iş GO-Bio Hibe No. 0315569, Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir.

NOT: İnsan çocuk sünnet rutin sünnet sonrası bir çocuk cerrahiden, ilgili yasalara uygun olarak, aydınlatılmış onam ve etik onayı (Etik Komitesi Charite Üniversitesi Tıp Berlin, Almanya) ile elde edilmiştir. MOC içinde Yetiştirme Doku Benzerleri 1. Üretim <ol><li> Karaciğer sferoidler oluşturmak için açılan plakaları asılı HepaRG ve HHSteC agrega. <ol><li> , Birleşmiş ortamın farklılaşmış tek tabaka kültürleri çıkarın (2 75 cm) hücre kültürü şişelerinde büyütülmüştür HepaRG hücrelerinin tripsinizasyon elde etmek için, iki kez PBS ile yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 3 ila 5 dakika boyunca inkübe ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücre sayımı Santrifüj HepaRG hücreleri. Hücre canlılığı&gt;% 90 olmalıdır. </li><li> Içinde, HHSteC hücrelerinin trypsinization elde tek tabakalı kültürlerden gelen orta kaldırmak, PBS ile iki kez yıkayın ve% 0.05 tripsin / EDTA 3 ml eklemek için sipariş. 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücrelerin sayısı en HHSteC hücreleri. </li><li> 24 bir oranda HepaRG ve HHSteC Birleştir: 1 HepaRG hücre kültür ortamı içinde. Bunu yapmak için, HepaRG hücre kültür ortamı içinde hücre süspansiyonları seyreltilmesiyle hücre sayıları ayarlayın ve 4.8 x 10 6 hücre / mL HepaRG hücreleri 1 x 10 5 hücre / mi HHSteC ekleyin. Dikkatle karıştırın. </li><li> Asılı damla ve alıcı plaka PBS 2 ml ilave etmek suretiyle, bir asılı bırakma plakası hazırlayın. </li><li> Pipet Asılı damla plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 20 ul. Her zaman yaklaşık% 10 daha fazla asılı bazı büyüklükler Duri kaybolur gibi, agrega almak için ihtiyacınız olandan damla hazırlamakprosedür ng. Dikkatlice 37 ° C inkübatör plaka koyun. Küresel şekiller oluşturmak için 48 saat bekleyin. </li><li> Sferoidler almak için, geniş uç sonları ile pipet uçları kullanın veya yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril bir bıçakla 1 ml pipet ipuçları ipuçları kesmek için emin olun. Onları aksatmadan sferoidler işlemek için bu pipet ipuçlarını kullanın. </li><li> Arka arkaya, bir pipet kullanılarak Asılı damla plakasının deliklerinin üstüne ortam 1 ml ilave etmek suretiyle asılı bırakma plakası dikkatle sferoidler yıkayın. Tüm sferoidler düşmüş kadar plaka yıkayın. Küresel şekiller hafif disk şeklinde 300 um ila 400 orta çap ve bu noktada 200 ila 300 arasında bir yüksekliğe sahip bulunmaktadır. </li><li> Alıcı plakasındaki sferoitleri toplayın ve iyi hazırlanmış pipet ipuçlarını kullanarak başına 20 sferoitlerin maksimum 24-kuyu, ultra-düşük bağlanma plakaları aktarabilirsiniz. 0.5 ml her bir ortam hacimleri ayarlayın. Ino 20 agrega kullanarakin vivo hücre sayıları ile ilgili olarak 1 / 100.000 minyatür oranını elde etmek için bir MOK devre hesaplanmalıdır. </li><li> MOC de kullanılana kadar CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin sferoidler ve% 5. Karşılaştırılabilirliği sağlamak için kullanmadan önce sferoitlerin daha uzun üç gün saklamayın. Homojen sferoidler almak için ultra-düşük bağlanma plakalar, en az bir gün için agrega geliştirin. </li></ol></li><li> Cilt dokusu eşdeğerleri oluşturmak için iki yaklaşımdan birini takip: punch biyopsi (1.2.1) veya hazır in vitro doku modelleri (1.3.1) &#39;de kullanılması kullanımı. <ol><li> Bir sonraki kullanıma kadar steril koşullar altında, 96-gözlü hücre kültür uçlar ve deposu hazırlamak için dirsek altında bir akkor bıçakla transwells kesin. </li><li> 30 saniye için% 80 etanol içinde sünnet örnekleri sterilize ve açık halka kesti. Numuneler 2 mm arasında bir ortalama bir yüksekliğe sahip olmalıdır. </li><li> Eşit miniaturiza elde etmek için 4.5 mm çapında biyopsi kesmek için bir biyopsi yumruk kullanınkaraciğer ve cilt hem de siyon oranı. Forseps ile ekler Transwell hazırlanan 96-kuyuya biyopsi yükleyin. Epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde biyopsi konumuna dikkat edin. </li><li> Talep hücre kültürü MOC de kullanılana kadar HepaRG hücre kültür ortamı ve mağaza 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 içeren bir alıcı plaka biyopsileri olan ekler. 3 saat kadar 2&#39;den değil mağaza örnekleri daha uzun yapın. </li></ol></li><li> MOK&#39;ye içine, çeşitli tedarikçilerden satın onlar 96-de Transwell formatta olduğundan emin yapma, hazır vitro deri modellerinde entegre. Satıcı tarafından veya başka bir dokuya sahip bir kokültürünün bir sonraki adımda öngörülür ise, her iki destek dokular en az bir orta kullanmak verilen hücre kültürü ortamı kullanın. Dokuları desteklemek kapasitesi için önce statik deneylerde ilgili asgari orta sınayın. <ol><li> Tutucu plaka cilt modellerini almak ve bir akkor bıçakla dirsek altında 96-kuyu ekler kesti. </li&gt; <li> MOC de kullanılana kadar CO2 37 ° C&#39;de geri alıcı plaka ve deposuna ekler yerleştirin ve% 5. Bir gün daha uzun değil mağaza örnekleri yapın. </li></ol></li></ol> 2. MOC Fabrikasyon <ol><li> 10 bir oranda PDMS ve sertleştirme maddesi karıştırma: 1 (h / h) ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında karışımı yerleştirin. </li><li> Bununla birlikte, 20 dakika süre ile 80 ° C&#39;de silikon kauçuk katkı maddesi ile bir polikarbonat kapak plakasını tedavi. </li><li> Micropump olan, 500 mikron kalınlığında dört PDMS serbest hücre kültürü bölmeleri ve altı PDMS membranlar, oluşturmak için kapak plakası ilgili deliklere teflon Vidaları yerleştirin. </li><li> İki mikrovasküler devrelerin ana kalıp hazırlanan kapak plakasını takın ve gazı alınmış PDMS enjekte. Sisteme hava kabarcıkları entegre dikkat edin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, cihazı eğerek bunları kaldırmak için çalışın. </li><li> PDMS tabakasını sertleştirmek için 60 dakika boyunca 80 ° C&#39;de inkübe edin sistemi. </li><li> Master kalıp ve cihazdan teflon vidaları çıkarın ve düşük basınçlı plazma oksidasyonu kullanarak 75 x 25 mm 2 kaplayan bir cam slayt PDMS katmanı bağlamak. </li><li> Kapak plaka dört hücre kültürü bölmelerine özel iplik MOC adaptörleri Vida. </li><li> Kadın Luer x ¼-28 erkek adaptörleri kültür ortamı içeren şırınga bağlayın ve onlara kapak plaka MOK adaptörleri vida. </li><li> Tekrar tekrar aşağı iterek ve şırıngalar pistonları yukarı çekerek mikroakışkan devreye orta enjekte edilir. </li><li> Mikroskop altında orta kanallarda doğru doldurulmasını kontrol edin. </li></ol> MOC 3. endotelizasyon <ol><li> Endotelial hücre büyüme ortamı ile MOC, gömme her MOC devre endothelializing ve CO2 37 ° C&#39;de üç gün boyunca statik inkübe ve% 5 önce. <ol><li> Bir etanol kullanılarak MOKSL silme sterilize bir laminer akış tezgah altına yerleştirin. Benn Ayrıca, forseps iki çift ve bir sonraki kullanım için iki altıgen tuşları sterilize. </li><li> Altıgen tuşlarını kullanarak MOC doku kültürü bölmesinin kapaklarını gevşetin ve forseps kullanarak kapaklarını çıkarın. Orta yerleştirdikten sonra, aynı şekilde Kendi yaptığım şeyler için geri vidalı kapakları. </li></ol></li><li> Insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) olarak tripsinizasyon elde etmek için, tek tabakalı kültürleri orta kaldırmak PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. </li><li> Santrifüj HDMEC 5 dakika boyunca 220 x g, kaldırma süpernatan, endotel hücre büyüme ortamı, 1 ml hücre topağı tekrar süspansiyon ve hücreleri sayın. Hücre canlılığı&gt;% 90 olmalıdır. </li><li> Endotelial hücre büyüme ortamı ile seyreltilmesi, 2 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu içinde hücre sayısını ayarlama ve bunun 250 ul transfer1 ml şırınga. Bütün organları için 1 / 100.000 minyatür oranını korumak için MOC hücrelerin bu konsantrasyon uygulayın. </li><li> Bir kadın Luer x ¼-28 erkek adaptör şırınga bağlayın, bu uydurma dışında havayı dışarı atmak, ve özel bir iplik MOC adaptörü vida. Her MOK devrenin iki bölmeden birine adaptörünü bağlayın. </li><li> MOC devresinin ikinci bölmeye aynı şekilde boş bir enjektörü. </li><li> Ardışık şekilde birkaç kez aşağı iterek ve iki şırınga pistonunu yukarı çekerek eşit hücreleri enjekte edilir. Mikroskop altında hücre infüzyonu kontrol edin. </li><li> Hücreler kanal duvarlarına yapışmasının sağlanması için 3 saat boyunca statik koşullar altında CO2, 37 ° C&#39;de inkübe edin MOC ve% 5. </li><li> , Inkübatör çipi çıkartın bir laminer akış tezgah altına yerleştirin ve özel iplik MOC hücre kültürü odaları ile şırınga ve MOK adaptörleri değiştirin. </li><li> Bir com taze orta 400 ul ekleyinHer MOK devre bölmesindeki ve hidrostatik basınç kanallardan yıkayın edelim. Daha sonra, taze ortam 300 ul, her iki bölme içinde orta yerine. </li><li> 3.1.2 tarif edildiği gibi, kapaklar kullanılarak bölmeleri kapatın. </li><li> Pompa kontrol ünitesine çip takın. 0.475 Hz frekansında pompalama hızını ayarlamak ve CO2 37 ° C&#39;de çip yetiştirmek ve% 5. </li><li> Her MOK bölmenin orta iki gün her biri değiştirin ve ışık mikroskobu ile hücre morfolojisi izlemek. </li></ol> Chip 4. Yükleme <ol><li> Laminer akış tezgah altında MOC yerleştirin ve adım 3.1.2 açıklandığı gibi, açın. </li><li> Doku kültürü bölmelerden Ortamı çıkarın ve taze HepaRG hücre kültür ortamının 300 ul ile değiştirin. </li><li> Geniş açılması ile pipet uçları kullanarak her MOK devrenin bir doku kültürü bölmesine 20 önceden sferoitleri aktarın (bkz adımları 1.1.8 / 9). C kapatınap forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak. </li><li> Forseps kullanarak her MOK devrenin kalan doku kültürü bölmesine cilt eşdeğer içeren transfer 96-kuyu hücre kültürü ekler. Cilt eşdeğer zarın altındaki kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bunu yapmak için, bir hafif eğik açıyla transwells eklemek ve yavaşça aşağı doğru itin. Transwell çevresinde aşırı orta çıkarın bir pipet ile aşağıdan yukarıya itilir. </li><li> Forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak kapağını kapatın. </li></ol> 5. Pompa Kontrol Birimine Chip Bağlama <ol><li> Değerlere kontrol ünitelerinde Set operasyonel parametreler istenen. 0&#39;dan 8.000 mbar, 0&#39;dan -800 mbar vakum ve 0.24 2.4 Hz frekans pompalama hava basıncını değiştirin. Saat yönünde ya da saat yönünün tersine pompalama yönünü ayarlayın. </li><li> Laminer akış tezgah altından MOK içeren doku benzerleri çıkarın ve pompa kontrol birimlerine bağlayın. </li><li> Numerat ardındantüpler iyon MOK&#39;ye üzerindeki ilgili bağlantı parçaları hava basıncı tüpünü yerleştirin. </li><li> 37 ° C ısı ve çip enkübatör dışında çip yetiştirmek için MOC destek kullanarak canlı doku görüntüleme durumunda, 37 ° C&#39;de MOC yetiştirmek ve% 5 CO2, bir kuluçka makinesi içinde ya da. Standart mikroskop altında MOC hücreleri yetiştirmek için ısıtılmış destek kullanın. </li></ol> 6. Maddeler Medya Değişimleri, Örnekleme Medya ve Pozlama Sahne <ol><li> Dokusunda kültür ve hücrelerin metabolik aktivitesinin türü dikkate alınarak, her gün veya her gün rutin medya değişimi gerçekleştirin. <ol><li> Inkübatör Gider Al ve medya akış oranlarını kontrol ve kirlenme kontrol etmek için mikroskop altında gözlemlemek. </li><li> Hava basıncı hortumu çıkararak pompa kontrol ünitesinden MOC ayırın. Etanol mendil kullanarak MOC sterilize ve laminer akış tezgah altına koymak. </li><li> Doku kültürü comp açmaAşama 3.1.2 tarif edildiği gibi, karaciğer kürecikler içeren artment. </li><li> Küremsilerin bozmadan, bir pipet kullanılarak bölmesinden 200 ul kadar çıkarın ve derin-yuvalı plakanın bir boş kuyudaki ortam saklayın. Doğrudan ortam numunesi analiz veya derin oyuklu plaka kapatmak ve daha fazla analiz için -80 ° C&#39;de ortam numuneleri muhafaza. </li><li> 250 ul taze bir hücre kültürü ortamı ile MOC ortamını yerine yerleştirin ve kapağı kapatın. nedeniyle sistemin kapatırken çipin üzerinden sızıntı az miktarda ortam çıkarıldı ve kaybının yerini tutmaktadır ikame miktarındaki farklılık. </li><li> Doku devamlılığı için denetlemek için bu noktada deri eşdeğerleri tutan doku kültürü bölmesinin kapağını açın. Sisteme giren hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Kapağı kapatın. </li><li> 5.3 adım ve bir kuluçka makinesi içinde MOC yerleştirmek için uygun MOC pompa kontrol ünitesinin boru bağlayın. </li></ol></li></ol> 7. Günlük Medya Örnekleri analiz ve gerçekleştirin On-line Analizi <ol><li> On-line canlı hücre görüntüleme veya çevrimdışı kullanarak, günlük medya örnekleri analiz edilerek doku kültürü performansını analiz. Standart rutin enzimatik tahliller (örn laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesi) veya ELISA (örn albümin konsantrasyonu) tarafından ikincisi gerçekleştirin. Bir online analiz aşağıda açıklanmıştır. </li><li> (Içerisinde seyreltilmiş 6.1.1 6.1.4 adımları tarif edildiği gibi, endotelize MOC ortamını çıkarın ve 10 ug 200 ul her iki doku kültürü bölümlerinde / ml fluorofor asetile konjuge düşük-yoğunluklu lipoprotein (LDL) çözeltisi yerine Hücre kültür ortamı). </li><li> Kapaklar kapatın. 5.3 aşamasına göre, pompa kontrol birimine MOC bağlayın ve mikroakışkan devre içerisinde eşit bir şekilde, solüsyonun dağıtımı için 0.475 Hz 30 dakika için pompa. </li><li> Pompalama durdurun ve 37 ° C&#39;de 3.5 saat ve% 5 CO 2 için statik MOC kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Benzer tO, 7.2 adım, her iki bölme ile ilgili asetillenmiş LDL çözeltisi kaldırmak ve iki bölmesinden biri içinde taze ortam 400 ul ile değiştirin. </li><li> 3 ila 5 dk hidrostatik basınç mikroakışkan kanal devresi aracılığıyla orta sürücü izin için bekleyin. </li><li> Taze ortam 300 ul akması ve aynı zamanda taze ortam 300 ul ikinci doku kültürü bölmesini doldurmak olan orta değiştirin. </li><li> Adım 3.1.2 göre, MOC kapatın. Flöresanlı bir mikroskop altında koyun ve hücre büyümesini ve canlılığını izleyin. </li><li> Ekimi devam etmek için geri inkübatör lekeli MOC yerleştirin. Her aşağıdaki ortam değiştirme ile hücrelerin dışarı sızdıran leke çıkarın. </li></ol> 8. MOC gelen doku Eşdeğer almak ve Bitiş noktası Analizleri gerçekleştirin <ol><li> Son nokta analizleri için deney sonunda MOC doku eşdeğerleri alın. <ol><li> Karaciğer ve cilt e almak içinadımlar 6.1.4 için 6.1.1 de açıklandığı gibi MOC gelen quivalents, her doku kültürü bölmesindeki ortamı çıkarın. </li><li> Forseps kullanılarak MOC cildi içeren 96 gözlü hücre kültür ekleri çıkarın. Forseps ile bir tarafta o sürükleyici ve aşağı doğru çekerek ekleme dikkatle zarı soyulabilir. Bu noktada cilt eşdeğer kaybetmek değil dikkat edin. </li><li> Cryo-gömme bileşik cilt eşdeğer tutan membran Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Kesim pipet uçları kullanarak onları pipetleme doku kültürü bölmesinden benzer karaciğer eşdeğerleri çıkarın (adım 1.1.8 / 9). <ol><li> Cryo-gömme bileşik karaciğer sferoidlerinden gömün. Çok fazla sıvı aktarmak ve bir pipet ile herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için dikkat edin. Gömme bileşik üzerine sferoitleri yerleştirerek ve orta çıkardıktan sonra, bunları tam olarak çevrelemek için sferoitlerin üst üzerine daha cryo bileşik ekleyin. </li><li> Karaciğer benzerleri Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Daha önceki protokollarda 10&#39;da tarif edildiği gibi, doku-spesifik belirteçler 8 um bölüm ve boyama için kriyo-mikrotom doku benzeri kesilerek nokta analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelm, J. M., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+tissue+engineering+using+gravity-enforced+cell+assembly.">Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly.</a> Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).</li><li>Marx, U., Walles, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+Developments:+A+Translational+Cutting-edge+Alternative+to+Systemic+Safety+Assessment+and+Efficiency+Evaluation+of+Substances+in+Laboratory+Animals+and+Man.">Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+HepG2/C3A+cell+cultures+in+a+microfluidic+bioreactor.">Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).</li><li>Dash, A., Inman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+in+the+evaluation+of+drug+safety.">Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety.</a> Expert opinion on drug metabolism &amp; toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing--organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).</li><li>Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+physiological+biomimicry:+organs-on-chips.">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).</li><li>Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+fabrication+of+three-chamber+microscale+cell+culture+analog+devices+with+integrated+dissolved+oxygen+sensors.">The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors.</a> Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).</li><li>Tatosian, D. a., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+evaluation+of+drug+mixtures+for+potential+efficacy+in+treating+multidrug+resistant+cancers.">A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).</li><li>Schimek, K., Busek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).</li><li>Wagner, I., Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+multi-organ-chip+for+long-term+cultivation+and+substance+testing+proven+by+3D+human+liver+and+skin+tissue+co-culture.">A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).</li><li>Vieira, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HepaRG+human+hepatic+cell+line+utility+as+a+surrogate+for+primary+human+hepatocytes+in+drug+metabolism+assessment+in+vitro.">HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro.</a> Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).</li><li>Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+of+hepatocytes+and+stellate+cells.">Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells.</a> Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).</li><li>Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+HepaRG+model+as+an+attractive+tool+for+toxicity+testing.">Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing.</a> Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).</li><li>Chiquet-Ehrismann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascins.">Tenascins.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).</li><li>Sidgwick, G. P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules+implicated+in+hypertrophic+and+keloid+scarring.">Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).</li><li>Ata&#231;, B., Wagner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Wu, M. -. H., Huang, S., Lee, G. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models+A+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li><li>Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2012).</li><li>Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+function+and+extracellular+matrix+geometry:+long-term+culture+in+a+sandwich+configuration.">Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration.</a> FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).</li><li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+PDMS+(polydimethylsiloxane)+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes.">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li><li>Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+3-dimensional+cell+culture+and+cell-based+assays.">A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays.</a> Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).</li><li>Prot, J. -. M., Aninat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+HepG2/C3A+Cell+Functions+in+a+Microfluidic+Biochip.">Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).</li><li>Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+functional+liver+tissue:+three-dimensional+coculture+of+primary+hepatocytes+and+stellate+cells.">Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells.</a> Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).</li><li>Powers, M. J., Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfabricated+Array+Bioreactor+for+Perfused+3D+Liver+Culture.">A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).</li></ol>

Uwe Marx makalede kullanılan Çoklu Organ Chip platformu üreten ve pazarlayan dokusu üzerinde GmbH şirketinin CEO&#39;su. Bu yayın Corning Inc. tarafından verilen bir ödül tarafından finanse edildi

Burada anlatılan MOK platformu uzun kültür dönemleri 10,16 üzerinde dinamik orta akış koşullarında çeşitli kökenlerden dokuları yetiştirilmesi için istikrarlı ve güçlü bir araç temsil eder. Bu örnekte, bir platform birincil hücreler (HDMEC), bir hücre hattından elde edilen doku eşlenik (karaciğer agregalar), bir doku biyopsisi ile daha önce zikredilen bir birlikte-kültür yetiştirmek için kullanıldı. MOK kombine orta devredeki kadar 28 gün süreyle üç-doku kokültürü sürdürmek başardı. Yazarların bilgimize göre, bu biyopsiler, primer hücreler ve hücre çizgileri dahil olmak üzere bir çok doku kokültürünün dört hafta boyunca gerçekleştirilmiştir ilk kez. Mikroakışkan sistemlerinin başlıca sakıncalarından biri, akışkan devresinin yüzey malzemesine yapışma küçük moleküllerin eğilimidir. Hacim oranında yüzey mikroakışkan sistemlerinde, özellikle de yüksek olduğu için, bu etki daha da belirgin hale gelir 17 </s&gt; kadar. Burada tanıtılan kanal sabit HDMEC kapsamı, MOK&#39;ye moleküllerin yapışmasını önleyen, biyolojik bir bariyer olarak hareket edebilir. Bundan başka, kan pıhtılaşmasının önlenmesi, tam kan dolaşımı için bir hemocompatible kabı olarak hizmet edebilir. Organ eşdeğer tam bir vaskülarizasyon henüz elde edilmemiştir Ancak, orta ikamesi olarak tam kan kullanımı mümkün değildir. In vitro -generated dokuların damarlanmaya çalışmalarını Mevcut umut verici ve ileri çalışmalar 18,19 yolunu yönlendirir. Bu hepatositler in vitro statik iki-boyutlu kültür koşulları altında 20 zamanla karaciğer-özel işlevlerini kaybetme eğilimindedir ki iyi bilinmektedir. Belirli bir ilacın metabolizması üzerinde çalışılacak olan bu tür sitokrom P450 aile olarak metabolize edici enzimlerin, özel bir önem taşımaktadır. Sitokrom P450 3A4, birçok ksenobiyotiklerin biyotransformasyon ile ilişkili bir enzim, ve sitokrom P450 7A warada tutarak 14 gün boyunca karaciğerde eksprese edildiği zaman, içinde safra asidi sentezinde MOC kültürlenmiş agrega yer almaktadır. Bu ilaç metabolizma çalışmaları sağlayan, metabolik açıdan aktif bir fenotip koruma gösterir. Statik kültürleri ile karşılaştırıldığında MOC agregaların yüksek albümin üretim oranı yeterli kültür koşulları için ek bir göstergesidir. 23 Bununla birlikte, değerler birincil insan hepatosit kültürlerinde 24 olanlar ulaşamadı - Bu çalışma sırasında gözlenen albümin üretim oranları 21 HepG2 hücreleri de dahil olmak üzere mikroakışkan cips elde daha önce bildirilen değerlerden daha karşılaştırılabilir veya daha yüksek idi. Ayrıca, MOC sistemi, geçici düzeninde, safra ayrı ayrı tutulması için izin vermez. MRP-2 boyama ile gösterildiği gibi toplam polarize ve oluşan safra Kanalikülleri-benzeri yapılarda hücreler. Ancak, bu Kanalikülleri safra toplama bir teknik kanala bağlı değildi. Bu fizyolojik olmayan karışımıKan bölmesi ile safra ing sisteminin gelecekteki yeniden tasarımı ele alınacak vardır. Akış özelliklerinin ayarlanması özellikle karaciğer gibi kesme stresine karşı hassas dokular, söz konusu olduğunda, çok önemli 25 taşımaktadır. doku tarafından algılanan kesme stresi miktarı iki şekilde değiştirilebilir: İlk olarak, pompa membranlar doğru itmek için kullanılan hava basıncı düşürülebilir, sistemdeki en yüksek kesilme baskısı değerleri düşer. İkinci olarak, doku, hücre dışı matris katman içine gömülü ya da Transwell kültür ekleri kültürlenmiştir edilebilir. İkinci bir gözenekli membran ile altta yatan akım dokuları kalkan. Bu ayarlamalar MOK deney başlamadan önce her organ eşdeğer bireysel bazda yapılması gerekir. 144 atım yüksek, ama yine de fizyolojik, kalp aktivitesi karşılık örneğin 2.4 Hz&#39;lik bir pulsatil operasyonu, at / dak insanlarda, kayma gerilmesi ölçülenmikrovasküler devrenin kanal, yaklaşık 25 din / cm 2 ulaşır. Bu kanallar bir endotelizas- içeren deneyler için, bu nedenle, iyi uygulanabilir mikrovasküler ölçek yüksek ucunda bir fizyolojik kesme direncine karşılık gelir ve bir. Sunulan MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni iki organı bölmeleri bağlayan tek bir medya devresi oluşur Ancak, bir pompalama hızı ve kayma gerilmesi oranı tüm sistem için seçilecek olan. Bu nedenle, her bir organın ihtiyaçlarına akış karakteristiklerinin tam bir ayarı, her zaman mümkün değildir. Ayrıca, bakım ortak ortama hücreleri ayarlayarak alınacak etti. In vitro hücre kültürü için standart olarak hücreler, bir araya getirilen ortam devresinde MOC geliştirilmiştir, bu nedenle hiç bir hücre kültür ortamı, her bir doku modeli için de kullanılabilir. Minimal kombine medya formülasyonu önceden ve t tanımlanması gerekirO hücreleri bu yeni ortama adım adım ayarlanması gerekir. Iki gün için yeni ortama eski% 80 /% 20 bir ayarlama yöntemi, daha sonra% 50 /% 50% 20 /% 80 oranında, ardından ve tam değişimi her zaman elinde kültürlerin makul hücre canlılığı ve fonksiyonelliği yol açtı. MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni kadar üç dokuların kokültürü izin verir. Insan vücudunun en azından en önemli on organların bir kokültürünün homeostazını ulaşmak için gereklidir. Bu nedenle, sunulan sistem, belirli doku doku etkileşimleri, ancak bir maddeye gerçek sistemik yanıt tahmin etmek mümkün. Daha fazla Organ boşlukları dahil etmek MOC bir başka gelişme öngörülmektedir. Dahası sistemin çalışmaya geçerlilik referans bileşikler bir dizi kullanılarak gösterilebilir etmektir. Tercihen, (örneğin, troglitazon gibi) klinik deneyler sırasında başarısız olan bileşikler MOC kendi performansı için test edilecektir. Oysa, bu tür karmaşık sistemlerin bir gerçek doğrulama hala b engellemektediry Bu ve benzeri sistemlerin toksikolojik performansı hakkında daha fazla veri toplama fonksiyonel değerlendirme için biyomarkerları ve bitiş noktaları ile ilgili standardizasyon eksikliği, onların güvenilirliğini ve uygulama alanını genişletecek.

Ilaç gelişimi için mevcut tek tabaka veya süspansiyon hücre kültürü deneyleri, insan hücre mikro-taklit etmek ve bu nedenle, hızlı bir farklılaşmanın giderilmesi ve primer insan hücre kültürleri içinde fonksiyon kaybına yol başarısız kalmaktadır. Yüksek fizyolojik alaka ile Doku modelleri klinik çalışmalarda bunları kabul önce bileşiklerin etkinliğini ve güvenilirliğini tahmin etmek gereklidir. Son zamanlarda, in vitro hücre kültürü teknikleri standart in vivo doku mikroçevresinin taklit amaçlayan, üç-boyutlu, çok-hücreli modellerine doğru iki boyutlu tek tabaka kültürlerinden gelişmiştir. Bu sistemler zaten bileşiklerin 1,2 eylem tarzının daha doğru tahmin yolunda önemli gelişmeler göstermiştir. Bundan başka, hücrelerin yüksek özel ihtiyaçları için, in vitro kültür koşulları adapte özellikle tercih edilir. In vitro koşullarda altında standart, önemli cul çeşitligenellikle hücreleri üzerinde etki gibi besin ve oksijen beslemesi, biriken ürünlerinin ayrılması, ve mekanik bir güç olarak Ture parametreleri, bir çok durumda iyice kontrol edilemez. Birçok organ maddeler ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu fizyolojik ilgili gradyanlarını sahip. Ancak, bu son derece düzenlenir ve optimize edilmiş koşullar son derece istikrarsız ortama açan ve hücresel gelişimini 3 sınırlayıcı, in vitro koşullarda dokuların etrafında kontrol edilemeyen difüzyon geçişlerini açık muhalefet vardır. Böylece, istikrarlı ve in vitro koşullarda özellikle daha ölçülebilir uzun süre boyunca canlı ve farklılaşmış hücrelerin tutmak için gereklidir. Orta bileşenler düzenli kaldırılır ve ikame edilmiş perfüze sistemler, genellikle dokuların doğrudan çevreleyen ilgili statik kültürler daha karakterize ve kontrol edilebilir. Statik şartlar, hücre sekresyon difüzyon geçişlerini ve kültür ortamı besin altındakültür hücreleri 3 çevreleyen olabilir. Dokuların etrafında Tanıtımı iyi karakterize orta akım hızları hücre salgıları perfüzyon yoluyla zengin ortamla karıştırmak için izin verir. Bu istikrarlı hücresel fenotip sağlanması ve bütün tahlil süresi 4 boyunca enzim ifade metabolize, tanımlanan hücresel mikroçevrelerde üretilmesini sağlar. Çoklu organ çip (MOK) son gelişmeler sistemleri test sırasında gerekli maddenin azaltılmış miktarda açan, etrafında mikro biyoreaktörlerin küçük, orta ve hücre kütlesi gereksinimleri ile dokulara mühendislik kontrollü orta akış faydalarını birleştirir tabanlı. Doku kültürü için çok sayıda mikro-akışkan sistemler şu ana kadar 5,6 tarif edilmiştir. Bu sistemler içinde Doku-to-akışkan oranları fizyolojik ilgili hücresel karışma taklit bir özellikle önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, bu tür dış pompa ve rezervuar medya kullanımı gibi teknik sınırlamalar için, inciÇoğu sistemde e genel dolaşan medya hacmi doku hacimleri ile karşılaştırıldığında çok büyük. Shuler ark. grup hücre kültürü bölmeleri içinde ve in vivo ilgili doku-to-sıvı oranları 7,8 maddelerin uygun ikamet sürelerini sağlayan bir sistem geliştirmek için ilk idi. Bu aynı zamanda &quot;diğer dokular&quot; bölme temsil eden 96 oyuklu plakaya aşağı doğru, dış hazne ölçeklendirme ile elde edilmiştir. Bizim MOK platformu içinde dolaşan medya sesini en aza indirmek için, harici medya devreler için ihtiyacı ortadan kaldırarak, peristaltik on-chip mikropompayı entegre. Bu mikropompa medya akım hızları ve kayma gerilmesi oranları 9 seçilebilir sayıda sistemi çalıştırmak mümkün. 500 um genişliğinde ve 100 um yüksekliği bir mikroakışkan kanal sistemi, her bir 96-çukurlu plaka tek bir kuyunun boyutu olan iki standart doku kültürü boşluk birbirlerine bağlar. Endüstri standardı plaka boyutları bağlılıks transwell formatında üretilen mevcut doku modelleri entegrasyonunu sağlar. Ayrıca, Transwell hücre kültürü ekler dikey konumu sadece doğrudan sıvı akışına maruz olmayan doku modelleri ekimi sağlayan, ayarlanabilir, ama aynı zamanda yukarı kaldırdı ve altta yatan akım korumalı olabilir. Benzer şekilde, hava-sıvı arayüz kültürleri bu sistem ile kullanılmak için uygun bulunmaktadır. MOC platformu bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka 2 mm yüksekliğinde ve sürekli sıvı-geçirmez mikroakışkan devre oluşturmak üzere düşük basınçlı bir plazma oksidasyonu ile bağlandıkları 75 x 25 mm2 bir ayak izi, bir cam mikroskop lamı ile imal edilir. İlgili kanalları ve hücre kültürü bölmeleri içeren PDMS katmanı standart yumuşak litografi ve çoğaltma 9 kalıp üretilir. Bu çalışma esnasında kullanılan MOC mikrofluidik tasarım, her iki hücre c tutarak, çip başına iki ayrı mikroakışkan devrelerin oluşuyordu100 um yüksek bir kanal sistemi ile birbirine ulture bölmeleri. Bu bir çoklu organ çip kullanan iki ayrı iki doku cocultures performansını izin. Pompa frekansları 40 ul / dk arasında orta akış oranlarını elde etmek üzere ayarlandı. Bu iki doku MOC tasarımı fizyolojik akış koşullarında kombine medya devresinde olsa, ayrı kültür alanlarda bir karaciğer sfero ve cilt punch biyopsi kokültürü yeteneği sağladı. Homojen sferoidler oluşturmak üzere 1: Ayrılmış HepaRG hücreleri 24 oranında insan hepatik yıldız şeklinde hücreler (HHSteC) ile bir araya toplanır edildi. Olsa bile, hepatosit yaklaşık iki kat sayısı, in vivo duruma göre kullanıldı, önceki deneylerde 10 de görüldüğü gibi, bu oran, en uygun olduğu bulunmuştur. Böylece deri topik madde maruz kalmasını sağlayarak, bir Transwell hücre kültür kabı içinde bir hava-sıvı ara yüzeyinde yetiştirildi. Bu doku modelleri 28 gün boyunca birlikte yetiştirilmiş edildiMOC olarak ays bu sistemin kapsamlılığını göstermek için. Ayrıca, cips mikroakışkan kanal devresi tamamen daha yakın damar sistemini simüle etmek için, insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) ile kaplandı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HepaRG cells</td>
			<td style="width:163px;">Biopredic International</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HHSteC</td>
			<td style="width:163px;">ScienCell Research Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr height="171">
			<td height="171" style="height:171px;width:216px;">HepaRG Medium</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">William&#39;s Medium E&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FCS&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 U/ml penicillin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 &#181;g/ml streptomycin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/ml human insulin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2 mM L-glutamine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HDMEC Medium</td>
			<td style="width:163px;">PromoCell</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Biowest</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsininhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MAXYMum Recovery Tips</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1000 &#181;l Pipet Tips Wide Bore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:163px;">3D Biomatrix</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Tissue culture flasks</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-low attachment plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transwell cell culture inserts</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well unit,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deep well plates</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:163px;">Stusche</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass microscope slide</td>
			<td style="width:163px;">Menzel</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>footprint of 75 x 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon rubber additive</td>
			<td style="width:163px;">Wacker Chemie</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Wacker Primer G790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes for air pressure</td>
			<td style="width:163px;">SMC Pneumatik GmbH</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Polyurethan-Schlauch, metrisch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alumin ELISA</td>
			<td style="width:163px;">Bethyl Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase assay</td>
			<td style="width:163px;">Stanbio Laboratory</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>LDH Liqui-UV kit</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Alexa Fluor 594 acetylated LDL</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Standart in vitro doku kültürleri dokulara oksijen ve besin kaynağı difüzyon sınırlama, statik koşullar altında gerçekleştirilir. Gelişmiş tedarik özelliklerini gösteren akışkan sistemler, genellikle doku oranları olmayan fizyolojik yüksek orta sahip, onların büyük orta gereksinimleri tarafından engellenmektedir. Böylece, metabolitler seyreltilmiş ve hücreler çevrelerini kondisyon mümkün değildir. Bu çalışmada sunulan MOC mikroakışkan kanal sistemi, iki ayrı doku kültürü bölmeleri, bir standart 96 oyuklu plaka tek bir oyuk birer çift bağlar. sistem ve çip üzerinde pompanın entegrasyon küçük ölçekli sistemi sadece 200-800 ul ortam hacimleri de çalışmasına izin verir. 1-31: Bu 8 doku oranı toplam sistemik ortama karşılık gelen 1, sırasıyla, (yaklaşık 26 ul toplam doku hacmine sahip), karaciğer ve deri dokusu alt kültürler için. Bir adam 7 ağırlığında toplam ekstra-hücresel sıvı hacmiIntercapillary sıvı hacmi 1 doku oranında fizyolojik hücre dışı sıvı yol açan, 5.1 L, ki bunun 3 kg, 14.6 L: 4. Bu nedenle, MOK bütün dolaşım sistemi medyanın miktarı fizyolojik duruma göre hala daha büyüktür; ve henüz bu çoklu organ sistemleri 5 için bugüne kadar bildirilen doku oranı en küçük medyayı temsil eder. Endüstri standardı doku kültürü formatları korunur gibi, araştırmacılar ortak bir sıvı akışı içinde mevcut ve zaten valide statik doku modelleri birleştirmek mümkün. 1 olası MOK tek doku veya çok doku cocultures deneysel bir set-up şematik göstermektedir. Birincil doku biyopsisi ve in vitro olarak hücre kuşakları ya da birincil hücreler doku benzeri 96 gözlü hücre kültür ekleri kullanılarak ya da ekili ya da doku kültürü bölmelere doğrudan yerleştirilmesiyle edilebilir -generated. Hücre kültürü bölmeleri birbirine kanal sistemi sadece 100 μ olduğu gibim yüksekliğinde, bu boyutları aşan doku kültürü benzerleri bölmeleri içinde muhafaza edilecektir. Primer HDMECs ile MOK devresinin endotelizasyonunun biyolojik damar yapısını sağlayarak ileriye daha fizyolojik kültür koşulları bir adım daha sağlar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. MOK kültürlerin şematik gösterimi Doku benzerleri MOC inoküle ve dinamik koşullar altında tek kültürleri veya cocultures olarak yetiştirilen, standart in vitro koşullarda hazırlanır. Günlük medya örnekleri ve uç nokta analizleri yapılmaktadır. Pompayı sürücü Hava basıncı yukarıdan MOC bağlı üç mavi tüpler aracılığıyla uygulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, endotelizasyon protokol izlenerek, mikroakışkan kanal devresinin bir konfluent HDMEC kapsamı, dinamik kültürü dört gün içinde elde edilir. Hücreler, hali hazırda MOC kanal duvarlarına bağlı konfluent tek tabaka oluşturmak ve kesme boyunca uzunlamasına stres (Şekil 2B). Daha önce rapor edildiği gibi, 9 Ayrıca hücreler, kanal tüm çevresini kaplar. Endotel morfoloji daha başka bir değişiklik kültür sonuna kadar ekimi dört gün sonra gözlenmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> Şekil 2:. Endotelize MOC kanal insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) mikroakışkan devresinde bir konfluent tek tabaka oluşturulmuştur. Hücreler MOK kültür 23 gün sonra asetillenmiş LDL ile boyandı. (A), bütün m,icrovascular devre kesme stresi boyunca uzatılmış hücreleri ve (B) &#39;hücreleri ile kaplandı. Ölçek çubukları: (A), 1.000 mm ve (B) = 100 um. Bir başka deneyde, tutarlı bir disk şeklinde karaciğer hücre sferoidler Bu model sistemi, daha önce, ilaç metabolizması için uygun olarak bildirildiği gibi, asılı damla kültür iki gün boyunca HepaRG ve HHSteC oluşan 11 çalışmalar - 13&#39;de belirtilmiştir. Gösterim amacıyla, her bir MOC devrenin bir doku kültürü bölmesi 96 oyuklu hücre kültürü ekler 20 küremsiler ile tohumlanmış ve dokuların olmayan endotelize MOKSL kullanarak dinamik koşullar altında 14 gün boyunca yetiştirilmiştir. Agrega veya birincil madde miktarı, herhangi bir sayıda, doğrudan bölmeler içine ya da hücre kültürü kalıpları kullanılarak ya da entegre edilebilir. MOC gelen alma sonrası sferoitlerin immunofluorescent boyama li için güçlü, homojen ifadesini gösterirver tipik sitokeratin 18/08 ve faz I enzimleri sitokrom P450 3A4 ve 7A1 metabolize (Şekil 3A ve 3B). Kanalikülde taşıyıcı çoklu ilaç direnci proteini 2 boyanması (MRP-2) bir polarize fenotip ve ilkel safra Kanalikülleri benzeri ağların varlığını (Şekil 3C) saptandı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> Şekil 3 :. MOC 14 gün kültive MOC. Karaciğer agrega insan yapay karaciğer mikro-dokuların yetiştirme (A), sitokeratin 18/08 (kırmızı) ve (B), sitokrom P450 3A4 (kırmızı) ve 7A1 (yeşil) için boyandı. Kanalikülde taşıyıcı MRP-2 (yeşil) (C) Anlatım, mavi nükleer boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron. Albumin üretim karaciğer doku kültürlerinin temel bir ön koşuldur gibi, arı vardırn MOC karaciğer-tipik aktivitesini izlemek için seçti. Albümin üretimi için günlük ortam numuneleri analiz statik kültürleri (Şekil 4) ve literatürde 11&#39;de bildirilen değerlerle karşılaştırıldığında MOC kültürlerde üretim hızında önemli bir artış göstermektedir. albümin sentezi oranındaki artışın MOC kültürlerde artan oksijen ve besin kaynağına bağlı olabilir. Bu nedenle, MOC, albümin üretimi gibi karaciğer tipik bir hareketi, arttırıcı, metabolik açıdan aktif bir halde 14 günlük bir kültür dönemi boyunca karaciğer agrega sürdürmek edebilmektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> Şekil 4: MOC Ondört gün karaciğer sfero performansı MOC ve statik kültüründe karaciğer tek doku kültürleri Albümin üretim.. Veriler ortalama ± SEM (n = 4). Che ve Subsystemic tekrarlanan doz toksisite testleriOECD rehberinin tarafından tanımlanan hayvanlarda micals ve kozmetik hayır, maruz kalma 21-28 gün gerektirir. 410 &quot;Doz Dermal toksisitesi Tekrarlanan: 21/28 günlük Çalışması.&quot; Uzun süreli cilt karaciğer cocultures düzenleyici gereksinimlere başa kadar 28 gün süreyle burada örneklenmiştir. Bir hava-sıvı arayüzü 96-kuyu hücre kültürü ekler cilt biyopsi yetiştirilmesi daha sonra dermal madde maruziyeti sağlanır. kokültürünün deney, bir araya getirilen ortam devresinde üç doku kokültürünün uygulanabilir ve 28 gün boyunca metabolik olarak aktif tutulabilir olmadığını kanıtlamak için endotelize Kendi yaptığım şeyler için örnek olarak gerçekleştirilir. Ortam üst sıvı kısımları içinde bir LDH aktivite analizi bundan sonra da yaklaşık 80 U / l (Şekil 5) sabit kaldı kültürün ilk sekiz gün boyunca giderek azalan seviyesi saptandı. Bu, daha sonra zaman noktalarında sistemde yapay ama istikrarlı bir doku ciro gösterir. Karaciğer single üç-doku kokültürü karşılaştırılması-Doku ve karaciğer-endotel kokültürünün deneyleri, bir ölçüde azalmış LDH düzeyi, özellikle deri dahil değil kültürlerde ilk günlerinde, bulunamadı. Deri, tek doku MOC kültürleri ortaya yüksek LDH aktivite ilk süre içinde hücre ölümü (veriler gösterilmemiştir), deri kültür bölmesinde, öncelikle oluştu. Bu cilt delme sonucu biyopsi çevredeki yaralı bölgeye bağlı olabilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> Şekil 5:. Endotelize MOC içinde endotelize Kendi yaptığım şeyler (MOK Li-Va) ve karaciğer-cilt cocultures karaciğer tek doku kültürlerinde (MOK Li), karaciğer kültürlerin medya Süpernatantları MOK LDH aktivitesinde Onbeş gün doku performansı (MOC Li -Va-Sk). Veriler ortalama ± SEM (n = 4). 28-günlük kültür döneminde, karaciğer sferoidler MOC a altına yapıştırılırnd hücreler komşu sferoitler arasında bir bağlantı oluşturan çok katmanlı, büyümüştür. Bu doku işlevini engel yoktu. Bağışıklık fluorışıması yoluyla Son nokta analizi sitokrom P450 3A4 boyama (Şekil 6A) ile gösterildiği gibi, karaciğer sferoidler MOC ko-kültürü 28 gün sonra hala metabolik olarak aktif olduğunu göstermektedir. Vimentin boyama (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi HHSteC, bütün karaciğer eşdeğer dağıtıldı. Vimentin boyama yoğunluğunda bir artış hücrelerin sferoitlerin üzerinden büyümüş olan alanlarda gözlenebilir. Von Willebrand faktörü (vWF) için boyama endotel hücreleri dokuya derinlemesine nüfuz etmediğini gösterdi, ancak dış hepatositler (Şekil 6C) ile doğrudan hücre-hücre teması vardı. Statik kontrol boyama ELEVAT gösterdi iken deri biyopsisi İmmünohistokimyası boyama, tenaskin C ve bazal membran (Şekil 6D) kollajen IV bir ifade gösterditenaskin C (Şekil 6E), ed seviyeleri. Tenascin Cı, yara iyileşmesi, iltihap süreçleri ve fibroz sırasında yukarı regüle ettiği gösterilmiştir dinamik kültürler 14,15 fibrotik statik süreçleri ancak neden göstermektedir. Stabil hücre canlılığı ve MOC olarak 28 günlük bir birlikte-kültür sonrası dokuların işlevi sistem ortak bir ortam devre üçe kadar dokular bir arada tutmak mümkün olduğunu kanıtlamaktadır. Birincil hücreler, hem de doku modelleri ve biyopsi MOC sisteminde aynı anda yetiştirilebilir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> Şekil 6:. Çoklu doku kültürleri Performans 28 gün boyunca karaciğer benzerleri ve deri biyopsileri bir endotelize MOC ve hücre fonksiyonu kültive (A) Birinci aşama, immün ile gösterilmiştir bir sitokrom P450 enzimleri3A4 karaciğer dokusunda (kırmızı), (B) vimentin (kırmızı), (C) sitokeratin 8/18 (kırmızı) ve vWF (yeşil). Statik koşullar altında MOC veya (E) &#39;de 28 gün (D) birlikte yetiştirilmiş deri biyopsileri tenaskin c (kırmızı) ve kolajen IV (yeşil), mavi nükleer boyama için boyandı. MOC kültürü 28 gün sonra, deri (F) H &amp; E boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron.

Watch this Scientific Journal Video about The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture at JoVE.com

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture | Bioengineering | Video

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

the-multi-organ-chip-microfluidic-platform-for-long-term-multi-tissue

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

28.4K Görüntüleme.  Technische Universität Berlin. Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Video: The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...