Bu araştırma, USDA-ARS CRIS Projesi 5325-42.000-037-00d altında ve CRADA 58-3K95-7-1198 ve TFCA 58-5325-8-419 sonuçları ile gerçekleştirilmiştir. Yazarlar, minnetle ve hediye için Suterra kabul (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, verimli tartışmalar B. Higbee ve teknik yardım J. Baker.

1. Gösterim EAG için Konak Bitki gelen Tespit uçucu hazırlanması <ol><li> GC-MS ile tüm uçucu uygun tanımlama ve kimlik doğrulama sonra, her mevcut uçucu EAG puf analizi gerçekleştirmek. Başlangıç ​​tarama süresinin kısa bir miktarda (Tablo 1) göreceli chemoreceptivity bir gösterge sağlamak için her bir cinsiyet antennal tepkilerin bir düşük kopyalayan numarası (N = 3-5) olabilir. </li><li> Pentan içinde 5 mg / ml konsantrasyonunda her uçucu bir çözeltisi hazırlayın. Sıkıca (örneğin, asetofenon, yoğunluğu = 1,03 g / ml, hacim = (0.005 g/1.03 g / ml) × 1.000 = 4.85 1.0 mL ölçülü balona asetofenon ile uL ve sulandırmak hemen kullanıma hazır olana kadar örnek mühür ve soğutmak 1,0 pentan ile mL). </li><li> Hemen önce EAG analizi için, test edilecek Uçucu maddeler arasında 5 mg / ml konsantrasyonda ihtiva eden şişeler kaldırmak ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verir. Bu arada, Pasteur pipetler için uygun sayıda etiketTest edilecek her uçucu ile korelasyon ve pipet ucu üzerinde parafilm küçük bir parça (yaklaşık 15 × 15 mm) sarın. Ilk tarama 10 uyaran pipetler için (N = 4, her erkek ve kadın için) kötü bir hazırlık ya da diğer öngörülemeyen bir engel halinde yüklenir. </li><li> Cımbız kullanılarak, yavaşça pipetle içine yerleştirilmesini kolaylaştırmak üzere ikiye katlamak bioassay diski, daha sonra kısmen ca böylece pipet ucu içine büyük katlanmış diski yerleştirin. Diskin 2-3 mm maruz kalmaktadır. Raf tutucu etiketli ve prepped pipetler hizalayın. </li><li> Bir pipet veya şırınga kullanılarak her diske uçucu solüsyon 10 L (50 mikrogram) yüklemek ve tam pipet içine diskleri takmadan önce geçmesi için 2 dakika bekleyin. Bir kez yüklenmiş, hemen parafilm (ca. 15 x 30 mm) ile, pipet ucu mühürlemek. Yüklenir ve kabarık olması uçucu teşvik miktarı en muhtemel böcek türleri ile değişecektir. </li><li> Aynı protokolü takiben yukarıda belirtildiği üzere kontroller hazırlamakHer bir analize içerir. Her diske sadece pentan negatif kontrol yükü 10 uL için, 2 dakika bekleyin etiketli pipet içine yerleştirin ve mühür. Pozitif kontrol için, disk üzerine 10 L (50 mg) yüklemek 2 dakika bekleyin, etiketli pipet içine yük ve parafilm ile mühür. </li><li> Böcek antennal prep yaşayabilirliği, büyük olasılıkla türler göre değişir, ama Amyelois transitella antenler tipik olarak tanımlanan protokol kullanılarak çıkarıldıktan sonra&gt; 30 dakika için aktif kalması ve tutarlı bulduk. Bu kadar süre genellikle yukarı değerlendirilmek üzere 4-10 uçucu örnekleri için izin verecektir. Tablo 2 kez ve dizileri bir örnek sağlar. </li></ol> 2. Biyoassay EAG için Böcek Anten hazırlanması <ol><li> Bu deneyin odak analizi EAG edilir; dolayısıyla, her araştırmacının uygun yetiştirilen böceklerin erişimi olacak varsayımı. </li><li> Bu deneme için biz ol 3-4 gün çalışıyor olacağımd, evlendirilen kız ve erkek güveler. Bireysel kelebekler küçük, kapaklı, plastik kap analiz gün aktarılır. Biyoassay hemen önce, test edilecek güve bir tutma aparatı (yani, çeşitli plastik pipet uçları yapılmış) ve arkasından güvenli bodoslama-ilk transfer edilir. Böceğin Manipülasyon eksizyonu kolaylaştırmak için düşük güçlü bir stereo-mikroskop altında görülebilir. </li><li> Anten bir tel uçlu aracını kullanarak dışarı alay edilir. Elektrot jeli küçük bir film ile çatal tutucu, antenlerin hızlı transfer için yakın yerleştirilir. İlk anten mikro makas kullanılarak çıkarıldı ve çatal üzerine yerleştirilir, antenin tabanı sağlanması çatal (kayıtsız toprak elektrot) of non-kırmızı bir kısmı üzerine yerleştirilir edilir. 10 dakika boyunca bir zamanlayıcı kümesi başlatıldı ve ikinci bir anten çatal aynı tarafta hem bazlar ile birinci antenin yanında çıkarıldı ve yerleştirilir. </li><li> Alternatif olarak, antenleri holdin içinde güvenli bırakılabilirg tüp çıkarılarak, sonra yavaşça tüp ve ucunda jel, orayı bir tel uçlu aracını kullanarak böcek arasındaki kaldırılır. </li><li> Anten tabanı ve ucu elektrot jeli dalmış emin olmak için kontrol ve kabarcık jel bulunmaz. Uçları / ipuçları elektrot jeli tam maruz garanti kesilmiş olabilir. Care her bir anten kalanı, böylece puf maruz maksimum antennal yüzey alanı garanti jeli ile kaplı emin olmak için kullanılmalıdır. </li><li> Prepped çatal sonra prob pre-amplifikatör içine yerleştirilir ve 200 ml / bekleme süresi 10 dakika kalan süre dakikada nemlendirilmiş sabit bir hava akışı altında tutulur. Hava / puf akış 2-3 mm yönlendirmek için ayarlanabilir olduğu zaman ve tüketim inisiyasyon kez EAG belirtilmiştir (Tablo 2) ve birinci uyaran puf önce 30 saniye, pozitif kontrol içeren pipetle sonuçlandırılmamış ve tutucu yerleştirilir antenler prepped. </li><li> Her exper sonraiment, testi güveler bir kuru buz ortamda ötenazi ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmektedir. </li><li> Erkek kelebeklerin çiftleşme durumunu kontrol etmek için disseke edilir. Birlikte yaşayan erkek evlendirilen olduğu varsayılmaktadır. </li></ol> 3. Bireysel Bileşenleri için Protokol EAG <ol><li> Antennal yanıtları Syntech EAG aleti ile birlikte AutoSpike yazılım aracılığı ile kaydedilir. EAG probu ile kanal için AutoSpike Özellikler sekmesindeki yapılandırma 106.7 bir örnekleme oranı, NO düzeltmek için ve 0-42 Hz bir filtre olarak belirlenmiştir. Filtre sekmesini için EAG filtre ON ve düşük kesme 0.1 Hz olarak ayarlanır. </li><li> Stimulus ponponları süresi 1-2 saniyedir. 1 dakika için ayarlanmış bir zamanlayıcı her nefeste sonra başlatılır. </li><li> Sonraki test uçucu pipet mühürsüz ve tutucu yerleştirilir. Randomize arasında, test uçucuların, dizisi, hiçbir test bileşikleri sürekli olarak başka bir test uçucu takip sağlamak için çalışır daha sonra takip eder (örneğin, Tablo 2) dikkatle allowiponponları arasındaki ng 1 dakika. </li><li> EAG yanıtları okuma kolaylığı sağlamak için, hükümdarlar kısımlarını bilgisayar ekranında yerleştirilir ve Çökmelerin sinyal apekse temel düzeyde mm ölçülen ve bir veri sayfası (yani, 5 mV ayarı için, 33 mm oturum = 2.5 mV). Yazılım gelecek analizi için kaydedilen kayıtların oynatma yeteneğine sahiptir. MV ya μV amplitüd birine mm arasında dönüşüm sonrası veriler analiz yapılır. </li><li> Son pozitif kontrol puf (örneğin, kayıt # 12) uygulandığında sonra, antenleri kaldırılır, çatal, etanol-doymuş silin ile temizlenir ve sonraki kullanımdan önce kurumaya bırakılır. </li><li> Tahlillerin verimi artırmak için, antenlerin sonraki bölümün çıkarılması yaklaşık 10 dakika güncel deney bitmeden ikinci bir laboratuvar personeli tarafından başlatılmış olabilir - Dördüncü puf sonra; mevcut Deneyin ikinci testi uçucu, Masa başı olarak 2. Bu fo sağlayacakr doğrudan geçerli deney bittikten sonra bir sonraki deney başlamadan. </li><li> Tekrarlamalı Yüksek sayısı (farklı antenler üzerine) daha ileri istatistiksel doğrulama sağlamak ilgi bileşikler üzerine yapılabilir. </li></ol> 4. Karışımlar veya Diğer Matrisler EAG Analizi Örneği (Tablo 3) <ol><li> Sonra, iki üçüncül karışımları (3-bileşenli karışımları) için hacim oranları ve yüksek EAG tepkileri (Tablo 4) eliciting uçucuların birleştiren bir örneği sağlamak için hesaplanır. Daha sonra 2-phenylethanol ve 01:02:04 ikinci bir karışım oranı ile karşılaştırarak: 2-undecanone: hesaplamalar bazı temel oranları, α-humulene bir 01:01:01 molar oranı içindir. </li><li> Benzer protokolleri kullanarak daha önce, karışım hazırlanır ve etiketli Pasteur pipetler gerekli pozitif ve negatif kontrollerle birlikte yüklenir tarif edilir. </li><li> Uçucu örnekleri ve erkek antenler arasında kabarık ve yanıtları ölçülür ve oturumbir veri sayfası (Tablo 3). </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Kadın göbeği orangeworm için aşağıdaki ayarları kullanılır: 2 saniye ponponları, 10 saniyelik kayıt süreleri, 10 saniyelik penceresi ve 5 mV ölçek. Negatif bir sapma tipik tepki, henüz mutlak değeri (örneğin, -3400 μV saptırma 3,400 μV olarak kaydedilir) kaydedilir. Pozitif kontrol için hazırlık A nispeten zayıf tepki atılır. Şekil 1 göbek orangeworm tarafından pozitif kontrol yanıtı zayıf bir grafiksel bir temsilini sağlar. Zayıf bir kontrol sonucu Örneğin, asetofenon için ortalama kadın antennal tepkisi tipik olarak ca. 2.600 μV (Şekil 2), hazırlık sadece ca bir yanıt verseydim. 1.300 μV atılır ve antenler başka bir çift prepped olacaktır. Benzer şekilde, ortalama bir erkek tepkisi (Z, Z) -11,13-hexadecadienal typicall idiy 3000 μV, bu yüzden, herhangi bir yanıt az 1.500 &#39;den μV tipik olarak atılmıştır. Her bir deney başlamadan ve sonunda da pozitif kontrol antenler durumu ile ilgili bilgi sağlar. Sonrası kontrolü (kayıt # 12, Tablo 2) puf için antennal yanıtı öncesi kontrol 1. puf (kayıt # 1 az% 75 ya eğer biz hızlı bir tarama için takip etmeniz gereken bir kuraldır Tablo 2) ya da ön-kontrolü (kayıt # 2, Tablo 2) daha sonra deney (Şekil 3) bağlı prep olası degradasyona veri analizi kullanılan değildir ve 2. puf daha azdır. Başparmak ilk kuralı bir örneği kayıt # 1 olurdu = 2,730 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV ve başparmak ikinci kural varsa, bu durumların her birinde kayıt # 2 = 2.350 μV ve kayıt # 12 = 1.680 μV, , hazırlık ve deney sonuçlarını iptal olacaktır. Aolarak pozitif kontrol için ölçülen EAG yanıt değerleri düzeltmek temsili örnek aşağıdaki gibi olacaktır. <table border="1"><tbody><tr><td> # Run </td><td> EAG (V) </td><td> # 2 Run </td><td> EAG (V) </td><td> # 3 çalıştırın </td><td> EAG (V) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> Bir Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Bir N = 3 deneyi için yukarıda değerleri kullanılarak, negatif kontrol tepkisi negatif kontrol mekanik puf ve artık çözücü için taban antennal tepkisi olduğu varsayımını altındaki her bir deney içindeki her bir değeri çıkarılır. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1 çalıştırın </td><td> EAG (V) </td><td> # 2 Run </td><td> EAG (V) </td><td> # 3 çalıştırın </td><td> EAG (V) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> Bir Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Her bir deney için pozitif kontroller sonra ortalama ve 1,000 μV için düzeltme oranı belirterek, 1000 μV için düzeltilmiş olacaktır. Bir veri sayfası (örneğin, Excel) kolay kullanılabilir veri yanıtları dönüştürmek için manipüle edilebilir. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1 çalıştırın </td><td> Ort (V) </td><td> # 2 Run </td><td> Ort (V) </td><td> # 3 çalıştırın </td><td> Ort (V) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Her deney içinde düzeltme oranı ile çarpılması, bileşik için değerler A ve bileşik B daha sonra ayarlanır. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1 çalıştırın </td><td> Adj. EAG (V) </td><td> # 2 Run </td><td> Adj. EAG (V) </td><td> # 3 çalıştırın </td><td> Adj. EAG (V) </td></tr><tr><td> Bir Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> Bir Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> Her bileşik için ortalamalar (vasıtası) daha sonra daha sonra değerlendirilebilir test bileşikleri için diğer ilgili veriler ve istatistiksel EAG yanıtları ile birlikte belirlenendaha fazla araştırma için adaylığı için. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşik </td><td> EAG (V) </td><td> No çalıştırır, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Şekil 1. Antenleri olduktan sonra fakir antennal tepkisi nedeniyle iptal olacağını ön kontrol (1. Pozitif kontrol puf) için erkek antennal yanıt (1,180 μV) Temsilcisi EAG jel ile iyi temas var. Alt pencereler Mavi bar uçucu iki ikinci puf temsil eder. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> Trong&gt; Şekil 2. için kadın antennal yanıt (3,400 μV) Temsilcisi EAG 1. puf uygun olarak düşünülebilir ön kontrolü. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Şekil 3. Kadın antennal yoksul olarak düşünülebilir sonrası kontrolü yanıt (1,680 μV) (her bir deney için son pozitif kontrol) ve antenleri bozulması (&lt;75 1. ön kontrol veya% &lt;düşündüren Temsilcisi EAG öncesi kontrol 2. puf değer). Bu örnek için 1. ön kontrol puf ön kontrol puf 2.350 μV oldu 2,730 μV ve 2. oldu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <html> &quot;dflinebreak&gt; <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir aday uçucu harmanından puf için dişi antennal yanıt (3800 μV) ve en çok başlangıç ​​saptırma (3800 μV), puf süresi sırasında ilk eğimi (daha sonraki ölçümler için EAG Örnek 0,3 s/1.2 mV = 0.25 s / mV) ve kalan puf süre için eğim (1.6 s/1.9 mV = 0.84 s / mV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Örnek bir matris ve ilişkili uçucu içeren Şekil 5. Küçük modifiye gemi A. arasında söndürdü edilecek transitella antenler. ad/3931/3931table1.jpg &quot;/&gt; Tablo 1. Autospike programında farklı ve daha az duyarlı yapılandırması tarafından belirlenir Nonpareil badem (2007) ve EAG yanıtları yerinde uçucu emisyon olarak. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tablo 2. Bireysel uçucu bileşenleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği. <img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tablo 3. Uçucu karışımları ve / veya buketleri, kadın ve erkek antennal yanıtları kaydetmek için bir form örneği. <img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tablo 4. Karışımları, iki farklı oranları için, bir 5 mg / mL çözelti 10 mL hazırlama örnekleri. <img alt="Tablo 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tablo 5. Ve erkek anten üzerinden tek uçucu bileşenlerin üst üste iki ponponları kayıt formu örneği.

<ol>
	<li>Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+host+location:+a+volatile+situation.">Insect host location: a volatile situation.</a> Trends in Plant Sci. 10, 1360-1385 (2005).</li><li>Unsicker, S. B., Kunert, G., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+perfumes:+the+role+of+vegetative+volatiles+in+plant+defense+against+herbivores.">Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 479-485 (2009).</li><li>Norin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiochemicals+for+insect+pest+management.">Semiochemicals for insect pest management.</a> Pure Appl. Chem. 79, 2129-2136 (2007).</li><li>Beck, J. J., Merrill, G. B., Higbee, B. S., Light, D. M., Gee, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+seasonal+study+of+the+volatile+production+of+almonds+(Prunus+dulcis)+var.+'nonpareil'+and+relationship+to+navel+orangeworm.">In situ seasonal study of the volatile production of almonds (Prunus dulcis) var. 'nonpareil' and relationship to navel orangeworm.</a> J. Agric. Food Chem. 57, 3749-3753 (2009).</li><li>Beck, J. J., Higbee, B. S., Gee, W. S., Dragull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+orchard+volatiles+from+California+almonds.">Ambient orchard volatiles from California almonds.</a> Phytochem. Lett. 4, 199-202 (2011).</li><li>Coffelt, J. A., Vick, K. W., Sonnet, P. E., Doolittle, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+identification,+and+synthesis+of+a+female+sex+pheromone+of+the+navel+orangeworm,+Amyelois+transitella+(Lepidoptera:+Pyralidae).">Isolation identification, and synthesis of a female sex pheromone of the navel orangeworm, Amyelois transitella (Lepidoptera: Pyralidae).</a> J. Chem. Ecol. 5, 955-933 (1979).</li><li>Leal, W. S., Parra-Pedrazzoli, A. L., Kaissling, K. -. E., Morgan, T. I., Zalom, F. G., Pesak, D. J., Dundulis, E. A., Burks, C. S., Higbee, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+pheromone+chemistry+in+the+navel+orangeworm:+novel+sex+attractants+and+a+behavioral+antagonist.">Unusual pheromone chemistry in the navel orangeworm: novel sex attractants and a behavioral antagonist.</a> Naturwissenschaften. 92, 139-146 (2005).</li><li>Kanno, H., Kuenen, L. P. S., Klingler, K. A., Millar, J. G., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attractiveness+of+a+four-component+pheromone+blend+to+male+navel+orangeworm+moths.">Attractiveness of a four-component pheromone blend to male navel orangeworm moths.</a> J. Chem. Ecol. 36, 584-591 (2010).</li><li>Takacs, S., Gries, G., Gries, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiochemical-mediated+location+of+host+habitat+by+Apanteles+carpatus+(Say)+(Hymenoptera:+Braconidae),+a+parasitoid+of+cloths+moth+larvae.">Semiochemical-mediated location of host habitat by Apanteles carpatus (Say) (Hymenoptera: Braconidae), a parasitoid of cloths moth larvae.</a> J. Chem. Ecol. 23, 459-472 (1997).</li><li>Karimifar, N., Gries, R., Khaskin, G., Gries, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+food+semiochemicals+attract+omnivorous+German+cockroaches,+Blattella+germanica.">General food semiochemicals attract omnivorous German cockroaches, Blattella germanica.</a> J. Agric. Food Chem. 59, 1330-1337 (2011).</li><li>Molyneux, R. J., Schieberle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+identification:+a+Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry+perspective.">Compound identification: a Journal of Agricultural and Food Chemistry perspective.</a> J. Agric. Food Chem. 55, 4625-4629 (2007).</li><li>Marion-Poll, F., Thiery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+EAG+responses+to+host-plant+volatiles+delivered+by+a+gas+chromatograph.">Dynamics of EAG responses to host-plant volatiles delivered by a gas chromatograph.</a> Entomol. Exp. Appl. 80, 120-123 (1996).</li><li>Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+volatile+emissions+from+undamaged+and+mechanically+damaged+almonds.">Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds.</a> J. Sci. Food Agric. 88, 1363-1368 (2008).</li><li>Lucas, P., Renou, M., Tellier, F., Hammoud, A., Audemard, H., Descoins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+and+field+activity+of+halogenated+analogs+of+(E,E)-8-10-dodecadien-1-ol,+the+main+pheromone+component+in+codling+moth+(Cydia+pomonella+L.).">Electrophysiology and field activity of halogenated analogs of (E,E)-8-10-dodecadien-1-ol, the main pheromone component in codling moth (Cydia pomonella L.).</a> J. Chem. Ecol. 20, 489-503 (1994).</li><li>Rodriguez-Saona, C., Poland, T. M., Miller, J. R., Stelinski, L. L., Grant, G. G., de Groot, P., Buchan, L., MacDonald, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-86 (2006).</li><li>Burks, C. S., Brandl, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+abundance+of+navel+orangeworm+(Leipidoptera:+Pyralidae)+in+figs+and+effect+of+peripheral+aerosol+dispensers+on+sexual+communication.">Seasonal abundance of navel orangeworm (Leipidoptera: Pyralidae) in figs and effect of peripheral aerosol dispensers on sexual communication.</a> J. Insect Sci. 4, 1-8 (2004).</li></ol>

Yazar Paramount Tarım Şirketi, Suterra LLC ile bağları olan bir şirket ile mevcut bir kooperatif araştırma ve geliştirme anlaşması var.

Bir hedef böcek chemoreception yanıtları belirlemek için bir biyoassay olarak electroantennogram kayıtların kullanın gaz kromatogramı (GC-EAD) gelen atık için bir dedektör olarak EAG kullanan çalışmaları literatürde bulunabilir oldukça yaygın ve çok sayıda olduğunu. 9,10 yöntemi gösterdi göreceli yanıt emindir atama için yüksek tekrarlı olarak uçucu bileşenlerin eşdeğer miktarda hızlı bir tarama sağlayacaktır. Biz &quot;tarama&quot; değer olarak burada mevcut antenlerden m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Asetofenon </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Bayan pozitif kontrol </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Erkek pozitif kontrol </td></tr><tr><td> α-Humulene </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Seskiterpen </td></tr><tr><td> 2-Undecanone </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Yağlı asit türevi </td></tr><tr><td> 2-Phenylethanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Benzenoid </td></tr><tr><td> Pentan </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Çözücü </td></tr><tr><td> 4-Kanal edinimi denetleyici </td><td> Syntech </td><td> BenDAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG prob, pre-kuvvetlendirici </td><td> Syntech </td><td> Tip PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Anten tutucu </td><td> Syntech </td><td> PRG-2 için </td><td> Çatal elektrot </td></tr><tr><td> Stimulus denetleyici </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> Hava akışı ve ponponları </td></tr><tr><td> Spectra Elektrot Jel </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Biyoassay diskler </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 mm </td></tr><tr><td> Pasteur pipetleri </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14.6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

Bitki uçucu bitki-böcek ilişkisi önemli bir rol oynamaktadır. Otçul böceklerin konukçu bitki bulmak için kairomones olarak bilinen bitkinin uçucu, kullanın. 1,2 bir konak bitki yetiştiricileri için ciddi ekonomik kayıplara sebebiyet böcek zararlıları ile önemli bir tarımsal emtia beslenme hasar olduğunda. Buna göre, kairomones cazibesine veya karıştırmayın bu böcekler ve böylece böcek kontrolü için pestisitlerin çevre dostu bir alternatif sunmak için cezbedici olarak kullanılabilir. 3 Ne yazık ki, bitkiler fenolojisi bağlı emisyon değişik kompozisyonlar ve oranları ile çok sayıda uçucu yayabilir emtia veya günün zaman. Bu biyolojik olarak aktif bileşenler veya uçucu bileşenler zorlu bir süreç karışımları belirlenmesi yapar. Biz laboratuvar tabanlı tarama biyoassay electroantennography (EAG) istihdam konak bitki uçucu emisyon biyoaktif bileşenler tespit yardımcı olmak. EAG değerlendirmek ve recor için etkili bir araçtırd elektrofizyolojik kendi antennal reseptörleri üzerinden bir böceğin koku yanıtları. EAG tarama süreci vaat eden biyoaktif bileşenleri tanımlamak için test uçucu sayısını azaltmaya yardımcı olabilir. Ancak, EAG biyoanalizlerin sadece reseptörlerinin aktivasyonu hakkında bilgi verir. Bu bileşik elicits böcek davranış türü hakkında bilgi sağlamaz; davranışsal yanıt cezbedici, tutmayan veya başka türü gibi olabilir ki. Uygun bir pozitif kontrole göre EAG tarafından önemli bir tepkinin uyarılmasında uçucu, genellikle zararlı böcek ve davranışsal tepkilerin ileri testler üzerine alınır. Deney tasarımı sundu olacak detay tek bileşenleri ve biyoassay EAG aracılığıyla bileşenlerin basit karışımları için yetişkin bir zararlı böcek göbek orangeworm (Amyelois transitella) elektrofizyolojik antennal yanıtların ölçümü ile 4,5 badem tabanlı bir ana bitki uçucu taranmasında kullanılan metodoloji. Yöntemi iki eski kullanırcised antenleri bir &quot;çatal&quot; elektrot tutucu boyunca yerleştirilir. Burada gösterdi protokolü tarama Uçucu için hızlı, yüksek hacimli standart bir yöntem sunuyor. Uyaran düzeyini standardize etmek ve böylece antennal yanıtları göreceli chemoreceptivity göstergesi olmasını sağlamak için her uçucu bir dizi, sabit miktarda yer almaktadır. Negatif kontrol puf hem artık çözücü ve mekanik kuvvet elektrofizyolojik yanıt ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. Pozitif kontrol (bu örnekte asetofenon olarak) kadın ve erkek göbek orangeworm (NOW) güve tutarlı bir yanıtı ortaya çıkardı, tek bir bileşiktir. Erkek ŞİMDİ güvesi ile tutarlı tepki verir ve biyoassay çalışmaları için kullanılan bir ek semiochemical standart (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, kadın üretilen seks feromon bir aldehit bileşeni. 6-8

Watch this Scientific Journal Video about Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles at JoVE.com

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Erişkin göbek orangeworm elektrofizyolojik yanıt (ölçümü ile hızlı ekran ana bitki uçucu için bir yöntem<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) Tek parça ve electroantennographic analizi ile karışır anten gösterilmiştir.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

electroantennographic-bioassay-as-screening-tool-for-host-plant

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  Agricultural Research Service. Erişkin göbek orangeworm elektrofizyolojik yanıt (ölçümü ile hızlı ekran ana bitki uçucu için bir yöntem Amyelois transitella) Tek parça ve electroantennographic analizi ile karışır anten gösterilmiştir.

Video: Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Biyoloji

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Otobur bağlı Blueberry uçucu ve Intra-bitki Sinyalleşme

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Bir plaka rekabet tahlil olarak hastalık bastırma hızlı bir ön değerlendirme

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.