העבודה כבר במימון המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ומחקר, GO-יו גרנט מס &#39;0,315,569.

<ol>
	<li>Kelm, J. M., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+tissue+engineering+using+gravity-enforced+cell+assembly.">Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly.</a> Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).</li><li>Marx, U., Walles, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+Developments:+A+Translational+Cutting-edge+Alternative+to+Systemic+Safety+Assessment+and+Efficiency+Evaluation+of+Substances+in+Laboratory+Animals+and+Man.">Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+HepG2/C3A+cell+cultures+in+a+microfluidic+bioreactor.">Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).</li><li>Dash, A., Inman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+in+the+evaluation+of+drug+safety.">Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety.</a> Expert opinion on drug metabolism &amp; toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing--organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).</li><li>Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+physiological+biomimicry:+organs-on-chips.">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).</li><li>Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+fabrication+of+three-chamber+microscale+cell+culture+analog+devices+with+integrated+dissolved+oxygen+sensors.">The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors.</a> Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).</li><li>Tatosian, D. a., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+evaluation+of+drug+mixtures+for+potential+efficacy+in+treating+multidrug+resistant+cancers.">A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).</li><li>Schimek, K., Busek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).</li><li>Wagner, I., Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+multi-organ-chip+for+long-term+cultivation+and+substance+testing+proven+by+3D+human+liver+and+skin+tissue+co-culture.">A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).</li><li>Vieira, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HepaRG+human+hepatic+cell+line+utility+as+a+surrogate+for+primary+human+hepatocytes+in+drug+metabolism+assessment+in+vitro.">HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro.</a> Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).</li><li>Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+of+hepatocytes+and+stellate+cells.">Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells.</a> Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).</li><li>Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+HepaRG+model+as+an+attractive+tool+for+toxicity+testing.">Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing.</a> Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).</li><li>Chiquet-Ehrismann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascins.">Tenascins.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).</li><li>Sidgwick, G. P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules+implicated+in+hypertrophic+and+keloid+scarring.">Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).</li><li>Ata&#231;, B., Wagner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Wu, M. -. H., Huang, S., Lee, G. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models+A+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li><li>Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2012).</li><li>Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+function+and+extracellular+matrix+geometry:+long-term+culture+in+a+sandwich+configuration.">Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration.</a> FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).</li><li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+PDMS+(polydimethylsiloxane)+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes.">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li><li>Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+3-dimensional+cell+culture+and+cell-based+assays.">A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays.</a> Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).</li><li>Prot, J. -. M., Aninat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+HepG2/C3A+Cell+Functions+in+a+Microfluidic+Biochip.">Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).</li><li>Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+functional+liver+tissue:+three-dimensional+coculture+of+primary+hepatocytes+and+stellate+cells.">Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells.</a> Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).</li><li>Powers, M. J., Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfabricated+Array+Bioreactor+for+Perfused+3D+Liver+Culture.">A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).</li></ol>

Uwe מרקס הוא מנכ&quot;ל TissUse GmbH המייצר ומשווקת פלטפורמת השבבים Multi-איברים המשמשת במאמר. פרסום זה מומן על ידי הפרס הוענק על ידי קורנינג Inc.

פלטפורמת MOC המתוארת כאן מייצגת כלי יציב וחזק לטיפוח רקמות של מקורות שונים בתנאי זרימה בינוניים דינמיים על פני תקופות ממושכות תרבות 10,16. בדוגמא זו, הפלטפורמה שימשה לטפח תאים ראשוניים (HDMEC), שווה רקמה שנוצרו משורת תאים (מצרפי כבד), וcoculture של האמור עם ביופסית רקמה. MOC היה מסוגל לקיים את coculture שלוש-הרקמה עד 28 ימים במעגל בינוני משולב. למיטב ידיעתם ​​של המחברים, זו הפעם הראשונה coculture רב-רקמה כולל ביופסיות, תאים ראשוניים ושורות תאים שבוצעה במשך ארבעה שבועות. אחד החסרונות העיקריים של מערכות מייקרו-נוזליות הוא הזיקה של מולקולות קטנות לדבוק בחומר של המעגלים נוזליים על פני השטח. כמו פני השטח יחס נפח גבוה במיוחד במערכות microfluidic, אפקט זה הופך להיות אפילו יותר בולט 17 </sעד&gt;. הכיסוי היציב HDMEC של הערוצים, הציג כאן, עלול לפעול כמחסום ביולוגי מניעת ההדבקה של מולקולות לMOC. יתר על כן, זה יכול לשמש ככלי hemocompatible לזרימת דם שלם, מניעת קרישת דם. עם זאת, השימוש בכל הדם כחילוף בינוני הוא לא ריאלי ככלי דם מלאים שווה האיבר טרם הושגו. עבודה קיימת בכלי הדם במבחנה של רקמות -generated הוא מבטיח ומנחה את הדרך למחקרים נוספים 18,19. זה ידוע שhepatocytes נוטה לאבד תפקודים הכבד הספציפית שלהם לאורך זמן בתנאי תרבות דו-ממדי סטטי במבחנה 20. אנזימי חילוף חומרים, כגון משפחת ציטוכרום P450, הם בעלי חשיבות מיוחדת אם חילוף החומרים של תרופה מסוימת הוא להיחקר. ציטוכרום P450 3A4, אנזים הקשורים לbiotransformation של xenobiotics רב, ו7A ציטוכרום P450, which מעורב בסינתזה של חומצות מרה, באו לידי ביטוי בכבד אגרגטים בתרבית MOC מעל 14 ימים. זה מצביע על השימור של פנוטיפ מטבולית פעיל, המאפשר ללימודי חילוף חומרים סמים. העלייה בשיעור אלבומין הייצור של אגרגטים בMOC בהשוואה לתרבויות סטטי הוא אינדיקציה נוספת לתנאי תרבות נאותים. שיעורי ייצור אלבומין נצפו במהלך מחקר זה היו דומים או אף גבוהים יותר מערכים שדווחו בעבר שהושגו על ידי שבבי microfluidic כוללים תאי HepG2 21 - 23, לעומת זאת, ערכים לא הגיעו אלה של תרבויות hepatocyte אנושיות ראשוניות 24. יתר על כן, מערכת MOC, בפריסה הזמנית שלה, אינה מאפשרת הפרדה נפרדת של מרה. תאים במבנים כמו canaliculi מצטברים מקוטבים ויצרו מרה, כפי שמוצג על ידי MRP-2 מכתים. עם זאת, אפיקים, נקבות אלה לא היו מחוברים לערוץ טכני איסוף המרה. תערובת שאינה פיזיולוגית זהing של המרה עם תא הדם יש לטפל בתכנון מחדש עתידי של המערכת. ההתאמה של מאפייני זרימה היא בעל חשיבות גבוהה 25, במיוחד בכל הנוגע לרקמות רגישות למאמץ גזירה, כגון הכבד. הסכום של מאמץ גזירה נתפס על ידי הרקמה יכול להיות שונה בשתי דרכים: ראשית, ניתן להוריד את לחץ האוויר בשימוש כדי לדחוף את הקרומים של המשאבה, ירידת ערכי לחץ גזירת שיא במערכת. שנית, יכולות להיות מוטבעות ברקמות שכבות מטריצה ​​תאית או מתורבת בתרבות מוסיף transwell. האחרונים להגן על הרקמות מנוכחיות הבסיסי עם קרום נקבובי. התאמות אלו צריכים להתבצע על בסיס אישי לכל איבר מקביל לפני תחילת ניסוי MOC. במבצע pulsatile של 2.4 הרץ, למשל, אשר תואם את פעילות של 144 פעימות גבוהה, אבל עדיין פיזיולוגית, לב / min בבני אדם, מאמץ הגזירה נמדד בערוצים של מעגל כלי הדם מגיעים לכ 25 DYN / 2 סנטימטר. זה מתאים למאמץ גזירה פיסיולוגי בקצה הגבוה של הסקאלה בנימי דם, והוא, לכן, גם ישים עבור ניסויים כוללים endothelialization של הערוצים. עם זאת, כפי שפריסת microfluidic הנוכחית של מערכת MOC הציגה מורכבת רק אחד במעגל תקשורת מחבר בין שני תאי האיבר, שיעור לחץ מהירות שאיבה וגזירה אחד לא להיבחר למערכת כולה. לכן, התאמה של מאפייני זרימה לצרכיו של כל איבר יחיד מדויקת היא לא תמיד אפשרית. יתר על כן, טיפול שיש לנקוט בהתאמת התאים למדיום הנפוץ. תאים מעובדים בMOC במעגל תקשורת משולב, ולכן, אין תקשורת ותרבות תא בודדת יכולה לשמש לכל דגם רקמה, כהיא סטנדרטי עבור תרבות תאים במבחנה. ניסוח מדיה משולב מינימאלי צריך להיות מוגדר מראש ולאהוא תאים צריכים להיות מותאמים בשלבים לתקשורת חדשה זה. תהליך ניכוי של 80% / 20% ישנים למדיה החדשים במשך יומיים, ולאחר מכן 50% / 50% ואחריו 20% / 80%, ותמורה מלאה תמיד הובילו לכדאיות סבירה תא ופונקציונליות של תרבויות בידיים שלנו. פריסת microfluidic הנוכחית של מערכת MOC מאפשרת coculture של עד שלוש רקמות. יש צורך coculture של לפחות עשרה איברים החשובים ביותר בגוף האדם כדי להגיע להומאוסטזיס. לכן, המערכת שהוצגה היא מסוגלת לחזות אינטראקציות ספציפיות רקמות-רקמה, אך לא התגובה המערכתית האמיתית לחומר. פיתוח נוסף של משרד התקשורת לכוללים יותר חללי איבר שחזה. יתר על כן, את תוקפו של המערכת הוא להיות מוצג באמצעות סדרה של תרכובות התייחסות. רצוי, תרכובות שנכשלו בניסויים קליניים (כגון Troglitazone) הן להיבדק לביצועים שלהם במשרד התקשורת. ואילו, אימות נכונה של מערכות מורכבות כגון עדיין פגעה בy חוסר סטנדרטיזציה לגבי סמנים ביולוגיים ונקודתי קצה להערכה תפקודית, איסוף נתונים נוספים על הביצועים טוקסיקולוגית של מערכות זה ודומה ירחיב האמינות והאזור של יישום שלהם.

מבחני תרבות התא הנוכחיים monolayer או השעיה לפיתוח תרופות לא מצליחין לחקות את microenvironment הסלולרי האנושי, ולכן, להוביל לdedifferentiation ואובדן התפקוד בתרביות תאים אנושיים ראשוניות מהירים. דגמי רקמה עם הרלוונטיות פיסיולוגיות גבוהות יותר יש צורך לחזות את היעילות ובטיחות של תרכובות לפני שהודית להם בניסויים קליניים. לאחרונה, סטנדרטי בטכניקות תרבית תאים במבחנה התפתח מתרבויות monolayer דו-ממדיות לדגמים רב-תאיים תלת-ממדיים, במטרה לחקות את in vivo מייקרו-סביבת הרקמות. מערכות אלה כבר הראו שיפורים משמעותיים לקראת חיזוי מדויק יותר של אופן פעולה של תרכובות 1,2. יתר על כן, התאמה במבחנה תנאי התרבות לצרכי מיוחדים מאוד של תאים היא עניין מיוחד. תחת תקן בתנאי מבחנה, מגוון רחב של רחוב ללא מוצא חשובפרמטרים ture, כגון אספקת חומרי מזון וחמצן, הסרת מוצרי צבירה, וכוח מכאני הפועלים על התאים לעתים קרובות לא ניתן לשלוט באופן יסודי ברוב המקרים. איברים רבים ברשות הדרגתיים ריכוז רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של חומרים וחמצן מומס. עם זאת, תנאי פיקוח הדוקים והמותאמים אלה נמצאים באופוזיציה ברורה להדרגתיות דיפוזיה בלתי נשלטת סביב רקמות בתנאים במבחנה, שמוביל לסביבה מאוד לא יציבה והגבלת פיתוח סלולארי 3. לפיכך, יציב יותר ויותר במיוחד לכימות בתנאי מבחנה נדרשות לשמור תאי קיימא ומובחן על פני תקופות זמן ארוכות. מערכות perfused, שבו רכיבים בינוניים יוסרו באופן קבוע והוחלפו, הן לעתים קרובות טוב יותר מאופיינות לשליטה מאשר תרבויות סטטי הנוגעות ישיר המקיף את רקמות. בתנאים סטטיים, מילויים דיפוזיה של הפרשות תא וחומרים מזינים מדיום התרבותאולי מקיף את התאים בתרבית 3. מאופיינות היטב ספיקות בינוניות היכרות סביב הרקמות מאפשרות להפרשות התא לערבב עם המדיום העשיר דרך זלוף. זה מאפשר את הדור של microenvironments הסלולרית המוגדרת, הבטחת פנוטיפ סלולארי יציב וחילוף חומרי ביטוי אנזים לאורך כל משך assay 4. ההתפתחויות האחרונות ברב-איבר שבב (MOC) מבוסס מערכות לשלב את היתרונות של זרימה בינונית מבוקרת סביב מהונדסים רקמות עם הדרישות בינוניות ומסת תאים הקטנות של bioreactors microscale, שהובילו לכמות מופחתת של חומר הנדרש במהלך בדיקה. מספר מערכות microfluidic לתרבית רקמה תוארו עד כה 5,6. יחסי רקמה לנוזל בתוך מערכות אלה לשחק תפקיד מכריע במיוחד בהדמיית crosstalk הסלולרי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, בשל מגבלות טכניות, כגון השימוש במשאבות חיצוניות ומאגרי מדיה, הדואר הכוללים במחזור מדיה נפח ברוב המערכות גדול מדי בהשוואה להיקפי הרקמות. קבוצת שולר ואח &#39;. היתה הראשונה לפתח מערכת הבטחה פעמים מגורים נאותות של חומרים בתוך תאי תרבית תאים וברקמות 7,8 רלוונטי vivo לנוזל יחסים. זו הושגה על ידי מדרוג המאגר החיצוני עד לצלחת 96-היטב, מייצג גם את התא &quot;רקמות אחרות&quot;. על מנת למזער את במחזור מדיה הנפח בתוך פלטפורמת MOC שלנו, אנו משולבים micropump על שבב peristaltic, ומבטל את הצורך במעגלי תקשורת חיצוניים. micropump זה מסוגל להפעיל את המערכת במספר לבחירה של מהירויות זרימת מדיה ושיעורי מאמץ גזירה 9. מערכת ערוץ microfluidic של 500 מיקרומטר ורוחב 100 מיקרומטר גובה חיבורי שני חללי תרבית רקמה סטנדרטיים, כל אחד מהם בגודל של באר אחד של צלחת 96-היטב. דבקות בגדלים של צלחת גם תקן התעשייהs מאפשרת האינטגרציה של מודלים רקמה קיימים כבר מיוצרים בפורמט transwell. יתר על כן, המיקום האנכי של transwell מוסיף תרבית תאים הוא מתכוונן, המאפשר הטיפוח של דגמי רקמה שאינם רק נחשפו ישירות לזרימת הנוזל, אבל יכול להיות גם הרים ומוגן מפני נוכחי הבסיסית. באופן דומה, תרבויות ממשק אוויר נוזלי הן אפשריים באמצעות מערכת זו. פלטפורמת MOC היא מפוברקת משכבה polydimethylsiloxane (PDMS) 2 מ&quot;מ גבוהה ושקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם טביעת רגל של 75 x 25 מ&quot;מ 2, שמודבקים באופן קבוע על ידי חמצון פלזמה בלחץ נמוך כדי ליצור מעגל microfluidic הנוזל חזק. שכבת PDMS המכילה את הערוצים המתאימים ותאי תרבית תאים מופקת על ידי יתוגרפיה הרכה סטנדרטית והעתק דפוס 9. עיצוב microfluidic של MOC שימוש במהלך מחקר זה מורכב משני מעגלים נפרדים לכל שבב microfluidic, כל אחד מחזיק שני התא גתאי ulture מחוברים על ידי מערכת ערוץ 100 מיקרומטר גבוהה. זה אפשר את הביצועים של שני cocultures שתי רקמות בודדות באמצעות שבב רב-איבר אחד. תדרי שאיבה הותאמו ללהניב שיעורי זרימה בינוניים של 40 μl / min. עיצוב MOC שתי רקמה זו סיפק את יכולת coculture אליפטית כבד וביופסית עור במקומות תרבות נפרדות, אם כי במעגל תקשורת משולבת תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים. תאים המובחנים HepaRG קובצו יחד עם תאים אנושיים כבד stellate (HHSteC) ביחס של 24: 1 ליצירת spheroids הומוגנית. יחס זה נמצא כאופטימלי, כפי שנצפה בניסויים קודמים 10, למרות ש, כמעט פי שתיים את מספר hepatocytes שימש בהשוואה למצב בvivo. העור היה מעובד בממשק אוויר נוזלי בתוך להכניס את תרבות תא transwell, ובכך לאפשר חשיפת חומר אקטואלית. דגמי רקמה אלה cocultivated לד 28ays בMOC כדי להדגים את שלמותה של מערכת זו. יתר על כן, במעגל ערוץ microfluidic של השבבים היה מכוסה באופן מלא עם תאי כלי דם עורי אנושיים האנדותל (HDMEC) כדי לדמות את מערכת כלי הדם באופן הדוק יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HepaRG cells</td>
			<td style="width:163px;">Biopredic International</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HHSteC</td>
			<td style="width:163px;">ScienCell Research Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr height="171">
			<td height="171" style="height:171px;width:216px;">HepaRG Medium</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">William&#39;s Medium E&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FCS&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 U/ml penicillin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 &#181;g/ml streptomycin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/ml human insulin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2 mM L-glutamine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HDMEC Medium</td>
			<td style="width:163px;">PromoCell</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Biowest</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsininhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MAXYMum Recovery Tips</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1000 &#181;l Pipet Tips Wide Bore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:163px;">3D Biomatrix</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Tissue culture flasks</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-low attachment plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transwell cell culture inserts</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well unit,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deep well plates</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:163px;">Stusche</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass microscope slide</td>
			<td style="width:163px;">Menzel</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>footprint of 75 x 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon rubber additive</td>
			<td style="width:163px;">Wacker Chemie</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Wacker Primer G790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes for air pressure</td>
			<td style="width:163px;">SMC Pneumatik GmbH</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Polyurethan-Schlauch, metrisch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alumin ELISA</td>
			<td style="width:163px;">Bethyl Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase assay</td>
			<td style="width:163px;">Stanbio Laboratory</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>LDH Liqui-UV kit</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Alexa Fluor 594 acetylated LDL</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

סטנדרטי במבחנה תרביות רקמה מבוצעות בתנאים סטטיים, המגבילות את הדיפוזיה של החמצן וחומרים מזינים לרקמות האספקה. מערכות fluidic, מראים מאפייני היצע השתפרו, לעתים קרובות הקשו על ידי הדרישות בינוניות הגדולות שלהם, שיש שאינו מבחינה פיזיולוגית גבוהות בינוני ליחסי רקמה. לפיכך, המטבוליטים מדוללים ותאים אינם מסוגלים להתנות את סביבתם. MOC הוצג במחקר זה מחבר את שני תאים בתרבית רקמה נפרדים, כל אחת בגודל של באר אחד של צלחת 96-היטב סטנדרטית, על ידי מערכת ערוץ microfluidic. בקנה מידה הקטנה של המערכת והאינטגרציה של המשאבה על השבב מאפשר למערכת לפעול בהיקפי תקשורת של רק 200 ל -800 μl. זה מתאים למדיום מערכתי כולל ליחס רקמה של 8: 1 עד 31: 1, בהתאמה, לcocultures רקמת כבד ועור (יש בסך הכל נפח רקמה של כ 26 μl). חוץ-תאי הכוללת כמות הנוזלים באדם במשקל 73 קילוגרם הוא 14.6 L, על מה נפח נוזל intercapillary הוא 5.1 L, שמוביל לנוזל החוץ תאי פיסיולוגי ליחס רקמה של 1: 4. לפיכך, הסכום של תקשורת בכל מערכת הדם בMOC עדיין גדול יותר בהשוואה למצב הפיזיולוגי; ובכל זאת, הוא מייצג את התקשורת הקטנה ביותר ליחס רקמה דיווחה עד כה למערכות רב-איבר 5. כפורמטי תרבית רקמת תקן תעשייה נשמרים, חוקרים יכולים לשלב מודלים רקמת סטטי קיימים וכבר תוקף בתוך זרימת נוזל נפוצה. איור 1 מציג את סכמטי של ניסוי הגדרה של cocultures רקמה אחת MOC או רב-רקמה האפשרית. ביופסיות רקמות ראשוניות ובמבחנת -generated יכול להיות מתורבתות שווה רקמה משורות תאים או תאים ראשוניים או באמצעות תרבות מוסיף תא 96-היטב או על ידי הצבת אותם ישירות לתוך התאים בתרבית הרקמה. כמערכת הערוץ המקשרת תאי תרבית תאים היא רק 100 μמ &#39;, שווה רקמה עולה על ממדים אלה יישמרו בתוך תאי התרבות. Endothelialization של מעגל MOC עם HDMECs העיקרי מאפשר צעד נוסף קדימה לכיוון תנאי תרבות פיסיולוגיים יותר על ידי מתן מבנה כלי דם ביולוגי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1:. ייצוג סכמטי של תרבויות MOC שווי רקמות מוכנות תחת במבחנה תנאים סטנדרטיים, מחוסן לתוך MOC וטיפח כתרבויות או cocultures יחידים בתנאים דינמיים. דגימות תקשורת יומית וניתוחי נקודת סיום מבוצעים. לחץ האוויר לנהוג המשאבה מיושם באמצעות שלושה הצינורות הכחולים מחוברים לMOC מלמעלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </a&gt; בעקבות פרוטוקול endothelialization, כיסוי HDMEC מחוברות של מעגל ערוץ microfluidic מתקבל בתוך ארבעה ימים של תרבות הדינמית, כפי שמוצג באיור 2. תאים בקלות לדבוק בקירות של ערוץ MOC, ליצור monolayer ומחוברות, ולהאריך לאורך הגזירה מתח (איור 2). יתר על כן, תאים לכסות את כל ההיקף של הערוצים, כפי שדווחו בעבר 9. לא חל שינוי נוסף במורפולוגיה אנדותל נצפה לאחר ארבעה ימים של טיפוח עד סוף התרבות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> איור 2:. ערוצי MOC Endothelialized תאי כלי דם עורי אדם אנדותל (HDMEC) יצרו monolayer ומחוברות במעגל microfluidic. תאים הוכתמו LDL acetylated לאחר 23 ימים של תרבות MOC. כל מ &#39;()מעגל icrovascular היה מכוסה בתאים ותאים (B) מוארכים לאורך מאמץ הגזירה. ברים בקנה מידה: (א) 1,000 מיקרומטר ו( B) 100 מיקרומטר. בניסוי נוסף, spheroids תא העקבי בצורת דיסק כבד נוצרים מHepaRG וHHSteC במהלך שני ימים של תרבות ירידה תלויה, כמערכת מודל זה דווחה בעבר כמתאים לחילוף חומרי סמים לומד 11-13. למטרות הדגמה, תא תרבית רקמה אחת של כל מעגל MOC נזרע עם 20 spheroids בתרבות מוסיף תא 96-היטב ורקמות עובדו מעל 14 ימים בתנאים דינמיים באמצעות MOCs-endothelialized שאינו. כל מספר של אגרגטים או כמות החומר עיקרי יכול להיות משולב באופן ישיר לתאים או באמצעות מוסיף תרבית תאים. מכתים Immunofluorescent של spheroids לאחר שליפה מMOC תערוכות ביטוי חזק, אחיד לlicytokeratin ver-הטיפוסי 8/18 ושלב אני חילוף חומרים אנזימי ציטוכרום P450 3A4 ו7A1 (איור 3 א ו3B). מכתים חלבון התנגדות רב-סמים טרנספורטר canalicular 2 של (MRP-2) חשף הפנוטיפ מקוטב ואת קיומה של רשתות כמו canaliculi-מרה בסיסית (איור 3 ג). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> איור 3 :. טיפוח של מיקרו-רקמות כבד מלאכותי אנושיות במצרפי MOC. הכבד טיפחו במשך 14 ימים בMOC היו מוכתם עבור cytokeratin () 8/18 (אדום) ו- (B) 3A4 ציטוכרום P450 (אדום) ו7A1 (ירוק). ביטוי (C) של canalicular טרנספורטר MRP-2 (ירוק), מכתים גרעיני כחול. ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר. כייצור של אלבומין הוא תנאי הכרחי אחד מתרביות רקמת כבד, יש לה דבורהn נבחר כדי לעקוב אחר פעילות כבד-טיפוסית במשרד התקשורת. ניתוח דגימות תקשורת יומיות לייצור אלבומין מצביע על עלייה משמעותית בקצב ייצור בתרבויות MOC בהשוואה לתרבויות סטטי (איור 4) ולערכים שדווחו בספרות 11. העלייה בשיעור סינתזת אלבומין אפשר אולי לייחס את אספקת החמצן וחומרים מזין גדלה בתרבויות MOC. לפיכך, MOC הוא מסוגל לקיים מצרפי כבד על פני תקופה של 14 יום תרבות במדינת מטבולית פעילה, שיפור כבד-טיפוסי התנהגות, כגון ייצור אלבומין. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> איור 4: ביצועי אליפטית כבד ארבע עשרה יום בMOC ייצור אלבומין של תרביות רקמה יחידה בכבד ובמשרד התקשורת בתרבות סטטי.. הנתונים הם ממוצעי ± SEM (n = 4). לבדיקת רעילות במינון חוזרת ונשנית של Subsystemic cheMICALS וקוסמטיקה בבעלי חיים דורש 21 עד 28 ימים מיום החשיפה, כהגדרתו בהנחית OECD לא. 410 &quot;חוזרים ונשנים מנה Dermal רעילות: מחקר 21/28 יום.&quot; Cocultures עור הכבד לטווח הארוך הם שהודגם כאן לתקופה של עד 28 ימים להתמודדות עם דרישות רגולטוריות. ממשק אוויר נוזלי מסופק לחשיפת חומר עורי מאוחר יותר על ידי טיפוח ביופסיות עור בתרבות מוסיף תא 96-היטב. ניסוי coculture מתבצע exemplarily בMOCs endothelialized להוכיח אם coculture שלוש-רקמה במעגל תקשורת משולבת יכולה להיות כל הזמן קיימא ומטבולית פעיל מעל 28 ימים. ניתוח של פעילות LDH בsupernatants תקשורת חשף רמה בהתמדה פוחתת והולכת במהלך שמונת הימים הראשונים של תרבות, שנשארו קבוע בכ -80 U / l לאחר מכן (איור 5). זה מצביע על תחלופת רקמה מלאכותית אך יציבה במערכת בנקודות זמן מאוחר יותר. השוואת coculture שלוש-הרקמה ליחיד כבדניסויי coculture -tissue וכבד-אנדותל, ניתן היו למצוא ברמת LDH באופן משמעותי ירד, בעיקר בימים הראשונים בתרבויות לא כוללים העור. מוות של תאים בתוך תקופה הראשונה זו של פעילות LDH הגבוהה התרחש בעיקר בתא תרבות עור, כמו תרבויות MOC רקמה אחת עור נחשפו (מידע לא מוצג). זה יכול להיות בגלל האזור הפצוע המקיף את הביופסיה כתוצאה מהחבטות של העור. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> איור 5: ביצועי רקמה חמש עשרה יום בפעילות LDH MOC בsupernatants התקשורת של תרביות רקמת הכבד בודדת (MOC Li), תרבויות כבד בMOCs endothelialized (MOC Li-Va) וcocultures העור כבד בMOC endothelialized (MOC לי. -Va-Sk). הנתונים הם ממוצעי ± SEM (n = 4). במהלך תקופת תרבות 28 היום, spheroids הכבד דבק בתחתית MOCתאי nd צמחו מתוך, ויצר קשר רב-שכבתי בין spheroids הסמוך. זה לא יפגע בתפקוד רקמות. Endpoint ניתוח על ידי immunofluorescence הראה כי spheroids הכבד היה עדיין מטבולית פעיל לאחר 28 ימים של coculture MOC, כפי שמוצגים על ידי ציטוכרום P450 3A4 צביעה (איור 6 א). HHSteC חולקו לאורך כל המקבילה הכבד, כפי שמוצג על ידי צביעת vimentin (איור 6). עלייה בעוצמת כתמי vimentin יכולה להיבחן באזורים שבם תאים שצמחו מתוך spheroids. מכתים לגורם פון Willebrand (vWF) הראה כי תאי האנדותל לא חדר עמוק לתוך הרקמה, אבל היו במגע תאי תאים ישיר עם hepatocytes החיצוני (איור 6 ג). צביעת אימונוהיסטוכימיה של ביופסיות העור הראתה ביטוי של C tenascin וקולגן IV בקרום הבסיסי (איור 6 ד), תוך הכתמה של שליטת סטטי הראתה elevatרמות ed של C tenascin (איור 6-ה). Tenascin C הוכח להיות שהוגבר בריפוי פצעים, תהליכים דלקתיים וסיסטיק, המצביע על תהליכים הנגרם fibrotic בסטטי, אבל לא בתרבויות דינמיות 14,15. כדאיות תא יציבים ופונקציונליות של רקמות לאחר coculture 28 יום בMOC להוכיח כי המערכת אינו מסוגלת לשמור על שילוב של עד שלוש רקמות במעגל תקשורת נפוצה. תאים ראשוניים, כמו גם מודלים וביופסיות רקמות, יכולים להיות מעובד בו זמנית במערכת MOC. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> איור 6:. ביצועים של תרבויות רבת-רקמה מעל 28 ימים שווי כבד וביופסיות עור עובדו בפונקציונליות MOC ותא endothelialized הוצג על ידי immunostaining של שלב (א) אני אנזימי ציטוכרום P4503A4 (אדום), vimentin (אדום) (ב), cytokeratin (C) 8/18 (אדום) וvWF (ירוק) ברקמת כבד. ביופסיות עור cocultivated במשך 28 ימים (ד &#39;) במשרד התקשורת או (E) בתנאים סטטיים היו מוכתמות עבור ג tenascin (אדום) וקולגן IV (ירוק), מכתים גרעיני כחול. מכתים (F) H &amp; E של העור לאחר 28 ימים של תרבות MOC. ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture at JoVE.com

השבב הרב-איברים - פלטפורמה מיקרופלואידית לתרבות משותפת מרובת רקמות לטווח ארוך | ביו-הנדסה | וִידֵאוֹ

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

the-multi-organ-chip-microfluidic-platform-for-long-term-multi-tissue

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

28.4K Views.  Technische Universität Berlin. Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Video: The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...