Biz reaktifler için Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: GFP hattı), Bloomington Stok Merkezi&#39;ni ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası&#39;na teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yazının yararlı tartışmalar ve eleştiriler için Tootle Lab tüm üyelerini teşekkür ederim. Dan fon Ulusal Bilim Vakfı MCB-1158527, ve Anatomi ve Hücre Biyolojisi Bölümü&#39;nden start-up fonları, Iowa Üniversitesi bu çalışmaları destekledi. Farmakolojik Bilimler T32GM067795 Sağlık predoctoral Eğitim Grant National Institutes AJS desteklenmektedir. Veri depolama desteği Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Grant UL1RR024979 yoluyla Translational Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen CTSA yoluyla finanse edilmektedir ICTS tarafından sağlandı.

1.. Drosophila önce İzolasyon Sahne için hazırlanıyor <ol><li> Damıtılmış su 90 ml ile aktif kuru maya, 50 g ıslak maya birleştirerek hamur yapın. Birleştirmek için bir spatula ile karıştırın. Karışım kıvama değerlendirilmesinden önce ~ 30 dakika bekletin. Tutarlılık, sadece yeterince kalın bir sinek flakon tarafına uymak için değil, yüzü aşağı koşmak olmalıdır. İstenilen kıvama ulaşmak için bu ilave 10 ml su veya kuru maya küçük bir miktar kadar eklemek için gerekli olabilir. 4 ° C de kapalı bir kap içinde depolayın Mayanın ~ 1-2 hafta içinde de kullanılabilir. </li><li> &lt;Istenen genotip 24 saat yetişkin sinekler (erkek ve kadın her ikisi de) toplamak ve sinek gıda artı şişenin tarafında bulaşmış ıslak maya hamuru ile bir şişeye koydu. Sinekler muhafaza edildiği sıcaklık deney bağlı olarak değişecektir. Rutin deneyler için, sinekler, oda sıcaklığında muhafaza edilir. Oysa bir gen olduğu deneylerUAS/GAL4 sistemi 15 kullanılarak aşırı eksprese edilmiş, uygun olarak, 25 ° C ya da daha yüksek sinekler muhafaza gerektirebilir. </li><li> 2 gün boyunca günlük maya hamur taze bir smear ile sinekler sağlayın. NOT: Eğer folikül gelişimi sıkı dişi sineğin beslenme durumuna göre düzenlenir gibi, diseksiyon önce en az 36 saat boyunca zengin besin maya hamur ile sinek sağlamak esastır. </li></ol> 2. Yalıtımlı Orta-geç Drosophila folikülleri Sahnelenen <ol><li> Medya, oda sıcaklığında (~ 30 dk) gelmesini bekleyin. Aşamalı köklerinin in vitro geliştirme deneyleri için kullanılacak olacak, taze IVEM ortam hazırlar (Grace böcek ortamı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 1 x penisilin / streptomisin). Sahnelenen folikülleri mRNA veya protein izolasyonu Grace&#39;in böcek veya IVEM medya kullanabilirsiniz için kullanılan olacak iseniz. ÖNEMLİ: Medya sıcaklığı önemlidir. Ortam soğuk ise, o değiştirecektiraktin ve mikrotübül cytoskeletons ve blok geliştirme hem. </li><li> CO 2 gazı enjekte edilerek mayalı flakon sinekler uyutmak ve CO 2 altında bir sinek ped üzerine 3-5 dişi sinekler yerleştirin. ÖNEMLİ: sinek pad üzerinde bir 10 dakika süre içinde disseke edilebilir daha fazla kadın bırakmayın CO 2 uzatıldı maruz kalma gibi neden olabilir sterilite ve ölüm. </li><li> Medya ile 9-nokta plakanın bir kuyu doldurun ve (siyah pleksiglas bir parça iyi çalışır) Karanlık bir yüzeyin üstüne yerleştirin. Kuyunun altındaki kesme kapsamı Odak. </li><li> Kullanımı # 5 Dumont forseps (bu iyi dominant el kullanılarak yapılır) tek elle bir tek kadın almak. Bu kanatlar, bacaklar, karın ya da geçiş toraks tarafından kadın almak için genellikle kolay değildir. De dolu medyada kadın Batmak. Gerektiği gibi mikroskop odağı ayarlayın. </li><li> Dominant olmayan elde tutulan forseps ikinci bir çifti kullanarak, karın ön ucundaki kadın kapmakarka uç dominant elin (Şekil 2A) doğru konumlandırılmış böylece. Medyada batık sinek tutmak için emin olun. </li><li> Dominant elin ile, 2. en arka pigmente segmentte manikür kapmak ve uzak karın (Şekil 2B-C) geri kalanından rip forseps kullanabilir. </li><li> Yumurtalıklar (Şekil 2D-E) ortaya kadar dominant el forseps kullanarak, yavaşça karın ön ucunu sıkın. Gerekirse, iki yumurtalık arasında forseps yerleştirin ve karkas çekip çıkarın. </li><li> Taze medya (Şekil 2F) ile yeni bir kuyuya yumurtalıklar taşımak veya bir Kimwipe&#39;dan veya kağıt havlu karkas kaldırın. Bu köklerinin in vitro gelişimi için izole edilmektedir bu özellikle önemlidir. </li><li> Yumurtalıkların 3-5 çiftleri izole edilmiştir kadar tekrarlayın. NOT: Her over ~ 16 ovarioles veya sırayla olgunlaşan folikül zincirlerinden oluşur. Her ovariolekas kılıf içinde bulunur. </li><li> Pin vises ve onlarla verilen iğneler kullanarak, yavaşça ovarioles (Şekil 2G) arasındaki iğneler çalıştırarak yumurtalık ayrı çekin. Bu bazen de bireysel folikülleri yayınlayacak. </li><li> Bireysel ovarioles ve folikül gelişiminin kolayca ayırt morfolojik aşamaları artık görünür (Şekil 2G, ayrı alay yumurtalık) olmalıdır. Şekiller 1 ve farklı aşamalarında ayırt etmek için kullanılabilir morfolojik farklılıklar için 2H bakınız. Bozulmamış ovarioles içinde ve hala bir kas kılıf içinde bulunan folikül ayırmak için, hemen ilgi folikül aşağıdaki önceki folikül anterior ve folikül posterior ovariole genelinde kesmek için bir iğne kullanın. Bu kas kılıfı kıracak ve uzak ilgi folikül artık zarar vermeden uzak komşu köklerinin kesilebilir. </li&gt; <li> Tek tek aşamalar ayrılır gibi, taze ortam ile yeni bir oyuğuna, bir cam pipet ile, ilgi konusu köklerinin hareket eder. In vitro gelişimi için köklerinin izole edilmesi, bu özellikle önemlidir. NOT: Bu iyi boyunca ilgi foliküllerini dağıtarak hava kabarcıklarını engellemek için ortamı girmeden önce pipet ampul sıkmak için önemlidir. Folikül cam pipet yapışmasını ise ek olarak, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez BSA çözeltisi pipetle ve kesme ortamı ile durulanarak% 3 sığır serum albümin (BSA) ile kaplanmış olabilir. </li><li> Yeterli folikül izole edildikten sonra, daha sonraki deneyler devam edin. </li></ol> S10B Foliküllerinden 3. In vitro Geliştirme <ol><li> IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak S10B köklerinin izole. Folikülleri hızla uzak enkaz taşınmış olduğundan emin olun. Bu foliküllerin olgunlaşmaya devam edeceği gibi, bu impo olduğuS10Bs 30-60 dakika boyunca toplanmış ve daha sonra tercih edilen olgunlaştırma ortamına yerleştirilir ki rtant. NOT: S10B S10A folikülleri IVEM kültür ortamında olgun olmayacak gibi dikkatli, (1B karşılaştırıldığında Şekil 1C) S10A köklerinin ayırt edilmesi gerekir. S10A ve S10B köklerinin her ikisinde de, uzunluğunun yarısı hemşire hücrelerden oluşan ve diğer yarısı, oosit, ancak S10B içinde folikül uzunluğu S14 köklerinin eşittir. </li><li> Bir cam pipet kullanılarak, bir 24-yuvalı doku kültür plakasının bir kuyuya ~ 30 S10B folikül hareket eder. NOT: aktarılıyor köklerinin tüm S10B ve S11 için olgunlaştığını değil doğrulamak için emin olun. </li><li> Yani IVEM medya artı farmakolojik reaktifler, kuyu başına olgunlaşma medya 1 ul hazırlayın. </li><li> Çekti cam pipet * kullanarak, mümkün olduğunca kuyuda (adım 3.2) kadar medyayı çıkartın ve hızlı bir şekilde seçim olgunlaşma medya ekleyebilirsiniz. NOT: Bu çekti cam pip kullanmak esastırsahnelenen folikül olarak ette kolayca Pipetman cam pipetler veya pipet uçları ile ya kadar alınabilir. * Çekti pipetler yapmak için: 1) cam yumuşamaya başlar sadece kadar bir Bunsen brülör alev uzun, cam pipetler ince kısmını ısıtmak; 2) hemen alevin dışında pipet taşımak ve içine pipet çekmek için yatay olarak çekin daha ince bir tüp; 3) ince bir nokta oluşturmak için bölünürler. DİKKAT: cam parçaları kapalı uçabilirsiniz gibi göz koruması kullanın. </li><li> Deneme gerektirir tekrarlayın gibi birçok kuyu için 3,1-3,4 adımları. </li><li> Folikül&gt; 10 saat boyunca geliştirmek ve diseksiyon kapsamında gelişimsel ilerlemesini puan verin. NOT: Deneyler genellikle köklerinin geliştirmek için yeterli zaman tanımak için ertesi gün puanlanır. S10B ~ 5 saat olan, S11 ~ 30 dk, S12 ~ 2 saat ve S13 biraz daha uzun sürer, oda sıcaklığında 25 ° C 1 ve geliştirme, süresi ~ 1 hr. S10B köklerinin için tarif edilene benzer deneyler olabilir,S11-S13 folikül kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li></ol> 4. Canlı Görüntüleme Sahne izolasyonu <ol><li> Çabucak enkaz folikülleri hareketli, IVEM medyada aşama izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak seçim floresan işaretleyici ifade geç evre foliküllerini (S10B-14) izole. </li><li> Yeni medya içine ilgi folikülleri taşıyın ve daha sonra bir lamel alt Petri plaka cam pipetle aktarın. Bu lamel alt bölgede kabarcıklar ama üzerinden dökülmemesi kalmaması medya eklemek için özen gösterin. </li><li> Daha uzun bir zaman atlamalı filmler için, bu Petri plakanın iç kenarı, su ile nemlendirilmiş bir rulo Kimwipe ekleyerek Petri plakası içinde nem sağlamak için bazen gereklidir. Üst kapağı yerleştirin. </li><li> Ters bir mikroskop görüntüsü. Ayrıntılı çözünürlüklü konfokal mikroskopi gerektirir. Bu görüntüleme, aydınlatma gücü, ve görüntüleme uzunluğu frekansını dengelemek için gerekli olduğunu, bu bağımsız olarak her l için çalıştım gerekecektirabeling aracı ve gelişim süreci. </li></ol> 5. Preparasyon mRNA izolasyonu için Aşama <ol><li> Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole. </li><li> Bir cam pipet kullanılarak, ortam ile yeni bir kuyu içine ilgilenilen tek tek aşamaları hareket, bir kerede bir çok aşamaları toplamak mümkündür. </li><li> 1 saat altında toplama saatleri tutun. 1.5 ml mikrofüj tüplerine, bir cam pipet ile, folikül hareket ettirin. </li><li> Köklerinin her pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca tüp spin. Çekti cam pipet (adım 3.4) kullanılarak dikkatlice tüm medya çıkarın. NOT: Bir tam boy mıkro kullanıyorsanız, düşük hızda köklerinin aşağı doğru döndürün. </li><li> TRIZOL 100 ul ekleyin ve bir plastik tokmak kullanılarak ~ 20 saniye boyunca elle eziyet. Mikrosantrifuj&#39;de tam hızda aşağı Spin ve herhangi topaklandı d rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp Trizol hareketebris. -80 ° C&#39;de saklayın </li><li> Follikül yeterli deney için elde edilinceye kadar tekrarlayın 5,1-5,5 adımları. Rutin, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 ve S14 ~ 100 köklerinin RNA ~ 10 mikrogram verim. </li><li> Buz örnekleri çözülme. Bir mikrofuj tüpüne uygun olarak, örnek birleştirmek ve 800 ul kadar Trizol ses getirmek. Üretici tarafından yönlendirildiği gibi RNA izolasyonu ile devam edin. ÖNEMLİ: RNazsız DNase ile izole RNA tedavisi DNase&#39;ının unutmayın. </li></ol> 6. Western Blot için Sahne izolasyonu <ol><li> 100 ° C bir ısıtma bloğu ısıtın </li><li> Grace ya IVEM medya ile ya aşamalı izolasyon protokolü (adım 2) kullanılarak bireysel sahne köklerinin izole. NOT: Bu ampirik her özel protein gözlemlemek için gerekli olan nasıl belirli bir aşama folikül birçok belirlemek gereklidir. Derece olarak ifade edilen proteinleri de 1-3 S10B foliküllerinin / batı lekelerinin güçlü bir sinyal görmek için yeterlidir. Bununla birlikte, bunu yapmak için önemli olan birtemsili bir örnek, birden çok kadın folikülleri alıyor. Bu nedenle, belirli bir aşamasında 15-20 köklerinin genellikle toplanır. </li><li> Bir 1.5 ml mikrofüj tüpe bir cam pipet kullanarak, folikül hareket ettirin. (Adım 5.4) köklerinin pelet için bir mini-mikrosantrifüjde kısaca Spin. Dikkatle (adım 3.4) çekti cam pipet kullanarak ortamların tümünü çıkarın ve 1x PBS 50 ul ve 2x Laemmli tampon 50 ul ekleyin. </li><li> Plastik bir havan tokmağı ile 20 sn ~ için elle eziyet. NOT: Plastik havan yıkanarak batı örnekleri öğütme ve onları otoklav için tekrar edilebilir. </li><li> Isıtma bloğu içinde 10 dakika için örnekleri kaynatın. </li><li> Mikrosantrifuj&#39;de 15 saniye boyunca tam hızda buz ve spin kısaca Chill. Hemen -20 ° C &#39;de, bir SDS-PAGE jeli üzerine ya da mağaza yük ya NOT: örnekleri kaydedilirse, jel üzerine yüklemeden önce örnekleri reboil unutmayın. </li><li> , Standart protokolleri takiben western blot analizi yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping.">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li><li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transit:+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber.">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li><li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggs+over+easy:+cell+death+in+the+Drosophila+ovary.">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li><li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+shell+game:+patterning+genes+and+morphological+change.">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li><li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+II.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li><li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pxt:+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation.">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling.">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flytrap,+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Drosophila folikül morfolojik ve moleküler analizlerin her ikisi için de idealdir, hücre tipleri çok az sayıda oluşmaktadır. Üstelik, yumurtalık yapısına, ortak bir kesme alanı ve en az eğitim ile folikül gelişiminin belirli aşamalarında çok sayıda elde etmek nispeten kolaydır. Her aşamada bir kısa zamansal pencereyi temsil gibi, sahne izolasyon bu evrede meydana gelişim süreçlerine önemli moleküler anlayışlar sağlayabilir. Örneğin, S10B, S12, S14 ve 18 sırasında me...

Her bir Drosophila yumurtalık 16 ovarioles, ya da sıralı olarak olgunlaşma yumurta odalar veya folikül zincirlerinin ~ oluşmaktadır. Her folikül tek oosit, 15 germ hattı türetilmiş hemşire veya destek hücreleri ve folikül hücreleri (Şekil 1A) olarak adlandırılan ~ 650 somatik hücrelerden oluşmuştur. Drosophila oogenez 1 geliştirme 14 morfolojik olarak tanımlanmış aşamaları ayrılmıştır. Folikül gelişiminin her aşaması nispeten kolay sahne özgü folikül önemli sayıda izole etmek için yapım, bir tek sinek içinde birçok kez görülmektedir. Oogenezisin (10B-14 Aşamaları) orta-geç aşamaları (Şekil 1) evre izolasyonu için özellikle uygundur. Aşama 10B (S10B) olarak, folikül tamamen (yani, uzunluğu, bir evre 14 (S14) folikül eşit olan, Şekil 1 ve Şekil 2H bakınız) uzatılmış ve folikül yarısı uzunluğu hemşire hücrelerden oluşmaktadırdiğer yarısı oosit (Şekil 1C) iken. Bu aşamada hücreler, hemşire kortikal aktin güçlendirilmesi ve aktin ipliklerin 2 paralel demetleri üreten, dramatik aktin yeniden geçer. Aynı zamanda, folikül hücreler popülasyonu, hemşire hücreleri, ve oosit arasında geçiş, merkezcil hücreleri olarak adlandırılan ve folikül hücrelerin iki dorsal grup dorsal uzantıları, embriyo 3 için boru şekilli solunum cihazları meydana göç geçmesi için belirtilen olmak . Hemşire bu embriyojenezinin (Şekil 1D) tamamlamak için gerekli faktörleri ile oosit sağlar hemşire hücre damping denilen bir süreç içinde oosit içine sitoplazmik içeriğini sıkma sonra sözleşme (S11), hücreler. Hemşire Hücreler daha sonra hücre ölümünü (S12-S13) 4 geçmesi ve folikül hücreler, yumurtaların 5 (Şekiller 1 E-G) salgılar ve desen. Böylece, oogenezisin sonu önemli gelişimsel An ile zengind morfogenetik süreçler. İzole orta-geç evre folikül (S10B-S14) ve moleküler analizlere dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, aşamalı foliküllerden mRNA RT-PCR, mikrodizi için izole edilebilir, ya da RNA-seq analiz eder. Bu bir hediye, sadece birkaç hücre tipleri ile, kısa bir gelişimsel pencere içinde gen ifadelerine bakılması ve gen ekspresyon farmakolojik veya genetik ya pertürbasyonlarm nasıl değiştiğini belirlemek için izin verir. Aşama izolasyonu da western blotting ile protein bakmak için kullanılabilir. Bu belirli aşamalarında mutantlann karşı yabani tip protein ekspresyonu seviyesini ölçmek için izin verir, çünkü bu tür bir analiz önemlidir. Bir kullanımı olsa da immünofloresan flüoresans ölçümü nedeniyle piksellerin her algılama 6 lineer aralığında sıkı gereksinimleri daha az sağlam olan, benzer sonuçlar elde etmek için analiz eder. Buna ek olarak, western blot analizi, diğer bilgileri sağlayan bu tür birs protein çevrim sonrası modifiye edilir ya da belirli bir ek yeri izoform eksprese ise. Izole edilmiş hücre altı paya ayırma aşamaları da dahil olmak üzere, daha fazla veya coimmunoprecipitation protein saflaştırma için kullanılabilir. Aşama özgü folikül izolasyonu da in vitro tahliller gelişme 7 ve canlı-8 görüntüleme için kullanılabilir. İzole S10B-S13 folikül (aşağıya bakınız) basit bir kültür ortamı içinde S14 geliştirmek devam edecektir. Bu S10A folikülleri bu yazıda tartışılan kültür koşulları kullanılarak damping hemşire hücre yoluyla ilerleme olmayacağını dikkat etmek önemlidir. Biz okumak-çıkışları 7,9 olarak hemşire damping hücre ve gelişme ile aktin yeniden düzenleyen, hem de farmakolojik ve genetik, prostaglandinlerin rolünü tanımlamak için S10B in vitro geliştirme deneyleri kullandık. Benzer şekilde, daha sonraki gelişim aşamaları, aynı zamanda farmakolojik tedaviler veya genetik erkek etkilerini belirlemek için izole edilebilirBöyle merkezcil hücre göçü, dorsal apendiks göç / oluşumu 10, ve hemşire hücre ölümü gibi belirli süreçlere ipulations. Bu gibi deneyler, dominant etkileşim ekranlar veya tahlilleri yapmak için kullanılabilir, örneğin, PXT veya fascin tek mutasyonlar heterozigozite S10B in vitro gelişimi üzerine bir etkisi varken, çift heterozigot sergi hemşire hücre kusurları ve geliştirme 9&#39;daki bir blok boşaltmaması folikül. S10B-13 kültür geliştirebilir çünkü Ayrıca, bu süre esnasında meydana gelen işlemlerin tüm canlı görüntüleme ile gözlenebilir. Bu tür bir görüntüleme, sadece flüoresan probları ya da canlı görüntüleme boyalarla boyanmış köklerini ifade eden transjenik sinekleri kullanılarak (bir morfoloji toplam değişiklikleri sadece ilgi ise) iletilen ışık kullanılarak veya konfokal mikroskobu ile gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme ölçüde gelişim süreçleri anlayışımızı ilerletmek için kullanılıyor. Nitekim, imagin canlıGeç evre köklerinin g dorsal uzantı göç bilgi, tubulogenesis 10 bir örnek genişletti. Biz damping hemşire hücre sırasında aktin dinamikleri dahil olmak üzere ek geç evre süreçleri, canlı görüntüleme, bu gelişimsel olayların yeni bakış açıları sağlayacak bekliyoruz. Bu S10A ve folikül gelişiminin erken aşamalarında kültüründe S14 haline devam ederken, gelişim bu dönemlerinde meydana gelen olaylar canlı görüntüleme (daha fazla bilgi için Tartışma bakın alternatif kültür koşullarında 11-14 ile mümkün olduğuna dikkat etmek önemlidir bilgisi). İşte biz ya in vitro gelişimi için geç dönem köklerinin izole etmek için ayrıntılı protokoller sağlamak ve canlı görüntüleme, veya moleküler analizleri (mRNA ve protein izolasyonu).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Drosophila oogenez veya folikül gelişimi yaygın olarak karmaşık bir gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerin anlayışı ilerletmek için kullanılır olmuştur. Bu yöntemler kağıt orta-geç evre foliküllerini (Sahne 10B-14) izole ve gelişimsel zaman sıkı pencere sırasında meydana gelen moleküler ve morfolojik olaylara yeni bakış açıları sağlamak için bunları kullanmak için nasıl açıklar. İzole folikül gelişimi in vitro tahlilleri, canlı görüntüleme, mRNA ifade analizi ve proteinlerin western blot analizi de dahil olmak üzere deneysel teknikler, çeşitli için kullanılabilir. Sahne 10B (S10B) ya da daha sonra folikülleri kültür gelişimini tamamlayacak, bu bir gelişme belirli dönemlerinde ortaya çıkan süreçler üzerinde bu tür manipülasyonlar etkilerini tanımlamak için in vitro gelişimi ile genetik veya farmakolojik tedirginlikler birleştirmek sağlar. Bu folikülleri kültür gelişir çünkü Ayrıca, onlar ideal canlı görüntüleme çalışmaları için uygundur, Genellikle morfolojik olaylara aracılık yeni mekanizmalar ortaya hangi. İzole köklerinin aynı zamanda moleküler analiz için kullanılabilir. Örneğin, genetik düzensizliklerin neden gen ekspresyonunda değişiklikler belirli bir gelişimsel pencereler için tanımlanabilir. Ayrıca, folikül gelişiminin belirli bir aşamasında protein düzeyi, kararlılık, ve / veya sonrası tadilat devlet western blot ile analiz incelenebilir. Böylece, Drosophila köklerinin sahne özel izolasyon gelişimi ve morfojenezinin yaygın korunmuş süreçlerine zengin bir bilgi kaynağı sağlar.

Drosophila folikül gelişiminin belirli aşamaları izole zaman doğru bir şekilde farklı morfolojik aşamaları ayırt edebilmek için gereklidir. Hemşire hücreleri ve oosit her (Şekil 1B 1C karşılaştırıldığında) bu aşamada folikül yarısı uzunluğunu almak gibi bu, S10A ve S10B için biraz zordur. S10B köklerinin tam olarak uzatılmış ve bir S14 folikül (1 g ile karşılaştırıldığında Şekil 1C) uzunluğunda ve böylece eşit gibi A...

Watch this Scientific Journal Video about The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation at JoVE.com

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir.

Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em&gt; Drosophila</em&gt; Folikül İzolasyon

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Görüntüleme.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Orta-geç Drosophila köklerinin Aşama özgü izolasyon çeşitli amaçlar için yararlıdır. Bu tür foliküllerin gelişmesi in vitro tahliller ve canlı görüntüleme ile bağlanmak üzere genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlara olanak sağlar kültür gelişir. Buna ek olarak, bu tür folikül mRNA ve protein izole gibi moleküler genetik araştırmaları için kullanılabilir. 

Video: The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Ex Vivo Viral İletimi Saç Folikül GFP Hedeflenen İfade

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biyoloji

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...