Bu protokol, merkezi sinir sistemi ilaç geçirgenliğini tahmin etmek ve nörolojik bozuklukları incelemek için kullanılabilecek tamamen insan, kişiselleştirilmiş, mikroakışkan kan-beyin bariyeri oluşturmak için bir organ-on-chip üzerinde farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin tohumlanmış nasıl gösterecektir. Ticari olarak kullanılabilen bir organ-on-chip kullanarak, herhangi bir biyolojik odaklı laboratuvar kişiselleştirilmiş, mikroakışkan kan-beyin bariyer-on-chip oluşturmak için bu teknolojiyi nasıl kullanabileceğini gösterecektir. Biriken kanıtlar BBB'nin genetik nörolojik hastalığı olan bireylerin iPSC'lerinden elde edilen kişiselleştirilmiş BBB yongaları üreterek nörolojik hastalıklarda rol oynadığını göstermektedir.
BBB'nin sağlık ve hastalıktaki rolünü incelemek mümkün olacaktır. Bu yöntem aynı zamanda ilaç şirketleri için yararlı olabilir, hangi insan beynine aday nörolojik ilaçların penetrability için ekran için bu insan BBB platformu kullanabilirsiniz. Organ-on-chip teknolojilerinin uygulanması genellikle özel mühendislik becerileri gerektirir.
Ticari olarak kullanılabilen platformların kullanılması, bu teknolojinin biyolojik olarak yönlendirilen herhangi bir laboratuvarda uygulanmasını sağlar. Başlamak için, biyogüvenlik kabine hazırlanan cips içeren çanak getirmek. P200 pipetkullanarak, girişe 200 mikrolitre nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve sıvıyı prizden çekerek her iki kanalı da nazikçe yıkayın.
Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, talaş yüzeyinden fazla ortam damlacıklarını dikkatlice aspire edin. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonuna hafifçe çalkalayın. beyin tarafını oluşturmak için iPSC kaynaklı nöral progenitor hücrelerini üst kanala tohumlamak için, bir kere 10 ila altı hücre nin konsantrasyonunda 30 ila 100 mikrolitre hücre süspansiyonu içeren bir P200 ucu ekleyin ve ucunu pipetten yavaşça bırakın.
Boş bir P200 pipetalın, pistonun tuşuna basın, üst kanal prizine takın ve tek hücreli süspansiyonu dikkatlice uçtan çekin. Üst kanaldaki hücrelerin tohumlama yoğunluğunu ve homojen dağılımını kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın. Hücre yoğunluğunu %20 oranında doğruladıktan sonra, çipleri hemen 37 santigrat derecede iki saat boyunca kuvöze yerleştirin.
Bundan sonra, girişe taze nöral farklılaşma ortamı ekleyerek ve pipet yoluyla prizden sıvıçekerek bağlanmayan hücreleri yıkayın. Günlük nöral farklılaşma orta değiştirme ile 37 santigrat derece statik koşullar altında hücreleri tutun. INPC'ler bağlandıktan sonra veya tohumlamadan sonraki bir gün, hazırlanan talaşları içeren kabı biyogüvenlik kabinine getirin.
Alt kanalı 200 mikrolitre endotel hücreli ortamla hafifçe yıkayın. Bağlantı noktalarıile temastan kaçınarak, talaş yüzeyinden aşırı endotel hücreli ortama ait damlacıkları dikkatlice aspire ederek her iki kanalda da orta noktayı terk etmenizi sağlar. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süspansiyonuna hafifçe çalkalayın.
P200 pipetkullanarak, mililitre başına altı hücreye 14 ila 20 kat konsantrasyonda iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücresi süspansiyonunun 30 ila 100 mikrolitresini çekin ve ucu alt kanal girişine yerleştirin. Fonksiyonel bariyer özellikleri elde etmek için en kritik adım beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlama olduğunu. Organ çipi içinde homojen dağılımı doğrulamak için kabarcık oluşumunu önlemek için uygun yoğunlukta tohum hücreleri için çok önemlidir.
Boş bir uçla P200 pipetindeki pistonu bastırın, alt kanal prizine yerleştirin ve tek hücreli süspansiyonu alt kanaldan dikkatlice çekmek için pipet pistonunu yavaşça bırakın. Çipin yüzeyinden fazla hücre süspansiyonu aspire edin. Kanallardan hücre süspansiyonu çıkmadığından emin olmak için giriş ve çıkış bağlantı noktalarıyla doğrudan temastan kaçının.
Tohumlama yoğunluğunu kontrol etmek için çipi mikroskoba aktarın. Alt kanal arasında gözlemlenebilir boşluklar olan hücrelerle doldurulur. Doğru hücre yoğunluğunu doğruladıktan sonra, kalan talaşlarda hücreleri tohum.
Hücreleri alt kanalın üst kısmında bulunan gözenekli zara takmak için, her bir çipi ters çevirin ve bir yonga beşiğinde dinlenmelerine izin verin. Hücrelere nem sağlamak için 150 milimetrelik kabın içine steril DPBS içeren küçük bir rezervuar yerleştirin. Talaşları yaklaşık üç saat veya alt kanaldaki hücreler bağlanana kadar 37 derecede kuluçkaya yatırın.
IPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri bağlandıktan sonra, alt kanalın alt kısmına hücre ekine izin vermek için talaşları dik konuma geri çevirin. 48 saat sonra iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin tohumlama, bir saat boyunca 37 derece santigrat derece su banyosunda ısınma tarafından endotel hücre ortamının sıcaklığını dengeleyin. Daha sonra, 15 dakika boyunca vakum lu filtrasyon sistemi altında kuluçka ile orta degas.
Daha sonra, taşınabilir modül ambalajı ve tepsilerin dış kısmını %70 etanol ile temizleyin, silin ve biyogüvenlik kabinine aktarın. Paketi açın ve modülleri tepsinin arkasına doğru rezervuarlarla yönlendirin. Pipet her giriş rezervuar için önceden dengeli, sıcak medya üç mililitre.
Alt kanalın giriş haznesine endotel hücre kültürü ortamı nı ve üst kanalın üst kanal giriş haznesine nöral farklılaşma ortamını ekleyin. Daha sonra, pipet 300 mikrolitre önceden dengelendirilmiş, sıcak ortam her çıkış rezervuar, doğrudan her çıkış noktası üzerinde. Her tepsiye en fazla altı taşınabilir modül yerleştirin.
Tepsileri kuvöze getirin ve tepsi tutamacı dışa bakacak şekilde kültür modülüne tamamen kaydırın. Kültür modülündeki asal döngüyü seçin ve çalıştırın. Kuluçka makinesi nin kapağını kapatın ve kültür modülünün taşınabilir modülleri yaklaşık bir dakika boyunca astarlamasını bekleyin.
Durum çubuğu hazır olduğunda astar döngüsü tamamlanır. Tepsiyi kültür modülünden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine getirin. Taşınabilir modüllerin başarıyla astarlandığını doğrulamak için biyogüvenlik kabinindeki her taşınabilir modülün alt tarafını inceleyin.
Dört bağlantı noktasında da küçük damlacıkların varlığını arayın. Herhangi bir taşınabilir modül damlacıkları göstermiyorsa, bu modüller üzerindeki asal döngüyü yeniden çalıştırın. Çıkış bağlantı noktalarında daha sık oluşan tepsiye damlayan ortamvarsa, tepsiyi %70 etanol ile temizleyin.
Daha sonra, kanaldaki olası kabarcıkları gidermek için her çipin her iki kanalını da sıcak, eşit hücreye özgü kültür ortamıyla yıkayın ve her giriş ve çıkış bağlantı noktasının üstüne küçük ortam damlacıkları yerleştirin. Taşıyıcılarla yongaları taşınabilir modüllere yerleştirin ve her tepsiye altı ya kadar yerleştirin. Tepsileri kültür modülüne takın.
Akış hızı ve esneme gibi uygun organ çipi kültür koşullarını kültür modülüüzerinde programla. Düzenleme döngüsü tamamlanır tamamlanmaz, yaklaşık iki saat sürer, programlanmış koşullar başlar. Bundan sonra, kültür modülü önceden ayarlanmış organ çipkültür koşullarında akış başlar.
IPSC tabanlı kan-beyin bariyer çipimmünositokimya yedi gün post-tohumlama EZ küreler üst beyin yan kanal karışık bir nöral hücre popülasyonu içine farklılaşmış gösterir, S100 beta-pozitif astrositler de dahil olmak üzere, Nestin-pozitif nöral progenitor hücreleri, yanı sıra GFAP-pozitif astrositler, ve beta III tubulin-pozitif nöronlar. IPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri alt kan yan kanal da tohumlu GLUT-1 ve PECAM-1 ifade. Kan-beyin bariyerçipi geçirgenliğinin değerlendirilmesi, iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri ve EZ küreleri ile tohumlanan organ yongasının, sadece iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanmış organ yongalarına göre sıkı bir bariyere sahip olduğunu göstermektedir.
Sadece EZ küreleri ile tohumlanmış organ yongaları herhangi bir bariyer özellikleri sergilemedi. Kanalın ilk yüzey işlemlerinden her gün orta anahtarlama ya da kanalda kabarcık oluşumunu önleyebilirsiniz. Yüzey aktivasyon reaktifi, hücre dışı matriks veya hücre içeren ortamın kanallar dan eklenmesi gereken protokoldeki adım boyunca, kabarcık bulunmadığını dikkatlice doğrulamak son derece önemlidir.
Geçirgenlik tsureri aday ilaçların insan beyninin penetrite edilebilirliğini değerlendirmek için yapılabilir. Bu yaklaşım potansiyel terapötik test için hizmet verebilir. iPSC tabanlı BBB çipin uygulanması, BBB'nin çeşitli nörolojik hastalıklardaki rolünün incelenmesini sağlar.
Gelecekte, bu tür bir platform tahmin, kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için yararlı olabilir.
