This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOT: Deneyler Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kanada Kılavuzu&#39;na uygun olarak yapıldı ve Université Laval Hayvanları Koruma Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Numune Hazırlama NOT: Bu örnekte, doğum sonrası 1. günde, fare beyni kullanılır. <ol><li> 3 yavrular için en az 4 için ezilmiş buz hipotermi anestezi kullanın, sonra buz gibi soğuk L15 ortamında mümkün olduğunca çabuk beyinleri teşrih. 2 dakika içinde bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Aktarım disseke kalıp (materyalininin cf. Liste) gömme beyinleri ve istenilen konumda numune yönlendirmek için özen dondurulmuş doku gömme medya ile doldurun. -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve mağaza hemen örnekleri dondurun. 30 saniye içinde bu adımı gerçekleştirin. NOT: Örnekler RNA kalitesinden ödün vermeden birkaç ay saklanabilir. </li></ol> 2. Kesit <ol><li> Sağlıgı membran coated cam slaytlar (cf. malzemenin listesi) yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile RNases herhangi bir iz ortadan kaldırmak için. DEPC su slaytlar yıkayın ve kurumaya bırakın. Alternatif olarak, bir gecede 200 ° C&#39;de fırında slaytlar. </li><li> Daha önce bir yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile temizlenmelidir bir kriostat dondurulmuş örnekleri aktarın. 10 mikron kalınlığında -20 ° C ve dilim örneklerinde Set kriyostat odası sıcaklığı. Membran kaplı slaytlar üzerinde doku bölümleri toplayın ve boyama önce onlara kuru 10 dakika sürdü. Alternatif olarak, mağaza boyama kadar -80 ° C&#39;de slaytlar. </li></ol> Boyama Çözümleri 3. Hazırlık <ol><li> Sadece deney başlamadan önce tüm çözelti hazırlayın, ve RNA bozulmasını önlemek için (yıkama çözeltileri için hariç) boyama Çözeltilerin RNaz inhibitörü kullanımı. </li><li> Tampon çözeltisi hazırlayın. % 1 BSA ilave RNAse içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS oluşan tüm çözümler aynı tampon () kullanarak% 0.2 Triton ve% 2 RNaz inhibitörü). Her bir slayt için, tampon çözelti içinde 400 ul (primer, 200 ul ve ikincil antikorlar için 200 ul) hazırlayın. </li><li> Sabitleyici çözeltisi hazırlandı:% 70 etanol kullanmak -20 ° C&#39;de tutuldu. RNA ekstraksiyon veriminde ciddi bir azalma önlemek için minimal doku tespit prosedürü tutun. Not: Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de tutuldu ve% 5 asetik asit ilave% 95 etanol solüsyonu kullanın. </li><li> Tampon çözeltisi içinde birincil antikor seyreltilmesiyle primer antikor çözeltisi hazırlayın. Dopaminerjik nöronlar etiketleme için, tirozin hidroksilaz (TH, oran dopamin üretimi için enzim sınırlayıcı) hedefleyen bir antikor kullanın. Pratik inkübasyon süresi telafi etmek için antikorun daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. 01:25 bir seyreltme TH antikoru kullanın. NOT: 1.000: Normal immünofloresan protokolü, bu antikor, bir 1 seyreltme gece boyunca kuluçkalanmıştır güçlü bir sinyal verir. Bu protokolde, bu 40X daha konsantreler kullanılırKısa inkübasyon süresi nedeniyle ed. Bu nedenle yöntem için kullanılan yüksek antikor konsantrasyonu için spesifik olmayan etiketleme herhangi bir artış kontrol etmek için paralel olarak standart bir immün gerçekleştirin. </li><li> Tampon çözeltisi içinde sekonder antikor seyreltilmesiyle ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. 100: 1 bir konsantrasyonda biyotinile edilmiş ikincil antikor kullanın. NOT: Bu örnekte, bir anti-tavşan biyotinile antikor kullanılır. </li><li> Biyotinlenmiş sekonder antikor tespiti için avidin-biyotin kompleksi (ABC) çözeltisi hazırlayın. 1 arasında bir konsantrasyonda bileşik A ve bileşik B eklenerek ABC çözeltisi oluşturunuz: DEPC PBS içinde seyreltilmiş 100 uL% 2 RNaz inhibitörü ile takviye edilmiştir. Slaytlar eklemeden önce Avidin-Biotin kompleksi 30 dakika hazırlayın. </li></ol> 4. Boyama <ol><li> Hızla havada onları iterek ° C -80 zaman bir ya da iki slaytlar çözülme (ya da bir hava üfleyici kullanın). Hidrofobik ile Surround bölümlerbariyer kalem ve bir kaç saniye kurumaya bırakın. <ol><li> -20 ° C &#39;de en fazla 5 dakika boyunca soğuk halde sabitleyici çözeltisi slaytlar koyun. Çamaşır yıkama için DEPC PBS 6-8 kez slaytlar hızlı, daha sonra fiksatif çözüm fazlasının ayrılması daldırma havada kez çalkalayın. </li><li> DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar Flick. Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun. </li></ol></li><li> Temiz bir tepsiye yerleştirin kayar (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile önceden tedavi edilen RNaz&#39;larına herhangi bir izi ortadan kaldırmak için) ve oda sıcaklığında 10 dakika için her bir sürgü (tavşan anti-TH) birincil antikor çözeltisi 200 ul koyun. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve DEPC PBS aşırı kaldırmak için bir kez slaytlar fiske. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca Her bir slayt, ikincil antikor çözeltisinin 200 ul koyun. Dip hızlı yıkama için DEPC PBS içinde 3 kez slaytlar ve DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar fiske. </li><li> ABC Solu 200 ul koyunoda sıcaklığında 4 dakika boyunca Her bir slayt yon. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve aşırı DEPC PBS kaldırmak için slaytlar fiske. </li><li> DAB (3,3 &#39;diaminobenzidin) ABC çözeltisi içinde inkübasyon 4 dakika boyunca çözelti hazırlayın. Kit (DAB Peroksidaz Yüzey Kiti) sağlanan reaktifler kullanın. Sağlanan tampon 1 damla, DAB solüsyonu 1 damla ve DEPC su 2.5ml% 30 H 2 O 2 1 damla karıştırın. Ters çevrilerek çözüm karıştırın. </li><li> DAB çözeltisi 196 ul al ve slaytlar üzerinde yayılan önce RNaz inhibitör çözeltisinin 4 ul (% 2) ilave edin. Talep (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile ön muamele edilmiş), temiz bir tepsi üzerine kayar ve slaytlar üzerinde DAB çözeltisi 200 ul koyun. NOT: DAB çözümü within1 veya 2 dakika tepki gerekmektedir. </li><li> Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve mutlak etanol birkaç saniye slaytlar koydu. Havada onları iterek slaytlar kurulayın (ya da bir hava üfleyici kullanın). &lt;Br /&gt; Not: Slaytlar gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklandı veya LCM işlenebilir. </li></ol> 5. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon <ol><li> Havada onları iterek hızla slaytlar defrost (ya da bir hava üfleyici kullanın). Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun. </li><li> LCM geçin. Toplama tüp kapağı bakacak örnek tarafı mikroskop altında slayt yerleştirin. Numune için en iyi büyütmeyi seçin. Ilgi hücreleri görmek için odağı ayarlayın. <ol><li> Kesim alanı tanımlayın ve lazer ile kesim başlar. Parçalara hücreleri ya da (RNA ekstraksiyon kiti) liziz tamponunda 50 ul ile dolu toplama borusu kapağın doku parçası toplayın. LCM adım 30 dakika aşmadığı emin olun. </li></ol></li><li> Bir RNA özütleme kiti (cf.. Malzeme listesi) kullanılarak izole hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin. Üreticinin protokolünü takip ediniz. <ol><li> 42 ° C&#39;de 30 dakika boyunca toplanan hücreleri inkübehücreler lize edildi. Ön koşul klima tampon 250 ul ekleyerek RNA saflaştırma sütun. Yük tabii tutulan parçalanmış hücrelerin etanol 50 ul. Önceden koşullandırılmış bir arıtma kolonuna lize hücreler 100 ul yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında, 2 dakika için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin sütunu. Yıkama tampon ile iki kez kolon yıkayın. RNAse içermeyen su minimal önerilen hacmi (11 ul) Zehir (bu BioAnalyser engel olabilir gibi muamele DEPC değil). Test kalitesine 2 ul tutun. Not: Bütün çözeltiler ve reaktifler kit sağlanmaktadır. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Sentezi ve Nicel RT-PCR <ol><li> -Ters transkribe ters transkriptaz ve oligo (dT) kullanılarak tamamlayıcı DNA&#39;ya lazer yakalanan dopaminerjik hücrelerinden RNA örnekleri. Üreticinin protokolü (bkz. Malzemenin listesi) izleyin. </li><li> Gen spesifik primerler ile QRT-PCR için cDNA 1 ul kullanın. Set up PCR reaNicel PCR için bir tek bileşenli sıcak başlangıç ​​reaksiyon karışımı ile 20 ul hacim içinde seksiyonlar, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi. Her biri üçlü halde reaksiyona yürütmek. <ol><li> Burada tarif edilen deneyler için, aşağıdaki primer çiftler kullanılarak: GAPDH-F (5&#39;-CCA AGA CCC AGA CTG TGG AT-3 &#39;), / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GTT GAT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC ACC GTA TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC-3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC&#39;si-F (5&#39;CAT GAG AGC TTC TGC SKK TC -3 &#39;) / AADC&#39;si-R (5&#39;GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> Ardından hızlı döngü parametreleri kullanılarak kantitatif RT-PCR amplifikasyonu yapın: 95 ° C, 10 saniye 45 döngü, 95 ° C, 60 ° C &#39;de 10 saniye ve 72 ° C&#39;de 10 saniye, ardından 5 dakika karıştırıldı. Belirlenme aracın varsayılan ayarı kullanarak erime eğrisi analizi yapınne homojen ürün oluşumu. </li><li> Yerleşik yazılım kullanarak verileri analiz edin. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 14 nispi ekspresyon seviyelerini elde etmek için, iki referans gen, GAPDH ve Rpl13a sentezlenmesi DA markör genleri Th ve AADC ifade değerleri normalize. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+methods+and+applications.">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection.">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li><li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository.">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li><li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR.">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li><li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons.">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938 (2013).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons:+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism.">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li><li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies:+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry.">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li><li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntemin en kritik nokta RNA bozulmasını önlerken ilgi hücreleri etiketleme oluşur. RNases sulu çözeltilerde aktif olarak kuluçka süreleri azalan RNA koruma 11,15 geliştirir. Kullanılan tüm çözümler RNases inaktive DEPC ile tedavi edilmelidir. Tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz&#39;larına kirlenmeyi önlemek için bir yüzey RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilmesi gerekir. Son olarak, bu koşullar altında, her Çözeltilerin RNaz inhibitörü ilave bozunmadan RNA koruma etkili...

Beyin, karmaşık ağlar oluşturan farklı nöron tiplerinin çok çeşitli oluşmaktadır. Bu nöronlar kendi morfolojisi, bağlantı ve gen ifadesi desen 1&#39;e göre farklı gruplar ve alt organize edilmektedir. mikrodizileri gelişimi, yeni nesil dizileme ve Mah-PCR, farklı biyolojik bağlamlarda 1,2 nöronal nüfus gen ekspresyon profillerini karşılaştırma olanağı sundu. Bu hassas analizler RNA bütünlüğü 2-4 tutarken ilgi hücre tiplerinin kesin belirlenmesi ve izolasyon gerektirir. Floresan etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) tekniği çok hücre yüzeyi işaretleri ve / veya morfolojiye göre özel hücre tiplerini izole etmek için kullanılmıştır. FACS uzamsal çözünürlük 5 tam bir kayıp ile sonuçlanır önce sıralama, bir hücre ayırma aşamasını gerektirir. Bir çok alt-popülasyonları bulunduğunu nöronal th anatomik dağılıma göre birbirlerinden ayırt edilirlerE beyin. İnce beyin bölümlerinde uygulanan lazer yakalama mikrodiseksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü 6-8 ile hücrelerin spesifik izolasyonu için uygun bir seçenek sunar. LCM önemli bir sınırlama, morfolojik kriterlere ya da genetik olarak hayvan modellerinde tasarlanmış floresan protein muhabir göre ilgi hücreleri belirlemek için bir ihtiyaç olmuştur. LCM ile kombinasyon halinde, bir RNA bütünlüğü korunur pratik immün yöntemleri gerçekleştirmek için yeni tekniklerin geliştirilmesi, hemen gen profil deney devam etmek için hücre alt izolasyonunu sağlar. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az sayıda yayın 1,9-13 tarif edilmiştir. Burada, biz LCM ile hızlı immün birleştirerek karmaşık bir doku yapısında belirli bir hücre alt kümesi yüksek kaliteli RNA elde etmek için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz maksimum RNA kurtarma elde etmek için anahtar kritik adımları uygulayın ve sig olabilir RNA bozulmasını önlemek için nasıl göstermekanlamlı ölçüde etki gen ekspresyon profili. Bu protokolün gösteri için, bir günlük fare orta beyin dopaminerjik nöronlar hedef alındı. Dopaminerjik nöronlar, tirosin hidroksilaz (TH) karşı yönlendirilmiş bir antikor, dopamin sentezi için oran-sınırlayıcı enzim kullanılarak imüno edilebilir. TH immun boyama sonra, tek tek ya da dopaminerjik nöronların grupları daha sonra LCM kullanılarak izole edilebilir. Microdissected hücreler lizis tamponu içinde toplanır ve RNA, RNA izolasyon kiti kullanılarak ekstre edilir. Kalite ve çıkarılan RNA miktarı Bioanalyzer 5 kullanılarak ölçülmektedir. Kullanılarak gen tanımının diğer analizleri: RNA sıralanması, mikrodizi veya qRT-PCR, daha sonra 2,4,6 gerçekleştirilebilir. Bir örnek olarak, bir iki-aşamalı QRT-PCR lazer yakalanan izole dopaminerjik etki ile gösterilmiştir. Iki dopaminerjik nöron marker genlerinin ekspresyon seviyeleri rölatif ölçümü, bu protokol seçicilik göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yüksek uzaysal çözünürlüğü ile ince doku bölümleri belirli hücrelerin izolasyonu sağlar. Etkili LCM heterojen doku hücreleri alt popülasyonlar hassas tanımlanmasını gerektirir. LCM ilgi hücrelerin tanımlanması, genellikle morfolojik kriterlere veya flöresanlı proteinin, muhabir dayanmaktadır. LCM ve hızlı immunolabeling kombinasyonu alternatif ve etkili bir araç özel hücre tiplerini görselleştirmek ve çevresindeki doku onları izole etmek için sunuyor. Kaliteli RNA daha sonra saf hücre popülasyonu elde edilmesi ve daha RNA dizileme, mikrotertibin veya Mah-PCR olmak üzere mansap uygulamalar için işlenmiş olabilir. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az yayınlarda tarif edilmiştir. Bu makalenin amacı nasıl LCM kullanarak bu özel hücrelerin izole RNA bütünlüğünü tutarak, ve sırasında hücre popülasyonu hızla immün gerçekleştirmek için nasıl göstermek için. Burada, biz göstermekd immün ve bir günlük farelerden elde edilen beyin dokusu dopaminerjik hücrelerin yakalamak için bu çok aşamalı bir prosedür. Biz özel dikkat hak anahtar kritik adımlar vurgulayın. Bu protokol, doku ve ilgi çeşitli hücreler için adapte edilebilir. Farklı alanlardan gelen araştırmacılar büyük olasılıkla bu yaklaşımın gösterilmesi yararlanacaktır.

Bu hızlı immün prosedürü RNA bütünlüğünü koruyarak ilgi hücrelerin görselleştirme sağlar. 1 RNA ekstraksiyon öncesi doku hazırlık aşamaları göstermektedir Şekil. Cryosectioning sonra, dopaminerjik nöronların tirosin hidroksilaz karşı yönelik bir antikor (işaretlenmiş nöronlar kahverengi görünür) ile etiketlenmiştir. Deney Söz bağlı olarak, tek bir hücre ya da ilgi daha büyük bölge LCM kullanılarak izole edilebilir (Şekil 1D - <...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling at JoVE.com

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Görüntüleme.  Université Laval.  Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biyoloji

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em&gt; Drosophila</em&gt; Folikül İzolasyon

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...