintileri önlemek için telafi edilebilir ki en düşük santrifüj hızı kullanmalısınız. Santrifüj OptimizasyonuNavigasyon hızda santrifüj hızlarının bir aralığında geri hacmi ve kirlenme apoplastı izleyerek, her bir yaprak tipi için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Bu tür MDH, G6PDH ve glukoz-fosfat izomeraz olarak bu işaretleyici enzim aktiviteleri tespit edilmiştir, bu aktiviteler ki tahminen bu, sitoplazmik sızıntı 9,12,14 için, hızlı bir artış yukarıda aştı bir eşik merkezkaç kuvvetine kadar düşüktür. Baker ve diğ. 2012 11 tarafından belirtildiği gibi santrifüj aşaması esnasında destek Parafilm kullanımı, AWF ekstraksiyon etkinliğini geliştirebilir ve aşırı katlama ve sıkıştırma neden olduğu yaprak bıçağı mekanik hasara en aza indirebilir. Bir AWF ekstraksiyon hasar ve bütünlüğü için yaprak incelemek gerekir Dahası, Parafilm kullanımı santrifüj sonra yaprak görselleştirme geliştirir. Nouchi 12 d vardır kesim pirinç yaprağı bölümlerden gelen AWF kurtarma optimizasyonu tarififficult sızmak ve küçük olmasından dolayı stoma açıklıklar AWF toplamak için yüksek santrifüj hızları gerektiren. Pirinç yaprağı yüzeyinin ıslanma ya damıtılmış su içinde yaprakları veya sızma sıvısına bir yüzey aktif madde ilave edilmesini, önceden ıslatma ile geliştirilmiş, infiltrasyon işlemi kolaylaştırılır. Apoplastik kontaminasyon 12 izlerken daha yüksek santrifüj hızı (6,000 xg) de kullanıldı. Kesme yaprak bölümleri kullanırken sitoplazmik kirlenme bile yara sitelerinin geniş yıkama ile daha yaygın olacağı riski her zaman vardır; kesilmiş yaprak, bu nedenle sadece gerektiğinde kullanılmalıdır. Birçok çalışmada için damıtılmış su, sızıntı sıvısı 11 olarak kullanılır. Ancak, bu bileşiklerin belirli apoplastik bileşikler, özellikle proteinlerden 13 çıkarılmasını artırmak için, bu tür tuzlar ya da tampon olarak, sızma sıvısına ilave edilebilir. Lohaus 14 o iyonik ve ozmotik kuvvet etkisi değerlendirildin kurtarıldı AWF kompozisyonu ve ihmal olarak bulundu. Infiltrasyon ortamının pH değişiklikleri, ancak, AWF bileşim 14 etkileyebilir. Ekstre apoplastik sıvının Uygun kullanım ve depolama önemlidir. AWF bir proteaz ve diğer enzimler 13,20 bolluğu, aynı zamanda uçucu organik bileşikler içeren gösterilmiştir. Bu nedenle, buz üzerinde ya da başka şekilde, -80 ° C&#39;de depolanmış numune tutulması tavsiye edilir iyileşme sonrası AWF bileşimi değişiklikleri azaltır. Ekstraksiyon, proteoliz, uzun süreli seyreltme enzimi etkisiz hale sınırlamak veya dondurarak çözülme sonrası Ayrıca, AWF enzimatik deneyler, en kısa sürede yapılmalıdır. infiltrasyon işlemi apoplastik sıvıyı seyreltilir ve bu seyreltme derecesinin tespit edilmesi için gerekli olabilir. santrifüjleme aşaması, aynı zamanda, hücre içi bölmelerin su ile AWF seyreltik olabilir. Bir seyreltme faktörü ihtiyaç vardırölçümler AWF üzerinde yapıldığında ed in vivo apoplastı kimyasal konsantrasyonlarını tahmin etmek. Böylece mümkün olduğu kadar doğru in vivo metaboliti konsantrasyonlarda eşleşen - Bir seyreltme faktörü de mikroplar için büyüme ortamı taklit bir apoplast olarak kullanılan zaman tam gücü geri AWF konsantre gereklidir. Çeşitli varyasyonlar süzülme sıvısına ilave bir işaret bileşiğinin seyreltme ölçülerek AWF seyreltme faktörünü belirlemek için, aşama 4&#39;te tarif edilen yöntem ile ilgili bulunmaktadır. Tüm yöntemler için AÇD seyreltme hesaplama sızma sıvı kayda değer emilir veya AÇD kurtarma işlemi sırasında yaprak hücreleri tarafından seyreltilmiş olmadığını varsayar. Bu varsayım, daha önce sızma adım 14 doğrulanmıştır ama santrifüj aşaması için doğrulanmamış olduğunu. işaretleyici Bileşik ayrıca, emilen taşınan veya apoplast olarak süre modifiye edilmemelidir. Indigo karmin en yaygın kullanılan ve iyice kullanılan boyaların test edilirAWF seyreltme hesaplamalar için. Indigo Carmin katyon değiştirme reçinesi ve izole edilmiş bir hücre duvarları için düşük bir emicilik gösteren ve Brassica napus AWF hesaplamalar, Pisum sativum, Solanum esculentum Mill ve Glycine max 11,21,22 için uygun olduğu gösterilmiştir. Ancak, bazı yaprak tipleri, örneğin, pirinç ve salatalık, indigo karmin tam AÇD seyreltme faktörü 12,21 küçümsenmesi yol açacak sızma, sonra kurtarılamaz çıktı. karşı hassas oluşudur özellikle stres 24 altında, apoplast üretilen bilinmektedir süperoksit 23 ile izatin sülfonat içine yarığa için indigo carmine geri kazanımı eksikliği nedeniyle olabilir. Izatin sülfonat içine indigo carmine klevajı 610 nm&#39;de absorbans bir kayıp ve 245 nm &#39;de bir artışa neden olacaktır. Bu reaksiyon, apoplast kayda değer bir ölçüde oluşur olsun, ya da, bu reaksiyon infiltre süperoksit süpürücü olarak inhibe olup olmadığınıiyon sıvı bugüne kadar araştırılmamıştır. AWF kendi istikrar ve iyileşme bildirilmemiştir olsa mavi dekstran pirinçte AÇD seyreltme faktörü ölçümü için yerine indigo karmin kullanılan olmuştur, 12 bırakır. Seçenek olarak ise, örneğin [14C] sorbitol ya da başka ölçülebilir, iç standart olarak radyo-etiketli bileşikler, yerine boyalar ve radyoaktif ya da konsantrasyon ölçüldü ve benzer bir şekilde 11,14,25 seyreltme faktörünü hesaplamak için kullanılan azalma kullanılabilir. Tekniğin Sınırlamalar Birkaç uyarılar sızma-santrifüj AÇD izolasyon yöntemi var. İlk olarak, sızma sırasında apoplast seyreltme bitkisinden bir tepkisi olabilir. Çevredeki yaprak hücreleri apoplastik sıvının belirli bileşenleri için bir azalmış konsantrasyon tespit ederse, onlar metaboliti konsantrasyonlarının yorumunu bozan, daha metabolitleri salgılayan ile yanıt verebilir. IçindeBu sorunun bir değerlendirme de infiltrasyonu ve santrifüj veya süzme sıvısının iyon gücü orta farklar arasındaki zaman ne ekstre AWF 14,22 bileşimini etkili olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, seyreltme düşünülen apoplastı kaynaklanan herhangi eserler az olması. İkinci bir sakınca santrifüjle AWF elüsyonu çeşitli nedenlerle apoplast içinde mevcut olan bütün moleküller yakalayamaz olmasıdır. Özellikle katyonları ve proteinler bazı bileşikler, sıkı bir şekilde negatif yüklü hücre duvarı ile ilgili ve AWF 13 ile elüte olmayan olabilir. Proteinler gibi diğer moleküllerin 14 kullanılan santrifüj hızlarında apoplast dışarı verimli Zehir için çok büyük olabilir. Reaktif oksijen türlerinin, önemli apoplast üretilen bileşik sınıfı, fakat bu bileşiklerin kısa süreli olması nedeniyle, ve bunların üretimi için tanımlanmamış gereksinimleri, pr vardıresence iyi AWF çıkarma tarafından yakalanan değildir. Bu AWF apoplastı sıvının in vivo bileşimi temsil eder ve bu türler arasında değişebilir ne kadar doğru bilinmemektedir. Birkaç tahliller hiçbiri evrensel olarak kabul edilir olsa da, sitoplazmik kontaminasyonu belirlemek için var. Ağırlıklı sitoplazmik enzimlerin Tahliller (örneğin, G6PDH, heksoz fosfat izomeraz, MDH) gerçekleştirmek kolay olmanın yararı var ama sitoplazmik sızıntı 14,18 ile iyi bir korelasyon olmayabilir. sitoplazmik metabolitleri (örneğin, heksoz fosfatlar, klorofil) değerlendirilmesi belki de daha göstergesidir ama daha az iyi 11 kurulmuştur. Bununla birlikte, deneyin ya türü örnekleri arasında apoplastik kirlenme nispi ölçümü için yararlı olabilir. İdeal olarak, birden fazla bağımsız ölçümler AWF numunenin bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır. Sınırlamaları kabul etmekle birlikte, sızma-centrifugatiBurada tarif edilen tekniği apoplastik proteinler, birincil ve ikincil metabolitleri ve inorganik iyonların çalışmada basit ve sağlam bir teknik olarak yerini korumaktadır.

<html> Bitki apoplastı bitki hücrelerini çevreleyen hücreler arası bir alandır. Bu, birçok metabolik ve taşıma işlemleri yer aldığı dinamik bir ortamdır. apoplast önemli yapısal bileşeni monte ve apoplast içinde bulunan enzimler, yapısal proteinler ve metabolitler tarafından değiştirilmiş hücre duvarı vardır. Sağlıklı bitki hücrelerinde apoplastı genellikle amino asitler, şekerler ve diğer besinler ile H + symport 1 ile sitoplazmaya apoplast ithal sağlayan asidik bir halde muhafaza edilir. Sükroz nakliye, apoplast boyunca ve floem damar içine fotosentetik kaynaklardan sükroz taşıma sırasında; sakaroz sonra lavabo organlarının 2 sükroz bölünmesiyle apoplastik invertases tarafından tutulan ozmotik potansiyeli taşınır. Şekerler ve diğer besinler de yukarı doğru taşınır ve terleme akışı 3 ile stoma boşluklarında birikir olabilir. &quot;&gt; Apoplastı birçok patojen kendi parazitik yaşam tarzı kurmak bir çevre niş temsil eder. Bakteriyel bitki patojenleri böyle stoma veya yaralar 4 ile doğal deliklerden erişmek apoplast yüksek yoğunluklarına için çoğalabilen. Amino konsantrasyonu asitler ve bakteriyel ve mantar hastalıklarına 5,6 beslenme ihtiyaçlarını desteklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir apoplastı domates diğer azot bileşikleri. mikrobiyal patojenlere karşı birincil savunma tepkileri ayrıca, apoplast hücre dışı peroksidazlarla reaktif oksijen türlerinin üretimi, yani meydana . ve oksidazlar ve çapraz-bağlama ve kaloz birikimi 7 ile sağlanan hücre çeperinin güçlendirilmesi bitki hücre duvarı, anti-mikrobik aktiviteleri ile ikincil metabolitlerin açısından zengindir; bu ikincil metabolitlerin biyo-kimyasal yapısı türleri 8 arasında değişir. Yukarıda söz sonucundaEd ve diğer işlemler, yaprak apoplastik sıvı proteinler, şekerler, organik asitler, amino asitler, ikincil metabolitlerin, metaller ve diğer katyonlar (örneğin, Mg + 2, K +, Na +, Ca + 2, Fe 2/3 çeşitli içerir +). Sürgünler apoplast içinde çözünen konsantrasyonu apoplast ve ksilem, floem ve sitoplazma 9 arasında meydana gelen ulaştırma süreçlerinin dengesi büyük ölçüde kontrol edilir. Ancak, metabolik reaksiyonlar ve mikrobiyal büyüme de tüketmek veya apoplastik solütleri üretmek. apoplast bileşimi bitki türleri ve genotipler arasında ve hafif, beslenme ve biyotik ve abiyotik streslere 9 olmak üzere değişen çevre koşullarına tepki olarak farklılık bilinmektedir. Apoplast bileşimini inceleyerek ve bu tür redoks ve ozmotik potansiyeli, pH, besin / metaboliti kullanılabilirliği ve enzimatik faaliyetleri gibi özellikleri de dahil olmak üzere, nasıl değiştirdiğini, bir bitki yeniden nasıl yeni bakış açıları kazanabilirlerçevrelerine göre hala. Bu metabolitler ve / ya da iyon, uçucu geçici ya da hücre duvarı ve plazma membranı ile bağlantılı olabilir, burada uzaysal olarak yapılandırılmış ve dinamik bölmesi olduğu anlama veya apoplastı çözelti içinde meydana gelen moleküler değişiklikler karakterize karmaşıktır. Bundan başka, çeşitli analitik teknikler, farklı kimyasal türleri kapsaması gerekmektedir. Çözünür apoplast bileşimini incelemek için, akışkan, genellikle dokudan ekstre edilmesi gerekmektedir. Çeşitli yöntemler yeni önerilen filtre şerit yöntemi 10 dahil olmak üzere çeşitli dokulardan gelen sıvıyı apoplastı ayıklamak için var, ama yaprakları için en köklü ekstraksiyon yöntemi infiltrasyonu-santrifüj olduğunu. Bu teknik 11-13 önceden değerlendirildi ve Lohaus ark., 2001 14 yönteminin teknik parametrelerin çoğunu kapsamlı bir inceleme sağlar. Isim, sızma-Santrifüj ima gibiNavigasyon teknik, esas yapraklar yumuşak santrifüj ile infiltrasyon / apoplastik sıvı karışımının geri ardından doğal apoplastik sıvısı ile karıştıktan sulu infiltrasyon sıvısı ile apoplastik hava boşluğu değiştirme içeren iki aşamalı bir yöntemdir. Geri kazanılmış sıvı seyreltilir ve apoplast mevcut tüm bileşikleri (aşağıya bakınız) ihtiva etmez, bu sıvılar yaygın bir apoplastı yıkama sıvısı (AWF) ya da bazen arası yıkama sıvısı yerine apoplastik sıvı olarak bilinmektedir. infiltrasyonu santrifüj tekniği yeterli hacim tek ya da bir araya getirilmiş AWF örnekleri oluşturulan ve aşağı doğru, biyokimyasal ve analitik teknikler (geniş tabi sağlayan kolayca ölçeklendirilebilir, örneğin, protein elektroforezi, enzim aktivitesi ölçümü, NMR, kromatografi ve kütle çok çeşitli spektrometrisi). Yaprak AWF bitki kolonize mikrop zekâ etkileşimini incelemek için büyüme ortamı taklit bir apoplast olarak yararlıdırh çevreleri 5. Aşağıdaki protokoller biz Phaseolus vulgaris cv kullanarak sızma-santrifüj tekniği gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Tendergreen yaprakları ve metabolomik odaklanarak mansap analizler bazı örnekler sunmak. Önemlisi, yöntemler AWF kalitesi, farklı yaprak türleri için prosedürü optimize etmek tavsiyeleri ile birlikte verilmektedir değerlendirmek için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Eppendorf Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:291px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">razor blade</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>12-640&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">60 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">20 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">4 inch parafilm</td>
			<td style="width:291px;">Bemis</td>
			<td style="width:139px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">side arm flask</td>
			<td>SciLabware</td>
			<td>12972831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum source</td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">5 ml pipette tips</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>50-813-28&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:309px;">centrifuge</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">indigo carmine</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">I8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microplate reader</td>
			<td style="width:291px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;">Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">96 well plates</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:291px;">SciQuip</td>
			<td style="width:139px;">Christ Alpha 2-4 LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microcentrifuge</td>
			<td style="width:291px;">biorad</td>
			<td>166-0612EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">oxaloacetic acid</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-glucose-6-phosphate</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>G7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NADH</td>
			<td style="width:291px;">Roche</td>
			<td>10128023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K654-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G6PDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>MAK015-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G-6-P assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K657-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">ribitol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">A5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methanol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">chloroform</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum concentrator</td>
			<td style="width:291px;">Thermor Scientific</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">226904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">394866</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example

apoplastı plazma zarı dışında yer alır ve hücre duvarı içeren bitki dokularında belirgin bir hücre dışı bölme olduğunu. yaprakları bitkinin apoplastik bölmesi hücre duvarı oluşumu, hücresel besin ve su alımı ve ihracat, bitki-endophyte etkileşimleri ve patojenlere karşı savunma yanıtları dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik süreçlerin, sitedir. infiltrasyon-santrifüj metodu da çeşitli bitki türlerinin çözünür apoplastı bileşiminin analizi için güçlü bir yöntem olarak kurulur. Bu yöntemle elde edilen sıvılar yaygın bir apoplastı yıkama sıvısı (AWF) olarak da bilinir. Aşağıdaki protokol Phaseolus vulgaris (Fransızca fasulye) cv gelen AÇD çıkarılması için optimize edilmiş vakum infiltrasyon ve santrifüj yöntemi açıklamaktadır. Tendergreen yaprakları. Bu yöntemin ve diğer bitki türleri için protokol optimizasyonu sınırlamaları tartışılmıştır. AWF alt baş experimen geniş bir aralığında kullanılabilir Kurtarılanapoplast bileşimini karakterize etmeye ve bitki türlerinin ve genotip, bitki gelişimi ve çevre koşullarına tepki olarak değişir nasıl, ya da mikroorganizmalar apoplastı sıvıda büyür nasıl belirlemek ve bileşimindeki değişikliklere yanıt ts.

Sağlıklı 3 haftalık P. gerçekleştirilen AÇD çekimi için tipik sonuçlar cv vulgaris. Infiltrasyon sıvısı olarak distile edilmiş su ile Tendergreen yaprakları, Tablo 2 &#39;de gösterilmiştir. Genç S. vulgaris yaprakları infiltrasyon mükellef olan ve burada kullanılan santrifüj hızında (1.000 xg) santrifüj infiltrasyonu sıvının çoğunluğu kaldırılması yaprakları özgün yeşil rengi dönmek doğrudan görülebilir. P. vulgaris yaprak taze ağırlığı infiltrasyonu öncesinde ortalama 1.1 x g oldu ve yaş olarak her gramında AWF 0.5 ml elde edildi. AWF protein konsantrasyonu ml standart Bradford protein deneyi kullanılarak / 0.18 ± 0.08 mg olduğu tespit edilmiştir. indigo karmin seyreltme ölçerek hesaplanan bu yaprakları için seyreltme faktörü, 2.3 ± 0.3 kat oldu. Yukarıdaki değerler gram yaprak taze biz başına AWF verimini belirlemek için gerekli olan türler ve pilot deneyler arasında önemli ölçüde değişebilirkilolu olan, hem de belirli bir yaprak türü için beklenebilir AWF protein konsantrasyonu ve seyreltme faktörü. Merkezkaç kuvveti çok yüksek olduğu takdirde hücrelerin bütünlüğüne zarar basıncı değişiklikleri çok hızlı ise, sızma aşaması esnasında hem de meydana gelir ve santrifüj aşaması esnasında olabilir. Bu sitoplazmik kontaminasyon belirteçleri için AÇD örnekleri tahlil etmek gereklidir; ideal olarak, çok sayıda bağımsız tayin gerçekleştirilmiştir. Burada, üç olası tahlillerinden elde edilen sonuçlar, Tablo 2&#39;de rapor edilmiştir. P. iyi yapılan ekstraksiyon olarak vulgaris AWF, G6PDH, standart enzim testi ile tespit edilememiştir. Bu G6PDH aktivitesi, yalnızca bir eşik santrifüj kuvveti 12 üzerinde tespit olma özelliğini raporlarla tutarlıdır. Bunun aksine, malat dehidrojenaz aktivitesi (2.5 U / ml) &#39;in bir baz düzeyi, tüm P. saptanabilir standart metabolik tahlili kullanılarak vulgaris AWF örnekler. Için santrifüj artırılması1000 xg bir eşik değerinin üzerinde CE artan MDH faaliyetleri ile sonuçlanmıştır (sonuçlar gösterilmemiştir). Diğer türler, apoplastı endojen MDH aktivitesi 18 ihtiva bildiği gibi, burada tespit edilen miktarı bu taban seviyesinden gerçek apoplastik aktivitesi ve önemli artışlar kabul kirlenmeye göstergesidir. Örneğin heksoz-6-fosfat gibi, esas olarak, sitoplazmik olduğu düşünülen metabolitleri de AWF kirlenmesini değerlendirmek için de kullanılabilir. Burada, GC-MS analizi, AWF ekstraksiyon G-6-P sıfır ya da eser seviyeleri tespit edildi. Sitoplazmik kirlenme 10 gösteren kesme mısır kök bölümlerde aksine, G-6-P, santrifüj hızlarda AWF ekstraksiyondan sonra tespit edildi ve daha yüksek hızlarda konsantrasyonda artmıştır. P. GC-MS ile metabolit analizi 60 tanımlanabilir metabolitleri ve tanımlanamayan bileşiklerin yaklaşık eşit sayıda (Şekil 2) - vulgaris yaprak AWF genellikle 40 verir. Veyamentasyon asitler, basit şekerler, amino asitler, tanımlanabilir metabolitlerin kütle Bununla birlikte, ikincil bitki metabolitleri de algılanabilir ve AWF 11 miktarı edilmiştir temsil eder. Bu farklı molekül sınıflarından birkaç örnek tepe Şekil 2&#39;de etiketli daha aşağı analitik teknikler, örneğin, çeşitli moleküller ölçmek için, bu AWF örneklere uygulanabilir niteliktedir:., ICP-MS, NMR, HPLC, atomik absorpsiyon spektroskopisi, protein, kütle spektrometrisi. Şekil 3, Coomassie Brillant Blue lekeli SDS-PAGE jeli gösterilen apoplast protein bileşeni de AWF temsil edilmektedir. Diğer roller arasında apoplastik enzimler, hücre duvarı sentezi ve hücre dışı reaktif oluşturulması için sorumludur oksijen türleri. Çeşitli türlerden AWF proteomik çalışmalar bireysel proteinlerin onlarca tespit ve apoplast protein bileşeni enviro tepki göstermiştirnmental stres 13,19. İdeal AWF özü gibi Rubisco&#39;nun gibi sitoplazmik proteinleri tarafından kontaminasyon serbest olmalıdır; Ancak uygulamada, bu elde etmek zordur. SDS-PAGE aşağıdaki ~ 53 kDa bir Rubisco protein bandının varlığı AÇD örneklerinin bütünlüğü için bir başka nitel tahlil sağlar. Örneğin, Şekil 3 içinde yol 2&#39;de yüklü örnek şerit 1 bu Rubisco kirlenme büyük bir miktarda içerir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Fikriye AWF vulgaris </td></tr><tr><td> AWF Hacmi (ml g -1 yaprak FW) </td><td> 0.49 ± 0.09 </td></tr><tr><td> Protein kons. (Mg mi-1) </td><td> 0.18 ± 0.08 </td></tr><tr><td> Sulandırma faktörü </td><td> 2.3 ± 0.3 </td></tr><tr><td> G6PDH aktivitesi (U mi-1) </td><td&gt; Hiçbiri tespit </td></tr><tr><td> GLC-6-P (mg mi-1) </td><td> hiçbiri tespit </td></tr><tr><td> MDH-aktivitesi (U mi-1) </td><td> 2.5 ± 0.9 </td></tr></tbody></table> P. AWF çekimi için Tablo 2. Tipik sonuçlar cv vulgaris. Tendergreen yaprakları. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Standart apoplastı çıkarma iş akışı. Numaralar protokolde adımlara bakın. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Bir örnek P GC-MS kromatogramı. Cv vulgaris. . Tendergreen AWF sayılı örnek metabolit pikleri: 1-malonat, 2-fosfat, 3-suksinat, 4-bilinmiyor, 5-malat, 6-asparagin, 7-ribitol (iç standard), 8-sitrat, 9-glükoz, 10-inositol, 11-kafeik asit, 12-sakroz. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250" /> Şekil 3. SDS-PAGE koomassie P jelini örneği. Bu jel bol plastidsel enzim Rubisco ile sitoplazmik kirlenme miktarda farklılık gösteren iki AWF ekstraksiyon protein bileşenleri arasında bir karşılaştırma sağlar. AWF yaprak ekstreleri vulgaris. AWF ekstre sonra her iki numune, soğuk aseton 4 kat fazla (h / h) aseton proteini çökeltmeye tabi tutulmuş ve onda biri orijinal ses su içinde çözündürülmüştür. Kuşak 1 ve 2 proteininin 40 ug içermektedir. Rubisco büyük zincirine karşılık gelen bant (~ 53 kDa) bir ok ile belirtilmiştir. M r: Protein molekül ağırlığı belirteçleri.

Watch this Scientific Journal Video about The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example at JoVE.com

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Bir örnek olarak

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

the-infiltration-centrifugation-technique-for-extraction-apoplastic

Research

JoVE Journal

Biology

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

36.6K Görüntüleme.  University of Oxford. This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Video: The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Mikroenjeksiyon kullanarak Yaprak bitleri Viral İletim Fizyolojik Engelleri Test

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Biyoloji

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Yapay Diyet Deney kullanarak Yaprak bitleri Nikotin Tolerans Testi

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid peptide (A&#946;) and intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. Because cerebrospinal fluid (CSF) is in direct contact with the extracellular space of the brain, it provides a reflection of the biochemical changes in the brain in response to pathological processes. CSF from AD patients shows a decrease in the 42 amino-acid form of A&#946; (A&#946;42), and increases in total tau and hyperphosphorylated tau, though the mechanisms responsible for these changes are still not fully understood. Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for CSF sampling from the mouse. This extremely gentle sampling technique allows serial CSF samples to be obtained from the same mouse at 2-3 month intervals which greatly minimizes the confounding effect of between-mouse variability in A&#946; or tau levels, making it possible to detect subtle alterations over time. In combination with A&#946; and tau ELISA, this technique will be useful for studies designed to investigate the relationship between the levels of CSF A&#946;42 and tau, and their metabolism in the brain in AD mouse models. Studies in Tg mice could provide important validation as to the potential of CSF A&#946; or tau levels to be used as biological markers for monitoring disease progression, and to monitor the effect of therapeutic interventions. As the mice can be sacrificed and the brains can be examined for biochemical or histological changes, the mechanisms underlying the CSF changes can be better assessed. These data are likely to be informative for interpretation of human AD CSF changes.

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse

Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses in human patients. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for serial CSF sampling from the mouse.

Cisterna Magna Fare Beyin Omurilik Sıvısı Seri Toplama Tekniği

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Karakterize Otobur Direnç Mekanizmaları: Spittlebugs Brachiaria Spp. Bir Örnek

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Prosedür bitki özleri gelen Dağınık Parçacıkların çıkarması için Flokülantlar Verimliliği değerlendirin

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...