Bu çalışma Araştırma (FNRS) c Scienti fi için Belçika Milli Fonundan hibe, İsrail Bilim Vakfı Kudüs FC Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı-Belçikalı Bilim Politikası ve &quot;Recherches Concertées de Communauté française de Belgique-Eylemleri&quot;, (tarafından desteklenen MM (Grant # 1311-1312) ISF) ve NM (Grant # 1312-1312) için.

Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Hazırlama izotonik (600 mOsm) ve hipotonik 10 mM KCI, 1 mM CaCI2, ve ihtiva eden (500 mOsm) çözeltiler 8 M 2-(N-morfolin) -ethanesulphonic asit (MES), pH 5.7 ve uygun miktarda ozmolaritenin ayarlanması D-sorbitol: izotonik ve hipotonik çözüm için 440 mM 540 mM. Bir osmometre kullanılarak (veya hedef değerinin% 3 olan), solüsyonun osmolaritesini edin. </li><li> Aşağıdaki enzimleri içeren &quot;enzimatik kaynaşması bir kuru stok hazırlayın: 0.55 g, selülaz 0.1 gr pektoliyazdır 0.33 g polivinilpirolidon K 30, 0.33 gr, BSA (bakınız Tablo 1, aşağıda) vorteksle kuru toz karışımı, 5.7 mg alikotları olun ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Arabidopsis Mezofil protoplastlan 2. izolasyonu <ol><li> Yaklaşık 6 damla bir petri kabının (10 cm) hazırlanması (yakl. 30 ul her biri) izotonik çözeltisi. </li><li> Peel abaxial (alt) Arabidopsis yaprak epidermis, cdaha sonra çözeltinin temas aşağı açıktaki yüzü alt yüzey damla izotonik çözelti üzerine yerleştirin kareleri, yaklaşık 4 x 4 mm 2 kareler halinde soyulmuş yaprak ut. </li><li> , 165 ul, 1.5 ml bir tüp içinde izotonik çözeltisi (ağ / ağ% 3.3) enzim karışımı 5.7 mg çözülür çözülene kadar bir dakika kadar pipetleme yavaşça karıştırın ve aynı Petri enzimatik solüsyonun bir kaç benzer damla yerleştirmek çanak. </li><li> , 28 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu içinde çanak yüzen parafilm bir yuvarlak conta kapağı çanak kapatın ve 20 dakika boyunca inkübe damla enzimatik solüsyon üzerine yaprak parçaları aktarın. </li><li> Çanak izotonik çözeltinin daha birkaç damla (her bir enzim çözeltisi damla başına 2 damla) ekleyin. Yeni bir izotonik çözelti damla Her bir yaprak parçası aktarın, sonra art arda ikinci bir damla (uzakta enzimatik solüsyon yıkamak). , Forseps kullanarak kenarından parça kaldırın o protoplastlarını serbest bırakmak için (bir çay poşeti gibi), ikinci açılan sallayın.1.5 ml tüp içine (bir kırpılır 100 ul pipet kullanarak) protoplastların ile damla toplamak. </li></ol> 3. Hipotonik Mücadelesi Tahlili: Arabidopsis Mezofil Hücre şişmesi <ol><li> Hipotonik çözelti ile izotonik çözeltisi ve bir sütun ile bir sütun doldurarak perfüzyon sistemi (Şekil 1A) hazırlayın. Aşağı emme manifoldu (Şekil 1B) için boruya tüm yol doldurmak için bazı çözüm akışını (ilk hipotonik, daha sonra izotonik), vanayı açalım. Sıkışmış hava kabarcıkları vardır emin olun, ve sonra vanayı kapatın. </li><li> (, Aynı zamanda Şekil 1C&#39;de bölmenin şema Şekil 1B) pleksiglas slayt içinde odacık için bir alt yapmak için, silikon yağı (Tablo 1) ile, bir lamel Seal. Protoplastlar kat için &quot;yapışkan&quot; (gres halka içinde lamel yukarı bakacak açıkta kalan yüzeyini) odasının altını yapmak için buya da poli-L-lisin (su içinde% 0.1 Tablo 1), pozitif yük taşıyan protamin sülfat (Tablo 1 su içinde% 1). 2 dakika yıkayın 3 - 1 - beklemek, bir pipet kullanarak lamel boyunca bu &#39;tutkal&#39; Spread 4 kez izotonik solüsyonu ile ve kalan çözümü uzakta sallayın. </li><li> Izotonik solüsyonu ile odası kadar doldurun. Daha sonra, kırpılıp pipet kullanarak, bölmeye çözeltisi içeren bir protoplast damla ekleyin ve 3 bekleyin - protoplastlar yerleşmek için 4 dak. Şeffaf kapak (Şekil 1D, 1E) ile odasını (altında hava kabarcığı önlemek) çözelti yüzeyine dokunmadan örtün. </li><li> (Hızlı oranları, bir mikroskop masaya (! Hafifçe) slayt yerleştirin perfüzyon sistemi ve (tüp! Hava kabarcıkları karşı koruma) pompaya bağlamak ve 1 ml / dakika sabit perfüzyon için izotonik çözelti akışına açmak 4 ml / dakika) kadar kullanılabilir. </li><li> Kayıt içinhacim değişiklikleri, bir inverted mikroskop ile bir 20x objektif ve bir bilgisayar bilgisayara bağlı bir CCD video kamera ile birlikte kullanılır. Seçilen hareketsiz protoplasmalar 60 saniye video film kaydetmek için ImageJ yazılım &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; eklentisi (bu iki yazılım adet indirme adresleri için özel Malzemelerin Tabloya bakınız) kullanın (muhtemelen, altına sıkışmış olanlar) 1 resim / sn (1 Hz) hızında. Izotonik çözeltinin 15 saniye yıkama ile Kaydı (bu taban çizgisini teşkil) başlatın 45 saniye boyunca hipotonik bir solüsyon geçmek (perfüzyonun başlamasından itibaren toplam 60 saniye tamamlamak için). TIF formatında film kaydedebilirsiniz. Not: yani en büyük çevre uzunluğu (Şekil 2A) ile şekli ve iyi odaklanmış hücre konturuna sahip küresel: aşağıdaki kriterleri yerine mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri ile bir görünüm alanı seçin. </li></ol> ImageJ Kullanarak Hücre Hacmi Değişim 4. Analizi NOT: analiz etmekBir şişme hücrenin görüntülerin dizi, &#39;Image Explorer&#39; ve (Xavier DRAYE tarafından yazılmış) ImageJ yazılım 14 &#39;Asal Analyzer&#39; eklentileri kullanabilirsiniz. Ilk zaman noktasında seçilmiş protoplastları ile başlayarak, &#39;protoplast Analyzer&#39; eklentisi otomatik protoplastlar kenarları (kontür) algılar ve (eklentileri altında PfFit analiz programı ile kullanılabilir), deney sırasında alanlarında zaman sürecini hesaplamak . <ol><li> ImageJ başlatın. Onlar açılmak gibi filmi açmak için, açılan menüleri ard arda, sonra, ImageJ panelde &#39;Dosya&#39; tıklatın: &#39;Al&#39; ardından &#39;Image Explorer&#39;. Seçilen filmi vurgulayın, daha sonra üzerine sağ tıklayın, ardından &#39;Asal Analyzer&#39; üzerine tıklayın bıraktı. Deney sırasında büyük ölçüde hareketsiz kalır protoplastlarını tanımlamak için (protoplast görüntü altındaki kaydırıcıyı kullanarak) film göz atın - bu analiz edilecektir. Geri ilk ima üzerindege, fareyi kullanarak, daha sonra ortaya çıkan &#39;Algılama parametrelerinin&#39; tablosunda &#39;Tamam&#39; ı tıklatın, seçili protoplastların (Şekil 2B) etrafında (ImageJ çizim araçları aldım) daireler çizin. </li><li> Protoplast algılama algoritması başlatmak için, açılır menüden sonra, protoplast görüntü üst panelde &#39;Süreci&#39; Yerel &#39;tıklayın. Film boyunca seçilen protoplastlarının (Şekil 2C) etrafında yeşil daireler inceleyin. Bir Excel dosyası &#39;Sonuç&#39; kaydedin. ImageJ çıkın. NOT: Bir kırmızı nokta belirir durumda (kötü bir kontur uyum göstermek için - genellikle nedeniyle kötü bir görüntü kontrast) farklı parametreler ile yeniden. </li><li> Her bir hücreye ait satırları ayırmak için (- İki veya daha fazla hücre eş zamanlı analiz edildi - eğer analiz çerçeve çerçeve yapılır, çünkü iç içe olacak), Excel, hücre sayısı sütunu (&#39;nesne&#39; tarafından kaydedilen verileri sıralamak ). </li><li> DETE içinP f gerçek değeri elde etmek için piksel-um dönüşüm faktörü rmine aynı 20X mikroskop objektif ile bir mikrometre hükümdarın bir görüntü oturtun. Cetvel görüntüsü boyunca (ImageJ çizim araçları aldım) bir çizgi sürükleyin ve ImageJ Ana panelin altındaki cetvel uzunluğu piksel sayısı eşdeğer okuyun. Um 2 içine Excel dosyasındaki keyfi piksel alanı değerleri dönüştürmek. Bir metin dosyası olarak (her hücre için ayrı ayrı) (sayıların iki sütun yalnızca) alanlar zaman ders kaydedin. NOT: Bu birim-uydurma &#39;PfFit&#39; programına bir giriş olacaktır. </li></ol> 5. ImageJ ve Matlab Programı P f Fit kullanarak Deneysel Odası&#39;nda Ozmolarite Değişim Oranı Modelleme <ol><li> Izotonik çözeltisi (&#39;endikatörü bir boya&#39; üretmek için) 100 ml iksilen siyanol, 2 mg (Tablo 1, aşağıda) ekleyin. </li><li> Gösterge Boya ve olmayan boyalı h (3.1 gibi) perfüzyon sistemi hazırlayınypotonic çözeltisi. </li><li> Bir kayar kapak (daha önce olduğu gibi asal hücreler) ile örtün ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin, yavaşça bir işaret boya ile odacığını doldurmak, Pleksiglas odasının tabanına silikon yağı ile bir kapak kayma Seal. </li><li> Perfüzyon sistemine ve pompa odasına bağlayın ve L. ml / dakika bir sabit perfüzyon için bir işaret boya akışını açın. </li><li> 1 Hz hızında 60 saniye filmi kaydedin. Gösterge Dye 15 sn Kaydı başlatmak, 45 saniye boyunca hipotonik çözüm geçmek. Filme durdurun. Gösterge Dye (en az 30 saniye boyunca) ile aynı hizada, daha sonra yeni bir film başlar. 6 kez ve tüm filmleri kaydetmek - yaklaşık 5 tekrarlayın </li><li> Değişen geçirgenliği bir ortalama zaman ders almak için Gösterge Boya geçirgenliği video görüntülerini analiz etmek ImageJ yazılımını kullanın. <ol><li> ImageJ başlayın, &#39;Dosya&#39;, ardından &#39;Aç&#39; düğmesine tıklayın ve film için göz atın. Her film için, 10 piksel genişliğinde dikey çizinFilmin 1. görüntü üzerinde herhangi bir yere dikdörtgen. Sonra açılır menüsünde &#39;Crop&#39; tıklayın, ImageJ ana panelde &#39;Image&#39; tıklayın. </li><li> &#39;Montage olun&#39; Yığınlar &#39;ve (sütunlar 60, satırlar 1): onlar açılmak gibi yine&#39; Image &#39;tıklayın, bir satır (60 sn film) 60 kare hizalamak için, ardından açılan menülerde arka arkaya tıklayın. Her yerde görüntülerin bütün satır boyunca 1 piksel yüksekliğinde yatay dikdörtgen çizin ve ImageJ ana panelde &#39;Analiz&#39; ı tıklatın, sonra açılır menüden &#39;komplo profili&#39; ı tıklatın. NOT: (gösterilmemiştir) görünecektir pencerede A &#39;Montage Plot&#39;, ve geçirgenlik verileriyle bir liste onun menüden açılabilir. Filmin her görüntü onun 10 piksel genişliğinde dikdörtgen ve dolayısıyla &quot;zaman tabanı&quot; menşeli 10 geçirgenlik değerleri ile bu listede temsil edilir (görüntü ardışık sayı) 10 kat daha uzundur. </li><li> Geçirgenliği dat listelerini kopyalayınBir Excel dosyasına (film başına bir liste). Gösterge Boya sürgünlerinin çeşitli filmlerde elde geçirgenliği zamanlı kurslar ortalama. 0.1 ile görüntü sıralı sayısı çarpılarak gerçek zamanlı tabanı oluşturmak. Bir metin dosyasına ortalama zaman ders (iki sütun) kaydedin. NOT: Ortalamanın önce, eğer istenirse, herhangi bir usulsüzlük reddetmek, bireysel zamanlı kurslar arsa. Film Gösterge Dye kararlı durum geçirgenliği en az 5 Final sn de içerir emin olun. </li></ol></li><li> Ozmolaritenin zaman dersin çeşitli parametreleri hesaplamak için Matlab uydurma programı P f Fit (&#39;Gösterge Oturan&#39; paneli, Şekil 3) başlatın. Not: banyosunda çözeltinin bilinen ilk ve son yoğunluklara dayanan, çözeltinin ozmotik değişen konsantrasyon zaman süreci varsayılarak, (Gösterge Boya geçirgenliğinden, sırayla, hesaplanan) konsantrasyon zaman süresi hesaplanır aynı dinamikleri izlerboya konsantrasyonu. P f Fit ücretsiz olarak kullanabilecekleri bir programdır. P f Fit programı ile kullanıcıya tanıtmak için yardımcı bir Ek dosyası olarak vallahi erişilebilir detaylı açıklamalar ve tanımlar P f Fit Kullanım Kılavuzu &#39;:&#39; PfFit_Installer_web.exe &#39;dan indirebilirsiniz. </li><li> &#39;Gösterge Oturan&#39; panelinde, Gösterge Boya geçirgenliği (&#39;Gösterge veri dosyası&#39;, Şekil 3A) ortalama süre dersin veri almak ve elle mevcut deney parametreleri ve parametrelerin genişliği &#39;ve&#39; ilk tahminler takın t_half Gösterge Boya konsantrasyonunun zamanlı kurslar araziler (gerçek veri ve formda Şekil 4A) görüntülemek için Çalıştır &#39;Gösterge Boya konsantrasyonu (Şekil 3B zaman sürecini anlatan. Click&#39; ve modellenmiş (hesaplanan) banyo ozmolaritenin (Şekil 4B) NOT:. agVerilere ood uygun esastır (bir öneri: Şekil 3&#39;te gösterilen değerlerle başlatın). </li></ol> 6. Matlab Montaj Program P f Fit kullanarak P f Belirlenmesi NOT: Bir doğru ve mükemmel osmometresi 11 gibi bir Protoplastın davranışı ile ilgili temel varsayımlara ilave olarak, P f belirlenmesi P f P f bu dinamikleri zaman altında yatan neden olduğunu, zamanla değişebileceğini karinesine dayanır hücre hacmi değişim seyri ve bu üç parametre bunu açıklamak için yeterli: P fi (P f başlangıç ​​değeri), Eğim Pf (P f doğrusal değişim oranı) ve Delay (banyo baştan dönemi Hücre hacminin değişim başlamasından itibaren osmolarite fark). Farklı modeller null değerleri 11 dahil olmak üzere farklı bu parametrelerin kombinasyonları ve bunların değerleri, dahil, test edilebilir. P <suB&gt; Fit elde etmek için bu parametrelerin en iyi kombinasyonu için arama f - hesaplanmasıyla - hücre hacim değişikliği 11, hesaplanan deney süresi tabii ki en güvenilir üretimi, sonra da hücre-kontur alanlarında ithal dizisinden (bakınız Ayrıca Ek &#39;P f Fit Kullanım Kılavuzu&#39;). <ol><li> &#39;Ses Fit&#39; paneli (Şekil 5) geçin. Ithalat için alanları veri dosyasını (analiz protoplastlarının, Şekil 5A bir &#39;alanlar&#39; zamanı ders ile metin dosyası) seçin. Parametresi kaynak olarak &#39;Son Göstergesi Uydurma&#39; seçin (Şekil 5B; alternatifler için &#39;P f Fit Kullanım Kılavuzu&#39; bakınız). NOT: Bu parametreler (Şekil 5D) ve sonra prosedür montaj hacimleri için banyo ozmotikum değişim yeniden oluşturmak için kullanılır. </li><li> &#39;Ses Fit&#39; paneli (Şekil 5C) olarak, başlatılamadı (için ilk tahminler) P f parametreleri doldurmak: P f Eğim Pf ve Gecikme (bir öneri:, modeli &#39;Sınıf&#39; Seçti sırasıyla 1, 1, ve 30,) ile başlar (bir öneri: II ve işareti ile başlayın her üç parametre için &#39;çek&#39;) takılacaktır. Daha sonra ara rakam (Şekil 5E) küresi ve gerekirse Gecikme parametre ve kayıt uzunluğunu ayarlamak, &#39;Run&#39; tıklayın. </li><li> Uyum kalitesini değerlendirmek ve uygun hatayı kaydetmek için sonuçlar grafiği (Şekil 6) inceleyin. Birkaç her kat başlatılırken parametrelerini değiştirmek ve &#39;-&#39;Run yeniden. NOT: Program takılıyor zaman cesaretini etmeyin - sadece programı yeniden başlatın! </li><li> Uyum hata en düşük değer amaçlayan, başlatma parametrelerinin farklı kombinasyonları ile başlayan, bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Ekrandan doğrudan uyum sonuçlarının listesini kopyalayın, ya da t onları bulmako _FIT_Vol_Results.txt &#39;dosyası oluşturulan PfFit. </li></ol>

<ol>
	<li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles.">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li><li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Novel+functions+and+regulation+properties.">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227 (2007).</li><li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions.">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).</li><li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+aquaporin+activity.">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li><li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development.">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li><li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts.">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li><li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress:+a+target+of+xylem-borne+ABA?.">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?.</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li><li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root:+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers.">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li><li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation.">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li><li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121.">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li><li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane.">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li><li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells.">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li><li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production:+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2;2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion?.">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?.</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li><li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues.">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).</li><li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount.">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li><li>Hosy, E., Duby, G., V&#233;ry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context.">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li><li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants.">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Burada tarif edilen başka bir küresel hücrelerin de, ilke olarak uygulanabilir izole bitki protoplast P, K, örn., Kurbağa oositlerine 11 ölçmek için basit ve çok etkili bir yöntemdir. Bu metot, hücredeki bir ozmotik teste karşı tepki olarak P f ölçülmesi esasına dayanır. Bu yaklaşıma göre, diğer yöntemlerin aksine, bununla birlikte, ozmolarite çözeltilerinin değişimi, yani, bazal hücre hacmi olan izotonik çözeltisi ile başlayarak sürekli ...

Hücresel zarların arasında su alımı ve akış hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de bitki varlığı için temel bir gerekliliktir. Hücresel düzeyde, aquaporinler (AQPs) hücre membranı 1-3 ozmotik su geçirgenlik katsayısı (P f) düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler farklı bitki organlardan Protoplastın endojen P f ölçüm istihdam edilmiştir (yani kökleri, mezofil, endodermis, vb., Chaumont&#39;dan ve ark. 4 tarafından incelenmiştir). P f ölçmek için yaklaşımlardan biri ozmotik bir meydan protoplastlarını maruz ve hacmi değişim başlangıç ​​hızını izlemek için (yani., Hacim değişimi erken doğrusal faz eğimi). İki farklı yöntemleri daha önce çözümlerin bir anlık değişimi bu yaklaşıma dayanarak tarif, hem esas alınmıştır. Birincisi Hareketsizleştirme oluşmaktadırbir emme mikropipet ile protoplast ing ve çözelti akışını 5 ve bir mikropipet 6 kullanarak bir çözümden protoplast aktarılması ikinci bir anahtarlama. Hızlı çözüm döviz çok başında görüntü toplama izin bu mikropipet emme ve mikropipet aktarılması yöntemleri, büyük olasılıkla protoplastlannda fiziksel stres içeren, (hacim değişim erken doğrusal faz yakalamak için) ve özel ekipman ve uzman Mikromanipülasyondan gerektirir. Burada tarif edildiği gibi bir yöntem içerir Mikromanipülasyondan ve banyo perfüzyon anlık değilken p f türetilmesini izin verir hücrelere bozulmasını minimuma indirmesidir. Enzimatik sindirimden sonra bir izotonik çözelti içinde suya batırılmış olan protoplastlar, yük etkileşimi ile lamel cam bir pleksiglas tabanı (aka Lucite veya pleksiglas) bölmesi üzerinde immobilize edilir. Daha sonra, sabit bir Banyo perfüzyonu esnasında,izotonik çözelti, protoplastlar için hypoosmotic talebin oluşturulması hipotonik bir solüsyon ile uzağa akıtılmaktadır. Protoplastın şişme video çekilir ve daha sonra, banyo perfüzyon bir zaman süreci ve hücre şişmesi zamanla ilgili enformasyonun birleştirilmesiyle, P f görüntü işleme ve eğri uydurma prosedürleriyle belirlenebilir olmasıdır. Bu yöntemin avantajı, deney çok etkili olduğunu olan tek bir analizinde aynı anda birkaç hücre kontrol etmek mümkündür, ve özel ekipman veya belirli bir mikro manipülasyon beceri gerektirmez dikkat edilmelidir. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar mümkündür. Örneğin, mezofil gibi farklı dokular ve bitkiler, bir hücre çeşitli doğal p f belirlenmesi ve Arabidopsis yaprağı 7, mısır yaprak mezofil veya kök korteks hücreler 8-10 ya da süspansiyonunda kültürlenmiş hücrelerden 11,12 ikinci kılıf hücreleri ile birlikte gelmektedir. Additi içinde, bir oosit bu hücreler 11 olarak küresel hayvan hücrelerinin P f belirlemek mümkündür. P f katkıları ve belirlenmesi; başka bir örnek protoplastlarında (örneğin Kinazlann genler veya herhangi diğer genlerin onları etkileyebilir) kendi geninin geçici ifade ile AQP faaliyet incelenmesini içermektedir; 2 PEG dönüşüm ve kararlılıkla SlTIP2 tarafından Arabidopsis&#39;teki mezofıl protoplastlarında,, örneğin, domates AQP SlTIP2 ifadesi için 13 f P 2-ilişkili. Son olarak, (gibi ilaçlar, hormonlar,) farklı molekül / maddelerin P f üzerindeki etkisinin incelenmesi de AQP engelleyici HgCl 2 7 örneğin, incelenebilir çözeltilerine ilave edildi. Aşağıdaki protokol, Arabidopsis mezofil hücreleri ve bunların p f belirlenmesi protoplastların izole edilmesini tarif etmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

AQP düzenleme mekanizmaları incelenmesi hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de su ilişkileri anlamak için önemlidir. Ozmotik su geçirgenlik katsayısı, bitki protoplastlarına (P f) örneğin kurbağa oositlerine gibi küresel hücrelerin de ilke olarak uygulanabilir belirlenmesi için basit ve çok etkili bir yöntemdir burada sunulmuştur. Deneyin birinci aşaması, uygun bir izotonik çözelti ile bir bölme içine enzimatik sindirme ile ilgi konusu bitki dokusundan protoplastların izolasyondur. İkinci aşama, bir ozmotik meydan deneyi oluşur: bölmenin altındaki hareketsiz protoplastlar hipotonik bir solüsyon ile bir izotonik çözelti ile sürekli bir başlangıç ​​perfüzyon sunulmuş ve izlenmektedir. Hücre şişmesi video kaydedildi. Üçüncü aşamada, görsel birim değişikliklere yol isimli işlenir ve hacim değişikliklerini gösteren zaman süreci osmola değişimin zaman seyri ile ilişkilidiroda perfüzyon ortamının lik P f vermek üzere, Matlab (&#39;PfFit&#39;) yazılmış bir eğri uydurma bir prosedür kullanma.

Farklı AQPs aktivitesini P f belirlenmesi ve karşılaştırılması amacıyla, Arabidopsis yaprağı mezofil protoplastlar kullanılırlar. Bu protoplastlar düşük bazal (temel) p f seviyeleri 7 sahip oldukları bulunmuştur ve yeniden üretilebilir bir p f ölçümleri etkinleştirmek için bir fonksiyon-ekspresyon sistemi olarak hizmet verebilir. 6 haftalık Arabidopsis olgun bir bitki yapraktan Asal hücreler izole edilmiştir ve üç gen Ar...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example at JoVE.com

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Hücrelerin ozmotik su geçirgenliği katsayısı (P f) Ölçme aquaporins düzenleyici mekanizmaları (AQPs) anlamanıza yardımcı olabilir. Burada yer küresel bitki hücresi protoplastlarının P ön tespiti protoplast izolasyon ve sürekli Banyo perfüzyonu sırasında bir ozmotik meydan okuma sonucu olan hacim değişim başlangıç ​​hızının sayısal analizini içerir.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

15.9K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem.  Hücrelerin ozmotik su geçirgenliği katsayısı (P f) Ölçme aquaporins düzenleyici mekanizmaları (AQPs) anlamanıza yardımcı olabilir. Burada yer küresel bitki hücresi protoplastlarının P ön tespiti protoplast izolasyon ve sürekli Banyo perfüzyonu sırasında bir ozmotik meydan okuma sonucu olan hacim değişim başlangıç ​​hızının sayısal analizini içerir. 

Video: Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biyoloji

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Karakterize Otobur Direnç Mekanizmaları: Spittlebugs Brachiaria Spp. Bir Örnek

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Bir örnek olarak

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...