iş GO-Bio Hibe No. 0315569, Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir.

NOT: İnsan çocuk sünnet rutin sünnet sonrası bir çocuk cerrahiden, ilgili yasalara uygun olarak, aydınlatılmış onam ve etik onayı (Etik Komitesi Charite Üniversitesi Tıp Berlin, Almanya) ile elde edilmiştir. MOC içinde Yetiştirme Doku Benzerleri 1. Üretim <ol><li> Karaciğer sferoidler oluşturmak için açılan plakaları asılı HepaRG ve HHSteC agrega. <ol><li> , Birleşmiş ortamın farklılaşmış tek tabaka kültürleri çıkarın (2 75 cm) hücre kültürü şişelerinde büyütülmüştür HepaRG hücrelerinin tripsinizasyon elde etmek için, iki kez PBS ile yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 3 ila 5 dakika boyunca inkübe ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücre sayımı Santrifüj HepaRG hücreleri. Hücre canlılığı&gt;% 90 olmalıdır. </li><li> Içinde, HHSteC hücrelerinin trypsinization elde tek tabakalı kültürlerden gelen orta kaldırmak, PBS ile iki kez yıkayın ve% 0.05 tripsin / EDTA 3 ml eklemek için sipariş. 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücrelerin sayısı en HHSteC hücreleri. </li><li> 24 bir oranda HepaRG ve HHSteC Birleştir: 1 HepaRG hücre kültür ortamı içinde. Bunu yapmak için, HepaRG hücre kültür ortamı içinde hücre süspansiyonları seyreltilmesiyle hücre sayıları ayarlayın ve 4.8 x 10 6 hücre / mL HepaRG hücreleri 1 x 10 5 hücre / mi HHSteC ekleyin. Dikkatle karıştırın. </li><li> Asılı damla ve alıcı plaka PBS 2 ml ilave etmek suretiyle, bir asılı bırakma plakası hazırlayın. </li><li> Pipet Asılı damla plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 20 ul. Her zaman yaklaşık% 10 daha fazla asılı bazı büyüklükler Duri kaybolur gibi, agrega almak için ihtiyacınız olandan damla hazırlamakprosedür ng. Dikkatlice 37 ° C inkübatör plaka koyun. Küresel şekiller oluşturmak için 48 saat bekleyin. </li><li> Sferoidler almak için, geniş uç sonları ile pipet uçları kullanın veya yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril bir bıçakla 1 ml pipet ipuçları ipuçları kesmek için emin olun. Onları aksatmadan sferoidler işlemek için bu pipet ipuçlarını kullanın. </li><li> Arka arkaya, bir pipet kullanılarak Asılı damla plakasının deliklerinin üstüne ortam 1 ml ilave etmek suretiyle asılı bırakma plakası dikkatle sferoidler yıkayın. Tüm sferoidler düşmüş kadar plaka yıkayın. Küresel şekiller hafif disk şeklinde 300 um ila 400 orta çap ve bu noktada 200 ila 300 arasında bir yüksekliğe sahip bulunmaktadır. </li><li> Alıcı plakasındaki sferoitleri toplayın ve iyi hazırlanmış pipet ipuçlarını kullanarak başına 20 sferoitlerin maksimum 24-kuyu, ultra-düşük bağlanma plakaları aktarabilirsiniz. 0.5 ml her bir ortam hacimleri ayarlayın. Ino 20 agrega kullanarakin vivo hücre sayıları ile ilgili olarak 1 / 100.000 minyatür oranını elde etmek için bir MOK devre hesaplanmalıdır. </li><li> MOC de kullanılana kadar CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin sferoidler ve% 5. Karşılaştırılabilirliği sağlamak için kullanmadan önce sferoitlerin daha uzun üç gün saklamayın. Homojen sferoidler almak için ultra-düşük bağlanma plakalar, en az bir gün için agrega geliştirin. </li></ol></li><li> Cilt dokusu eşdeğerleri oluşturmak için iki yaklaşımdan birini takip: punch biyopsi (1.2.1) veya hazır in vitro doku modelleri (1.3.1) &#39;de kullanılması kullanımı. <ol><li> Bir sonraki kullanıma kadar steril koşullar altında, 96-gözlü hücre kültür uçlar ve deposu hazırlamak için dirsek altında bir akkor bıçakla transwells kesin. </li><li> 30 saniye için% 80 etanol içinde sünnet örnekleri sterilize ve açık halka kesti. Numuneler 2 mm arasında bir ortalama bir yüksekliğe sahip olmalıdır. </li><li> Eşit miniaturiza elde etmek için 4.5 mm çapında biyopsi kesmek için bir biyopsi yumruk kullanınkaraciğer ve cilt hem de siyon oranı. Forseps ile ekler Transwell hazırlanan 96-kuyuya biyopsi yükleyin. Epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde biyopsi konumuna dikkat edin. </li><li> Talep hücre kültürü MOC de kullanılana kadar HepaRG hücre kültür ortamı ve mağaza 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 içeren bir alıcı plaka biyopsileri olan ekler. 3 saat kadar 2&#39;den değil mağaza örnekleri daha uzun yapın. </li></ol></li><li> MOK&#39;ye içine, çeşitli tedarikçilerden satın onlar 96-de Transwell formatta olduğundan emin yapma, hazır vitro deri modellerinde entegre. Satıcı tarafından veya başka bir dokuya sahip bir kokültürünün bir sonraki adımda öngörülür ise, her iki destek dokular en az bir orta kullanmak verilen hücre kültürü ortamı kullanın. Dokuları desteklemek kapasitesi için önce statik deneylerde ilgili asgari orta sınayın. <ol><li> Tutucu plaka cilt modellerini almak ve bir akkor bıçakla dirsek altında 96-kuyu ekler kesti. </li&gt; <li> MOC de kullanılana kadar CO2 37 ° C&#39;de geri alıcı plaka ve deposuna ekler yerleştirin ve% 5. Bir gün daha uzun değil mağaza örnekleri yapın. </li></ol></li></ol> 2. MOC Fabrikasyon <ol><li> 10 bir oranda PDMS ve sertleştirme maddesi karıştırma: 1 (h / h) ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında karışımı yerleştirin. </li><li> Bununla birlikte, 20 dakika süre ile 80 ° C&#39;de silikon kauçuk katkı maddesi ile bir polikarbonat kapak plakasını tedavi. </li><li> Micropump olan, 500 mikron kalınlığında dört PDMS serbest hücre kültürü bölmeleri ve altı PDMS membranlar, oluşturmak için kapak plakası ilgili deliklere teflon Vidaları yerleştirin. </li><li> İki mikrovasküler devrelerin ana kalıp hazırlanan kapak plakasını takın ve gazı alınmış PDMS enjekte. Sisteme hava kabarcıkları entegre dikkat edin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, cihazı eğerek bunları kaldırmak için çalışın. </li><li> PDMS tabakasını sertleştirmek için 60 dakika boyunca 80 ° C&#39;de inkübe edin sistemi. </li><li> Master kalıp ve cihazdan teflon vidaları çıkarın ve düşük basınçlı plazma oksidasyonu kullanarak 75 x 25 mm 2 kaplayan bir cam slayt PDMS katmanı bağlamak. </li><li> Kapak plaka dört hücre kültürü bölmelerine özel iplik MOC adaptörleri Vida. </li><li> Kadın Luer x ¼-28 erkek adaptörleri kültür ortamı içeren şırınga bağlayın ve onlara kapak plaka MOK adaptörleri vida. </li><li> Tekrar tekrar aşağı iterek ve şırıngalar pistonları yukarı çekerek mikroakışkan devreye orta enjekte edilir. </li><li> Mikroskop altında orta kanallarda doğru doldurulmasını kontrol edin. </li></ol> MOC 3. endotelizasyon <ol><li> Endotelial hücre büyüme ortamı ile MOC, gömme her MOC devre endothelializing ve CO2 37 ° C&#39;de üç gün boyunca statik inkübe ve% 5 önce. <ol><li> Bir etanol kullanılarak MOKSL silme sterilize bir laminer akış tezgah altına yerleştirin. Benn Ayrıca, forseps iki çift ve bir sonraki kullanım için iki altıgen tuşları sterilize. </li><li> Altıgen tuşlarını kullanarak MOC doku kültürü bölmesinin kapaklarını gevşetin ve forseps kullanarak kapaklarını çıkarın. Orta yerleştirdikten sonra, aynı şekilde Kendi yaptığım şeyler için geri vidalı kapakları. </li></ol></li><li> Insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) olarak tripsinizasyon elde etmek için, tek tabakalı kültürleri orta kaldırmak PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> Santrifüj HDMEC 5 dakika boyunca 220 x g, kaldırma süpernatan, endotel hücre büyüme ortamı, 1 ml hücre topağı tekrar süspansiyon ve hücreleri sayın. Hücre canlılığı&gt;% 90 olmalıdır. </li><li> Endotelial hücre büyüme ortamı ile seyreltilmesi, 2 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu içinde hücre sayısını ayarlama ve bunun 250 ul transfer1 ml şırınga. Bütün organları için 1 / 100.000 minyatür oranını korumak için MOC hücrelerin bu konsantrasyon uygulayın. </li><li> Bir kadın Luer x ¼-28 erkek adaptör şırınga bağlayın, bu uydurma dışında havayı dışarı atmak, ve özel bir iplik MOC adaptörü vida. Her MOK devrenin iki bölmeden birine adaptörünü bağlayın. </li><li> MOC devresinin ikinci bölmeye aynı şekilde boş bir enjektörü. </li><li> Ardışık şekilde birkaç kez aşağı iterek ve iki şırınga pistonunu yukarı çekerek eşit hücreleri enjekte edilir. Mikroskop altında hücre infüzyonu kontrol edin. </li><li> Hücreler kanal duvarlarına yapışmasının sağlanması için 3 saat boyunca statik koşullar altında CO2, 37 ° C&#39;de inkübe edin MOC ve% 5. </li><li> , Inkübatör çipi çıkartın bir laminer akış tezgah altına yerleştirin ve özel iplik MOC hücre kültürü odaları ile şırınga ve MOK adaptörleri değiştirin. </li><li> Bir com taze orta 400 ul ekleyinHer MOK devre bölmesindeki ve hidrostatik basınç kanallardan yıkayın edelim. Daha sonra, taze ortam 300 ul, her iki bölme içinde orta yerine. </li><li> 3.1.2 tarif edildiği gibi, kapaklar kullanılarak bölmeleri kapatın. </li><li> Pompa kontrol ünitesine çip takın. 0.475 Hz frekansında pompalama hızını ayarlamak ve CO2 37 ° C&#39;de çip yetiştirmek ve% 5. </li><li> Her MOK bölmenin orta iki gün her biri değiştirin ve ışık mikroskobu ile hücre morfolojisi izlemek. </li></ol> Chip 4. Yükleme <ol><li> Laminer akış tezgah altında MOC yerleştirin ve adım 3.1.2 açıklandığı gibi, açın. </li><li> Doku kültürü bölmelerden Ortamı çıkarın ve taze HepaRG hücre kültür ortamının 300 ul ile değiştirin. </li><li> Geniş açılması ile pipet uçları kullanarak her MOK devrenin bir doku kültürü bölmesine 20 önceden sferoitleri aktarın (bkz adımları 1.1.8 / 9). C kapatınap forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak. </li><li> Forseps kullanarak her MOK devrenin kalan doku kültürü bölmesine cilt eşdeğer içeren transfer 96-kuyu hücre kültürü ekler. Cilt eşdeğer zarın altındaki kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bunu yapmak için, bir hafif eğik açıyla transwells eklemek ve yavaşça aşağı doğru itin. Transwell çevresinde aşırı orta çıkarın bir pipet ile aşağıdan yukarıya itilir. </li><li> Forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak kapağını kapatın. </li></ol> 5. Pompa Kontrol Birimine Chip Bağlama <ol><li> Değerlere kontrol ünitelerinde Set operasyonel parametreler istenen. 0&#39;dan 8.000 mbar, 0&#39;dan -800 mbar vakum ve 0.24 2.4 Hz frekans pompalama hava basıncını değiştirin. Saat yönünde ya da saat yönünün tersine pompalama yönünü ayarlayın. </li><li> Laminer akış tezgah altından MOK içeren doku benzerleri çıkarın ve pompa kontrol birimlerine bağlayın. </li><li> Numerat ardındantüpler iyon MOK&#39;ye üzerindeki ilgili bağlantı parçaları hava basıncı tüpünü yerleştirin. </li><li> 37 ° C ısı ve çip enkübatör dışında çip yetiştirmek için MOC destek kullanarak canlı doku görüntüleme durumunda, 37 ° C&#39;de MOC yetiştirmek ve% 5 CO2, bir kuluçka makinesi içinde ya da. Standart mikroskop altında MOC hücreleri yetiştirmek için ısıtılmış destek kullanın. </li></ol> 6. Maddeler Medya Değişimleri, Örnekleme Medya ve Pozlama Sahne <ol><li> Dokusunda kültür ve hücrelerin metabolik aktivitesinin türü dikkate alınarak, her gün veya her gün rutin medya değişimi gerçekleştirin. <ol><li> Inkübatör Gider Al ve medya akış oranlarını kontrol ve kirlenme kontrol etmek için mikroskop altında gözlemlemek. </li><li> Hava basıncı hortumu çıkararak pompa kontrol ünitesinden MOC ayırın. Etanol mendil kullanarak MOC sterilize ve laminer akış tezgah altına koymak. </li><li> Doku kültürü comp açmaAşama 3.1.2 tarif edildiği gibi, karaciğer kürecikler içeren artment. </li><li> Küremsilerin bozmadan, bir pipet kullanılarak bölmesinden 200 ul kadar çıkarın ve derin-yuvalı plakanın bir boş kuyudaki ortam saklayın. Doğrudan ortam numunesi analiz veya derin oyuklu plaka kapatmak ve daha fazla analiz için -80 ° C&#39;de ortam numuneleri muhafaza. </li><li> 250 ul taze bir hücre kültürü ortamı ile MOC ortamını yerine yerleştirin ve kapağı kapatın. nedeniyle sistemin kapatırken çipin üzerinden sızıntı az miktarda ortam çıkarıldı ve kaybının yerini tutmaktadır ikame miktarındaki farklılık. </li><li> Doku devamlılığı için denetlemek için bu noktada deri eşdeğerleri tutan doku kültürü bölmesinin kapağını açın. Sisteme giren hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Kapağı kapatın. </li><li> 5.3 adım ve bir kuluçka makinesi içinde MOC yerleştirmek için uygun MOC pompa kontrol ünitesinin boru bağlayın. </li></ol></li></ol> 7. Günlük Medya Örnekleri analiz ve gerçekleştirin On-line Analizi <ol><li> On-line canlı hücre görüntüleme veya çevrimdışı kullanarak, günlük medya örnekleri analiz edilerek doku kültürü performansını analiz. Standart rutin enzimatik tahliller (örn laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesi) veya ELISA (örn albümin konsantrasyonu) tarafından ikincisi gerçekleştirin. Bir online analiz aşağıda açıklanmıştır. </li><li> (Içerisinde seyreltilmiş 6.1.1 6.1.4 adımları tarif edildiği gibi, endotelize MOC ortamını çıkarın ve 10 ug 200 ul her iki doku kültürü bölümlerinde / ml fluorofor asetile konjuge düşük-yoğunluklu lipoprotein (LDL) çözeltisi yerine Hücre kültür ortamı). </li><li> Kapaklar kapatın. 5.3 aşamasına göre, pompa kontrol birimine MOC bağlayın ve mikroakışkan devre içerisinde eşit bir şekilde, solüsyonun dağıtımı için 0.475 Hz 30 dakika için pompa. </li><li> Pompalama durdurun ve 37 ° C&#39;de 3.5 saat ve% 5 CO 2 için statik MOC kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Benzer tO, 7.2 adım, her iki bölme ile ilgili asetillenmiş LDL çözeltisi kaldırmak ve iki bölmesinden biri içinde taze ortam 400 ul ile değiştirin. </li><li> 3 ila 5 dk hidrostatik basınç mikroakışkan kanal devresi aracılığıyla orta sürücü izin için bekleyin. </li><li> Taze ortam 300 ul akması ve aynı zamanda taze ortam 300 ul ikinci doku kültürü bölmesini doldurmak olan orta değiştirin. </li><li> Adım 3.1.2 göre, MOC kapatın. Flöresanlı bir mikroskop altında koyun ve hücre büyümesini ve canlılığını izleyin. </li><li> Ekimi devam etmek için geri inkübatör lekeli MOC yerleştirin. Her aşağıdaki ortam değiştirme ile hücrelerin dışarı sızdıran leke çıkarın. </li></ol> 8. MOC gelen doku Eşdeğer almak ve Bitiş noktası Analizleri gerçekleştirin <ol><li> Son nokta analizleri için deney sonunda MOC doku eşdeğerleri alın. <ol><li> Karaciğer ve cilt e almak içinadımlar 6.1.4 için 6.1.1 de açıklandığı gibi MOC gelen quivalents, her doku kültürü bölmesindeki ortamı çıkarın. </li><li> Forseps kullanılarak MOC cildi içeren 96 gözlü hücre kültür ekleri çıkarın. Forseps ile bir tarafta o sürükleyici ve aşağı doğru çekerek ekleme dikkatle zarı soyulabilir. Bu noktada cilt eşdeğer kaybetmek değil dikkat edin. </li><li> Cryo-gömme bileşik cilt eşdeğer tutan membran Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Kesim pipet uçları kullanarak onları pipetleme doku kültürü bölmesinden benzer karaciğer eşdeğerleri çıkarın (adım 1.1.8 / 9). <ol><li> Cryo-gömme bileşik karaciğer sferoidlerinden gömün. Çok fazla sıvı aktarmak ve bir pipet ile herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için dikkat edin. Gömme bileşik üzerine sferoitleri yerleştirerek ve orta çıkardıktan sonra, bunları tam olarak çevrelemek için sferoitlerin üst üzerine daha cryo bileşik ekleyin. </li><li> Karaciğer benzerleri Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Daha önceki protokollarda 10&#39;da tarif edildiği gibi, doku-spesifik belirteçler 8 um bölüm ve boyama için kriyo-mikrotom doku benzeri kesilerek nokta analiz. </li></ol>

<ol><li>Kelm, J. M., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+tissue+engineering+using+gravity-enforced+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly.</a> Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).</li>
<li>Marx, U., Walles, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip+Developments%3A+A+Translational+Cutting-edge+Alternative+to+Systemic+Safety+Assessment+and+Efficiency+Evaluation+of+Substances+in+Laboratory+Animals+and+Man%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+HepG2%2FC3A+cell+cultures+in+a+microfluidic+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).</li>
<li>Dash, A., Inman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+in+the+evaluation+of+drug+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+metabolism+%26+toxicology%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety.</a> Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).</li>
<li>Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing--organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).</li>
<li>Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+fabrication+of+three-chamber+microscale+cell+culture+analog+devices+with+integrated+dissolved+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors.</a> Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).</li>
<li>Tatosian, D. a, Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+evaluation+of+drug+mixtures+for+potential+efficacy+in+treating+multidrug+resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).</li>
<li>Schimek, K., Busek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).</li>
<li>Wagner, I., Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+multi-organ-chip+for+long-term+cultivation+and+substance+testing+proven+by+3D+human+liver+and+skin+tissue+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).</li>
<li>Vieira, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaRG+human+hepatic+cell+line+utility+as+a+surrogate+for+primary+human+hepatocytes+in+drug+metabolism+assessment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmacological+and+toxicological+methods%22%5BJournal%5D)">HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro.</a> Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).</li>
<li>Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+of+hepatocytes+and+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells.</a> Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).</li>
<li>Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+HepaRG+model+as+an+attractive+tool+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing.</a> Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).</li>
<li>Chiquet-Ehrismann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascins%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tenascins.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).</li>
<li>Sidgwick, G. P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+molecules+implicated+in+hypertrophic+and+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+European+Academy+of+Dermatology+and+Venereology+JEADV%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).</li>
<li>Ataç, B., Wagner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li>
<li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularised+human+tissue+models+A+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li>
<li>Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2012).</li>
<li>Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+function+and+extracellular+matrix+geometry%3A+long-term+culture+in+a+sandwich+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration.</a> FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).</li>
<li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+PDMS+%28polydimethylsiloxane%29+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li>
<li>Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+3-dimensional+cell+culture+and+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+microdevices%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays.</a> Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).</li>
<li>Prot, J. -M., Aninat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+HepG2%2FC3A+Cell+Functions+in+a+Microfluidic+Biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).</li>
<li>Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+functional+liver+tissue%3A+three-dimensional+coculture+of+primary+hepatocytes+and+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells.</a> Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).</li>
<li>Powers, M. J., Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfabricated+Array+Bioreactor+for+Perfused+3D+Liver+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).</li>
</ol>

Uwe Marx makalede kullanılan Çoklu Organ Chip platformu üreten ve pazarlayan dokusu üzerinde GmbH şirketinin CEO&#39;su. Bu yayın Corning Inc. tarafından verilen bir ödül tarafından finanse edildi

Burada anlatılan MOK platformu uzun kültür dönemleri 10,16 üzerinde dinamik orta akış koşullarında çeşitli kökenlerden dokuları yetiştirilmesi için istikrarlı ve güçlü bir araç temsil eder. Bu örnekte, bir platform birincil hücreler (HDMEC), bir hücre hattından elde edilen doku eşlenik (karaciğer agregalar), bir doku biyopsisi ile daha önce zikredilen bir birlikte-kültür yetiştirmek için kullanıldı. MOK kombine orta devredeki kadar 28 gün süreyle üç-doku kokültürü sürdürmek başardı. Yazarların bilgimize göre, bu biyopsiler, primer hücreler ve hücre çizgileri dahil olmak üzere bir çok doku kokültürünün dört hafta boyunca gerçekleştirilmiştir ilk kez. Mikroakışkan sistemlerinin başlıca sakıncalarından biri, akışkan devresinin yüzey malzemesine yapışma küçük moleküllerin eğilimidir. Hacim oranında yüzey mikroakışkan sistemlerinde, özellikle de yüksek olduğu için, bu etki daha da belirgin hale gelir 17 </s&gt; kadar. Burada tanıtılan kanal sabit HDMEC kapsamı, MOK&#39;ye moleküllerin yapışmasını önleyen, biyolojik bir bariyer olarak hareket edebilir. Bundan başka, kan pıhtılaşmasının önlenmesi, tam kan dolaşımı için bir hemocompatible kabı olarak hizmet edebilir. Organ eşdeğer tam bir vaskülarizasyon henüz elde edilmemiştir Ancak, orta ikamesi olarak tam kan kullanımı mümkün değildir. In vitro -generated dokuların damarlanmaya çalışmalarını Mevcut umut verici ve ileri çalışmalar 18,19 yolunu yönlendirir. Bu hepatositler in vitro statik iki-boyutlu kültür koşulları altında 20 zamanla karaciğer-özel işlevlerini kaybetme eğilimindedir ki iyi bilinmektedir. Belirli bir ilacın metabolizması üzerinde çalışılacak olan bu tür sitokrom P450 aile olarak metabolize edici enzimlerin, özel bir önem taşımaktadır. Sitokrom P450 3A4, birçok ksenobiyotiklerin biyotransformasyon ile ilişkili bir enzim, ve sitokrom P450 7A warada tutarak 14 gün boyunca karaciğerde eksprese edildiği zaman, içinde safra asidi sentezinde MOC kültürlenmiş agrega yer almaktadır. Bu ilaç metabolizma çalışmaları sağlayan, metabolik açıdan aktif bir fenotip koruma gösterir. Statik kültürleri ile karşılaştırıldığında MOC agregaların yüksek albümin üretim oranı yeterli kültür koşulları için ek bir göstergesidir. 23 Bununla birlikte, değerler birincil insan hepatosit kültürlerinde 24 olanlar ulaşamadı - Bu çalışma sırasında gözlenen albümin üretim oranları 21 HepG2 hücreleri de dahil olmak üzere mikroakışkan cips elde daha önce bildirilen değerlerden daha karşılaştırılabilir veya daha yüksek idi. Ayrıca, MOC sistemi, geçici düzeninde, safra ayrı ayrı tutulması için izin vermez. MRP-2 boyama ile gösterildiği gibi toplam polarize ve oluşan safra Kanalikülleri-benzeri yapılarda hücreler. Ancak, bu Kanalikülleri safra toplama bir teknik kanala bağlı değildi. Bu fizyolojik olmayan karışımıKan bölmesi ile safra ing sisteminin gelecekteki yeniden tasarımı ele alınacak vardır. Akış özelliklerinin ayarlanması özellikle karaciğer gibi kesme stresine karşı hassas dokular, söz konusu olduğunda, çok önemli 25 taşımaktadır. doku tarafından algılanan kesme stresi miktarı iki şekilde değiştirilebilir: İlk olarak, pompa membranlar doğru itmek için kullanılan hava basıncı düşürülebilir, sistemdeki en yüksek kesilme baskısı değerleri düşer. İkinci olarak, doku, hücre dışı matris katman içine gömülü ya da Transwell kültür ekleri kültürlenmiştir edilebilir. İkinci bir gözenekli membran ile altta yatan akım dokuları kalkan. Bu ayarlamalar MOK deney başlamadan önce her organ eşdeğer bireysel bazda yapılması gerekir. 144 atım yüksek, ama yine de fizyolojik, kalp aktivitesi karşılık örneğin 2.4 Hz&#39;lik bir pulsatil operasyonu, at / dak insanlarda, kayma gerilmesi ölçülenmikrovasküler devrenin kanal, yaklaşık 25 din / cm 2 ulaşır. Bu kanallar bir endotelizas- içeren deneyler için, bu nedenle, iyi uygulanabilir mikrovasküler ölçek yüksek ucunda bir fizyolojik kesme direncine karşılık gelir ve bir. Sunulan MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni iki organı bölmeleri bağlayan tek bir medya devresi oluşur Ancak, bir pompalama hızı ve kayma gerilmesi oranı tüm sistem için seçilecek olan. Bu nedenle, her bir organın ihtiyaçlarına akış karakteristiklerinin tam bir ayarı, her zaman mümkün değildir. Ayrıca, bakım ortak ortama hücreleri ayarlayarak alınacak etti. In vitro hücre kültürü için standart olarak hücreler, bir araya getirilen ortam devresinde MOC geliştirilmiştir, bu nedenle hiç bir hücre kültür ortamı, her bir doku modeli için de kullanılabilir. Minimal kombine medya formülasyonu önceden ve t tanımlanması gerekirO hücreleri bu yeni ortama adım adım ayarlanması gerekir. Iki gün için yeni ortama eski% 80 /% 20 bir ayarlama yöntemi, daha sonra% 50 /% 50% 20 /% 80 oranında, ardından ve tam değişimi her zaman elinde kültürlerin makul hücre canlılığı ve fonksiyonelliği yol açtı. MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni kadar üç dokuların kokültürü izin verir. Insan vücudunun en azından en önemli on organların bir kokültürünün homeostazını ulaşmak için gereklidir. Bu nedenle, sunulan sistem, belirli doku doku etkileşimleri, ancak bir maddeye gerçek sistemik yanıt tahmin etmek mümkün. Daha fazla Organ boşlukları dahil etmek MOC bir başka gelişme öngörülmektedir. Dahası sistemin çalışmaya geçerlilik referans bileşikler bir dizi kullanılarak gösterilebilir etmektir. Tercihen, (örneğin, troglitazon gibi) klinik deneyler sırasında başarısız olan bileşikler MOC kendi performansı için test edilecektir. Oysa, bu tür karmaşık sistemlerin bir gerçek doğrulama hala b engellemektediry Bu ve benzeri sistemlerin toksikolojik performansı hakkında daha fazla veri toplama fonksiyonel değerlendirme için biyomarkerları ve bitiş noktaları ile ilgili standardizasyon eksikliği, onların güvenilirliğini ve uygulama alanını genişletecek.

Ilaç gelişimi için mevcut tek tabaka veya süspansiyon hücre kültürü deneyleri, insan hücre mikro-taklit etmek ve bu nedenle, hızlı bir farklılaşmanın giderilmesi ve primer insan hücre kültürleri içinde fonksiyon kaybına yol başarısız kalmaktadır. Yüksek fizyolojik alaka ile Doku modelleri klinik çalışmalarda bunları kabul önce bileşiklerin etkinliğini ve güvenilirliğini tahmin etmek gereklidir. Son zamanlarda, in vitro hücre kültürü teknikleri standart in vivo doku mikroçevresinin taklit amaçlayan, üç-boyutlu, çok-hücreli modellerine doğru iki boyutlu tek tabaka kültürlerinden gelişmiştir. Bu sistemler zaten bileşiklerin 1,2 eylem tarzının daha doğru tahmin yolunda önemli gelişmeler göstermiştir. Bundan başka, hücrelerin yüksek özel ihtiyaçları için, in vitro kültür koşulları adapte özellikle tercih edilir. In vitro koşullarda altında standart, önemli cul çeşitligenellikle hücreleri üzerinde etki gibi besin ve oksijen beslemesi, biriken ürünlerinin ayrılması, ve mekanik bir güç olarak Ture parametreleri, bir çok durumda iyice kontrol edilemez. Birçok organ maddeler ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu fizyolojik ilgili gradyanlarını sahip. Ancak, bu son derece düzenlenir ve optimize edilmiş koşullar son derece istikrarsız ortama açan ve hücresel gelişimini 3 sınırlayıcı, in vitro koşullarda dokuların etrafında kontrol edilemeyen difüzyon geçişlerini açık muhalefet vardır. Böylece, istikrarlı ve in vitro koşullarda özellikle daha ölçülebilir uzun süre boyunca canlı ve farklılaşmış hücrelerin tutmak için gereklidir. Orta bileşenler düzenli kaldırılır ve ikame edilmiş perfüze sistemler, genellikle dokuların doğrudan çevreleyen ilgili statik kültürler daha karakterize ve kontrol edilebilir. Statik şartlar, hücre sekresyon difüzyon geçişlerini ve kültür ortamı besin altındakültür hücreleri 3 çevreleyen olabilir. Dokuların etrafında Tanıtımı iyi karakterize orta akım hızları hücre salgıları perfüzyon yoluyla zengin ortamla karıştırmak için izin verir. Bu istikrarlı hücresel fenotip sağlanması ve bütün tahlil süresi 4 boyunca enzim ifade metabolize, tanımlanan hücresel mikroçevrelerde üretilmesini sağlar. Çoklu organ çip (MOK) son gelişmeler sistemleri test sırasında gerekli maddenin azaltılmış miktarda açan, etrafında mikro biyoreaktörlerin küçük, orta ve hücre kütlesi gereksinimleri ile dokulara mühendislik kontrollü orta akış faydalarını birleştirir tabanlı. Doku kültürü için çok sayıda mikro-akışkan sistemler şu ana kadar 5,6 tarif edilmiştir. Bu sistemler içinde Doku-to-akışkan oranları fizyolojik ilgili hücresel karışma taklit bir özellikle önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, bu tür dış pompa ve rezervuar medya kullanımı gibi teknik sınırlamalar için, inciÇoğu sistemde e genel dolaşan medya hacmi doku hacimleri ile karşılaştırıldığında çok büyük. Shuler ark. grup hücre kültürü bölmeleri içinde ve in vivo ilgili doku-to-sıvı oranları 7,8 maddelerin uygun ikamet sürelerini sağlayan bir sistem geliştirmek için ilk idi. Bu aynı zamanda &quot;diğer dokular&quot; bölme temsil eden 96 oyuklu plakaya aşağı doğru, dış hazne ölçeklendirme ile elde edilmiştir. Bizim MOK platformu içinde dolaşan medya sesini en aza indirmek için, harici medya devreler için ihtiyacı ortadan kaldırarak, peristaltik on-chip mikropompayı entegre. Bu mikropompa medya akım hızları ve kayma gerilmesi oranları 9 seçilebilir sayıda sistemi çalıştırmak mümkün. 500 um genişliğinde ve 100 um yüksekliği bir mikroakışkan kanal sistemi, her bir 96-çukurlu plaka tek bir kuyunun boyutu olan iki standart doku kültürü boşluk birbirlerine bağlar. Endüstri standardı plaka boyutları bağlılıks transwell formatında üretilen mevcut doku modelleri entegrasyonunu sağlar. Ayrıca, Transwell hücre kültürü ekler dikey konumu sadece doğrudan sıvı akışına maruz olmayan doku modelleri ekimi sağlayan, ayarlanabilir, ama aynı zamanda yukarı kaldırdı ve altta yatan akım korumalı olabilir. Benzer şekilde, hava-sıvı arayüz kültürleri bu sistem ile kullanılmak için uygun bulunmaktadır. MOC platformu bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka 2 mm yüksekliğinde ve sürekli sıvı-geçirmez mikroakışkan devre oluşturmak üzere düşük basınçlı bir plazma oksidasyonu ile bağlandıkları 75 x 25 mm2 bir ayak izi, bir cam mikroskop lamı ile imal edilir. İlgili kanalları ve hücre kültürü bölmeleri içeren PDMS katmanı standart yumuşak litografi ve çoğaltma 9 kalıp üretilir. Bu çalışma esnasında kullanılan MOC mikrofluidik tasarım, her iki hücre c tutarak, çip başına iki ayrı mikroakışkan devrelerin oluşuyordu100 um yüksek bir kanal sistemi ile birbirine ulture bölmeleri. Bu bir çoklu organ çip kullanan iki ayrı iki doku cocultures performansını izin. Pompa frekansları 40 ul / dk arasında orta akış oranlarını elde etmek üzere ayarlandı. Bu iki doku MOC tasarımı fizyolojik akış koşullarında kombine medya devresinde olsa, ayrı kültür alanlarda bir karaciğer sfero ve cilt punch biyopsi kokültürü yeteneği sağladı. Homojen sferoidler oluşturmak üzere 1: Ayrılmış HepaRG hücreleri 24 oranında insan hepatik yıldız şeklinde hücreler (HHSteC) ile bir araya toplanır edildi. Olsa bile, hepatosit yaklaşık iki kat sayısı, in vivo duruma göre kullanıldı, önceki deneylerde 10 de görüldüğü gibi, bu oran, en uygun olduğu bulunmuştur. Böylece deri topik madde maruz kalmasını sağlayarak, bir Transwell hücre kültür kabı içinde bir hava-sıvı ara yüzeyinde yetiştirildi. Bu doku modelleri 28 gün boyunca birlikte yetiştirilmiş edildiMOC olarak ays bu sistemin kapsamlılığını göstermek için. Ayrıca, cips mikroakışkan kanal devresi tamamen daha yakın damar sistemini simüle etmek için, insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) ile kaplandı.

<table><tbody><tr><td>HepaRG cells</td><td>Biopredic International</td><td></td><td>undifferentiated cells</td></tr><tr><td>HHSteC</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td></td><td>cells and all culture supplements</td></tr><tr><td>HepaRG Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>William&#039;s Medium E&lt;br /&gt;10% FCS&lt;br /&gt;100 U/ml penicillin&lt;br /&gt;100 &amp;micro;g/ml streptomycin&lt;br /&gt;5 &amp;micro;g/ml human insulin&lt;br /&gt;2 mM L-glutamine&lt;br /&gt;5 x 10&lt;sup&gt;-5&lt;/sup&gt; M hydrocortisone hemisuccinate</td></tr><tr><td>HDMEC Medium</td><td>PromoCell</td><td></td><td>Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Carl Roth</td><td></td><td>add 2% to HepaRG media</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXYMum Recovery Tips</td><td>Corning</td><td></td><td>1,000 &amp;micro;l Pipet Tips Wide Bore</td></tr><tr><td>384-Well Hanging Drop Plate</td><td>3D Biomatrix</td><td></td><td>Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate</td></tr><tr><td>Tissue culture flasks</td><td>Corning</td><td></td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td></td><td>24-well</td></tr><tr><td>Transwell cell culture inserts</td><td>Corning</td><td></td><td>96-well unit, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Deep well plates</td><td>Corning</td><td></td><td>96-well, 1 ml</td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Stusche</td><td></td><td>4.5 mm</td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td>Menzel</td><td></td><td>footprint of 75 x 25&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Silicon rubber additive</td><td>Wacker Chemie</td><td></td><td>Wacker Primer G790</td></tr><tr><td>Tubes for air pressure</td><td>SMC Pneumatik GmbH</td><td></td><td>Polyurethan-Schlauch, metrisch</td></tr><tr><td>Alumin ELISA</td><td>Bethyl Laboratories</td><td></td><td>Human Albumin ELISA Quantitation Set</td></tr><tr><td>Lactate dehydrogenase assay</td><td>Stanbio Laboratory</td><td></td><td>LDH Liqui-UV kit</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 acetylated LDL</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1 mg/ml</td></tr></tbody></table>

the multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Standart in vitro doku kültürleri dokulara oksijen ve besin kaynağı difüzyon sınırlama, statik koşullar altında gerçekleştirilir. Gelişmiş tedarik özelliklerini gösteren akışkan sistemler, genellikle doku oranları olmayan fizyolojik yüksek orta sahip, onların büyük orta gereksinimleri tarafından engellenmektedir. Böylece, metabolitler seyreltilmiş ve hücreler çevrelerini kondisyon mümkün değildir. Bu çalışmada sunulan MOC mikroakışkan kanal sistemi, iki ayrı doku kültürü bölmeleri, bir standart 96 oyuklu plaka tek bir oyuk birer çift bağlar. sistem ve çip üzerinde pompanın entegrasyon küçük ölçekli sistemi sadece 200-800 ul ortam hacimleri de çalışmasına izin verir. 1-31: Bu 8 doku oranı toplam sistemik ortama karşılık gelen 1, sırasıyla, (yaklaşık 26 ul toplam doku hacmine sahip), karaciğer ve deri dokusu alt kültürler için. Bir adam 7 ağırlığında toplam ekstra-hücresel sıvı hacmiIntercapillary sıvı hacmi 1 doku oranında fizyolojik hücre dışı sıvı yol açan, 5.1 L, ki bunun 3 kg, 14.6 L: 4. Bu nedenle, MOK bütün dolaşım sistemi medyanın miktarı fizyolojik duruma göre hala daha büyüktür; ve henüz bu çoklu organ sistemleri 5 için bugüne kadar bildirilen doku oranı en küçük medyayı temsil eder. Endüstri standardı doku kültürü formatları korunur gibi, araştırmacılar ortak bir sıvı akışı içinde mevcut ve zaten valide statik doku modelleri birleştirmek mümkün. 1 olası MOK tek doku veya çok doku cocultures deneysel bir set-up şematik göstermektedir. Birincil doku biyopsisi ve in vitro olarak hücre kuşakları ya da birincil hücreler doku benzeri 96 gözlü hücre kültür ekleri kullanılarak ya da ekili ya da doku kültürü bölmelere doğrudan yerleştirilmesiyle edilebilir -generated. Hücre kültürü bölmeleri birbirine kanal sistemi sadece 100 μ olduğu gibim yüksekliğinde, bu boyutları aşan doku kültürü benzerleri bölmeleri içinde muhafaza edilecektir. Primer HDMECs ile MOK devresinin endotelizasyonunun biyolojik damar yapısını sağlayarak ileriye daha fizyolojik kültür koşulları bir adım daha sağlar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. MOK kültürlerin şematik gösterimi Doku benzerleri MOC inoküle ve dinamik koşullar altında tek kültürleri veya cocultures olarak yetiştirilen, standart in vitro koşullarda hazırlanır. Günlük medya örnekleri ve uç nokta analizleri yapılmaktadır. Pompayı sürücü Hava basıncı yukarıdan MOC bağlı üç mavi tüpler aracılığıyla uygulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, endotelizasyon protokol izlenerek, mikroakışkan kanal devresinin bir konfluent HDMEC kapsamı, dinamik kültürü dört gün içinde elde edilir. Hücreler, hali hazırda MOC kanal duvarlarına bağlı konfluent tek tabaka oluşturmak ve kesme boyunca uzunlamasına stres (Şekil 2B). Daha önce rapor edildiği gibi, 9 Ayrıca hücreler, kanal tüm çevresini kaplar. Endotel morfoloji daha başka bir değişiklik kültür sonuna kadar ekimi dört gün sonra gözlenmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> Şekil 2:. Endotelize MOC kanal insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) mikroakışkan devresinde bir konfluent tek tabaka oluşturulmuştur. Hücreler MOK kültür 23 gün sonra asetillenmiş LDL ile boyandı. (A), bütün m,icrovascular devre kesme stresi boyunca uzatılmış hücreleri ve (B) &#39;hücreleri ile kaplandı. Ölçek çubukları: (A), 1.000 mm ve (B) = 100 um. Bir başka deneyde, tutarlı bir disk şeklinde karaciğer hücre sferoidler Bu model sistemi, daha önce, ilaç metabolizması için uygun olarak bildirildiği gibi, asılı damla kültür iki gün boyunca HepaRG ve HHSteC oluşan 11 çalışmalar - 13&#39;de belirtilmiştir. Gösterim amacıyla, her bir MOC devrenin bir doku kültürü bölmesi 96 oyuklu hücre kültürü ekler 20 küremsiler ile tohumlanmış ve dokuların olmayan endotelize MOKSL kullanarak dinamik koşullar altında 14 gün boyunca yetiştirilmiştir. Agrega veya birincil madde miktarı, herhangi bir sayıda, doğrudan bölmeler içine ya da hücre kültürü kalıpları kullanılarak ya da entegre edilebilir. MOC gelen alma sonrası sferoitlerin immunofluorescent boyama li için güçlü, homojen ifadesini gösterirver tipik sitokeratin 18/08 ve faz I enzimleri sitokrom P450 3A4 ve 7A1 metabolize (Şekil 3A ve 3B). Kanalikülde taşıyıcı çoklu ilaç direnci proteini 2 boyanması (MRP-2) bir polarize fenotip ve ilkel safra Kanalikülleri benzeri ağların varlığını (Şekil 3C) saptandı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> Şekil 3 :. MOC 14 gün kültive MOC. Karaciğer agrega insan yapay karaciğer mikro-dokuların yetiştirme (A), sitokeratin 18/08 (kırmızı) ve (B), sitokrom P450 3A4 (kırmızı) ve 7A1 (yeşil) için boyandı. Kanalikülde taşıyıcı MRP-2 (yeşil) (C) Anlatım, mavi nükleer boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron. Albumin üretim karaciğer doku kültürlerinin temel bir ön koşuldur gibi, arı vardırn MOC karaciğer-tipik aktivitesini izlemek için seçti. Albümin üretimi için günlük ortam numuneleri analiz statik kültürleri (Şekil 4) ve literatürde 11&#39;de bildirilen değerlerle karşılaştırıldığında MOC kültürlerde üretim hızında önemli bir artış göstermektedir. albümin sentezi oranındaki artışın MOC kültürlerde artan oksijen ve besin kaynağına bağlı olabilir. Bu nedenle, MOC, albümin üretimi gibi karaciğer tipik bir hareketi, arttırıcı, metabolik açıdan aktif bir halde 14 günlük bir kültür dönemi boyunca karaciğer agrega sürdürmek edebilmektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> Şekil 4: MOC Ondört gün karaciğer sfero performansı MOC ve statik kültüründe karaciğer tek doku kültürleri Albümin üretim.. Veriler ortalama ± SEM (n = 4). Che ve Subsystemic tekrarlanan doz toksisite testleriOECD rehberinin tarafından tanımlanan hayvanlarda micals ve kozmetik hayır, maruz kalma 21-28 gün gerektirir. 410 &quot;Doz Dermal toksisitesi Tekrarlanan: 21/28 günlük Çalışması.&quot; Uzun süreli cilt karaciğer cocultures düzenleyici gereksinimlere başa kadar 28 gün süreyle burada örneklenmiştir. Bir hava-sıvı arayüzü 96-kuyu hücre kültürü ekler cilt biyopsi yetiştirilmesi daha sonra dermal madde maruziyeti sağlanır. kokültürünün deney, bir araya getirilen ortam devresinde üç doku kokültürünün uygulanabilir ve 28 gün boyunca metabolik olarak aktif tutulabilir olmadığını kanıtlamak için endotelize Kendi yaptığım şeyler için örnek olarak gerçekleştirilir. Ortam üst sıvı kısımları içinde bir LDH aktivite analizi bundan sonra da yaklaşık 80 U / l (Şekil 5) sabit kaldı kültürün ilk sekiz gün boyunca giderek azalan seviyesi saptandı. Bu, daha sonra zaman noktalarında sistemde yapay ama istikrarlı bir doku ciro gösterir. Karaciğer single üç-doku kokültürü karşılaştırılması-Doku ve karaciğer-endotel kokültürünün deneyleri, bir ölçüde azalmış LDH düzeyi, özellikle deri dahil değil kültürlerde ilk günlerinde, bulunamadı. Deri, tek doku MOC kültürleri ortaya yüksek LDH aktivite ilk süre içinde hücre ölümü (veriler gösterilmemiştir), deri kültür bölmesinde, öncelikle oluştu. Bu cilt delme sonucu biyopsi çevredeki yaralı bölgeye bağlı olabilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> Şekil 5:. Endotelize MOC içinde endotelize Kendi yaptığım şeyler (MOK Li-Va) ve karaciğer-cilt cocultures karaciğer tek doku kültürlerinde (MOK Li), karaciğer kültürlerin medya Süpernatantları MOK LDH aktivitesinde Onbeş gün doku performansı (MOC Li -Va-Sk). Veriler ortalama ± SEM (n = 4). 28-günlük kültür döneminde, karaciğer sferoidler MOC a altına yapıştırılırnd hücreler komşu sferoitler arasında bir bağlantı oluşturan çok katmanlı, büyümüştür. Bu doku işlevini engel yoktu. Bağışıklık fluorışıması yoluyla Son nokta analizi sitokrom P450 3A4 boyama (Şekil 6A) ile gösterildiği gibi, karaciğer sferoidler MOC ko-kültürü 28 gün sonra hala metabolik olarak aktif olduğunu göstermektedir. Vimentin boyama (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi HHSteC, bütün karaciğer eşdeğer dağıtıldı. Vimentin boyama yoğunluğunda bir artış hücrelerin sferoitlerin üzerinden büyümüş olan alanlarda gözlenebilir. Von Willebrand faktörü (vWF) için boyama endotel hücreleri dokuya derinlemesine nüfuz etmediğini gösterdi, ancak dış hepatositler (Şekil 6C) ile doğrudan hücre-hücre teması vardı. Statik kontrol boyama ELEVAT gösterdi iken deri biyopsisi İmmünohistokimyası boyama, tenaskin C ve bazal membran (Şekil 6D) kollajen IV bir ifade gösterditenaskin C (Şekil 6E), ed seviyeleri. Tenascin Cı, yara iyileşmesi, iltihap süreçleri ve fibroz sırasında yukarı regüle ettiği gösterilmiştir dinamik kültürler 14,15 fibrotik statik süreçleri ancak neden göstermektedir. Stabil hücre canlılığı ve MOC olarak 28 günlük bir birlikte-kültür sonrası dokuların işlevi sistem ortak bir ortam devre üçe kadar dokular bir arada tutmak mümkün olduğunu kanıtlamaktadır. Birincil hücreler, hem de doku modelleri ve biyopsi MOC sisteminde aynı anda yetiştirilebilir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> Şekil 6:. Çoklu doku kültürleri Performans 28 gün boyunca karaciğer benzerleri ve deri biyopsileri bir endotelize MOC ve hücre fonksiyonu kültive (A) Birinci aşama, immün ile gösterilmiştir bir sitokrom P450 enzimleri3A4 karaciğer dokusunda (kırmızı), (B) vimentin (kırmızı), (C) sitokeratin 8/18 (kırmızı) ve vWF (yeşil). Statik koşullar altında MOC veya (E) &#39;de 28 gün (D) birlikte yetiştirilmiş deri biyopsileri tenaskin c (kırmızı) ve kolajen IV (yeşil), mavi nükleer boyama için boyandı. MOC kültürü 28 gün sonra, deri (F) H &amp; E boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron.

Watch this Scientific Journal Video about The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture at JoVE.com

Çoklu Organ Çipi - Uzun Vadeli Çoklu Doku Ortak Kültürü için Mikroakışkan Bir Platform | Biyomühendislik | Video

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

the-multi-organ-chip-microfluidic-platform-for-long-term-multi-tissue

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

28.7K Görüntüleme.  Technische Universität Berlin. Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Video: The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biyoloji

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Gelişim Biyolojisi

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

Bağırsak Bölgesine Özgü İşlevselliği Modellemek için İnsan Organoidlerini ve Çip Üzerinde Organ Teknolojisini Birleştirme

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise invisible processes. Advanced cell assays closely mimicking in vivo scenery are establishing themselves as novel ways to visualize and measure the bidirectional tumor-host interplay influencing the progression of cancer. Here we describe two versatile protocols to recreate highly controllable 2D and 3D co-cultures in microdevices, mimicking the complexity of the tumor microenvironment (TME), under natural and therapy-induced immunosurveillance. In section 1, an experimental setting is provided to monitor crosstalk between adherent tumor cells and floating immune populations, by bright field time-lapse microscopy. As an applicative scenario, we analyze the effects of anti-cancer treatments, such as the so-called immunogenic cancer cell death inducers on the recruitment and activation of immune cells. In section 2, 3D tumor-immune microenvironments are assembled in a competitive layout. Differential immune infiltration is monitored by fluorescence snapshots up to 72 h, to evaluate combination therapeutic strategies. In both settings, image processing steps are illustrated to extract a plethora of immune cell parameters (e.g., immune cell migration and interaction, response to therapeutic agents). These simple and powerful methods can be further tailored to simulate the complexity of the TME encompassing the heterogeneity and plasticity of cancer, stromal and immune cells subtypes, as well as their reciprocal interactions as drivers of cancer evolution. The compliance of these rapidly evolving technologies with live-cell high-content imaging can lead to the generation of large informative datasets, bringing forth new challenges. Indeed, the triangle &#39;&#39;co-cultures/microscopy/advanced data analysis&#34; sets the path towards a precise problem parametrization that may assist tailor-made therapeutic protocols. We expect that future integration of cancer-immune on-a-chip with artificial intelligence for high-throughput processing will synergize a large step forward in leveraging the capabilities as predictive and preclinical tools for precision and personalized oncology.

In the age of immunotherapy and single-cell genomic profiling, cancer biology requires novel in vitro and computational tools for investigating the tumor-immune interface in a proper spatiotemporal context. We describe protocols to exploit tumor-immune microfluidic co-cultures in 2D and 3D settings, compatible with dynamic, multiparametric monitoring of cellular functions.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...