NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, hayvan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları tarafından verilmelidir. Hayvan kanı, hücreleri, ya da bu protokolde belirtildiği gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, uygun biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmelidir. 1. Fare Taşıma ve Doku Koleksiyonu <ol><li> Steril bir iş istasyonu hazırlayın ve doku toplama steril araçlar edinin. Bu araçlar büyük ve küçük cerrahi makas, forseps ve ince uçlu cımbız içerecektir. (- 22 ° C 20), oda sıcaklığına dengelendi - (5 mi 3) 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi ile doldurulmuş uygun doku adlarını taşıyan kültür kaplarına, içerir. (- 15 mi 10) da 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş, etiketlenmemiş büyük bir Petri kabı, içerir. </li><li> Hamile bir fare Euthanize (10,5-19,0 ​​gün sonrası coitum (DPC) ya da teslimattan önce) karbondioksit kullanarak (CO 2). Fare ötenazi emin olmak için, servikal dislokasyon tekniği kullanın. Not: 10.5 DPC önce, manüel olarak uterus dokulardan desidual dokuları ayırmak zordur. Desidual lökositlerin izolasyonu gerekli değilse, rahim gebe olmayan farelerin dokularında ya da fareden olanlardan lökositler &lt;10.5 DPC de bu protokol takip edilerek gerçekleştirilebilir. </li><li> Steril cerrahi makas kullanılarak, tam olarak deri ve kas dokusu alt karın kısmı çıkartın. Forseps ile rahim kadar bir kenara diğer tüm organları taşımak ve yumurtalıklar görebilir. Rahim hala bağlı olan, periton boşluğuna (Şekil 1A) dışına hareket ettirmek için forseps kullanır. </li><li> Her uterin boynuz yumurtalık ve uterotubal kavşağına uzak yumurtalıkların bulun. Küçük cerrahi makas kullanarak, uterotubal kavşakta bir kesi yapmak ve rahim damarları içeren mezenter gelen rahim boynuzları ayrı; o zaman,servikste tüketim periton boşluğuna (Şekil 1B) den rahim boynuzları ayırmak için. </li><li> Küçük cerrahi makas ile, serviks ve uterus boynuzları alt segment arasında bir kesi yapmak. Ara uterin boynuzu açma önlemek için bu işlem (Şekil 1C) serviksin bir kısmı eklenmiş. </li><li> Implantasyon siteleri nemlendirmek için - (15 ml 10) 1x PBS çözeltisi ile dolu büyük bir Petri kabındaki (serviks dahil) rahim boynuzları daldırın. </li><li> Hala 1x PBS çözeltisi batırılır iken, küçük cerrahi makas ile rahim boynuzları gelen herhangi bir yağ kırpın. Diseksiyon boyunca 1x PBS çözeltisi dalmış dokuların tutun. </li><li> Forseps ile yerde rahim boynuzları Holding, küçük cerrahi makas (Şekil 1D) kullanılarak arası implantasyon bölgesinde kesti bir enine ile rahim implantasyon sitelerinden birini kaldırın. implantasyon sitesi çevrili fetus içerirkoriyoallantoik membran ve rahim, desidual ve plasental dokuların. </li><li> Forseps kullanarak, yerinde siteyi tutun ve plasenta ve desidual dokularda (Şekil 1E) komşu rahim duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu rahim duvarına ve fetus içeren chorioallantoic membran (Şekil 1F) hem ayrılmış hale gelene kadar plasenta / desidua çevresinde Trim. </li><li> 1x PBS çözüm plasenta ve ekli desidual doku ve yer çıkarın (3-5 ml; adım 1.12 bakınız). </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının bağlı chorioallantoic membran ile çevrelenmiş fetus yerleştirin. Bu dokuların hidrasyon rahim duvarından korioallantoik membranın ayrılmasını kolaylaştıracaktır (adım 1.14 bakınız). </li><li> Ince uçlu bir cımbız kullanarak, yavaşça plasenta yüzey desidual doku (beyaz-gri tabaka) soyun. Bu gerçekleştirinplasenta ve desidual dokularda (Şekil 1G) bütünlüğünü korumak için dikkatli adım. </li><li> (- 5 ml her 3) 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş iki ayrı etiketli Petri kapları plasenta ve desidua dokuları yerleştirin. </li><li> Yavaşça ince uçlu cımbız ile chorioallantoic zarından rahim duvarına çıkarın. Bu rahim dokulardır. </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının yerleştirin. </li><li> Tüm implantasyon yerleri işlendikten yineleyerek 1.15 ile 1.8 adımları. </li><li> Enzimatik sindirim sırasında hücre verimini artırmak için çok sayıda uterin, desidual ve plasental dokularda toplayın. dokuların miktarı çöp boyutuna bağlıdır; Bununla birlikte, lökosit yalıtım doku&gt; 2 adet gerektirir. Not: Farklı gestasyonel günlerde implantasyon sitelerinin diseksiyonu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için, soruşturmalar için Kılavuzu, Bölüm İki bulunan resimleri görüntülemekFare Gebelik 42 üzerinde. </li></ol> 2. Rahim, Desidual ve Plasental Doku Ayrılma <ol><li> Uygun doku isimde çok sayıda steril 2 ml konik tüpler etiketleyin ve buz üzerinde enzimatik solüsyon 1,000 ul bir şişe yerleştirin. </li><li> Etiketlenmiş bir 2 ml konik tüp, uterin, desidual ya da plasental dokularda - (150 ila 100 mg), 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş petri, iki parça aktarın. </li><li> Her bir 2 ml konik tüp içine soğuk bir enzimatik solüsyon 500 ul ekle. </li><li> Ince steril makas ile, ince kıyılmış kadar enzimatik solüsyon batırılır doku ayırmak başlar. Zamanla, süspansiyon sütlü bir görünüm geliştirecektir. Bu aşama, örneğin aşırı manipülasyonu önlemek için en fazla 2 dakikayı geçmemelidir. </li><li> Doku ayrışmış sonra, 2 ml konik tüp, soğuk enzimatik solüsyonun bir ilave 500 ul ekle. </li><li> Buz üzerinde 2 ml konik tüp yerleştirin. </li><li> Tüm dokular işlendikten yineleyerek her doku ile 2.6 ile 2.2 arasındaki adımları. </li><li> 37 ºC bir inkübatör içine buz homojenize doku (kıyılmış dokuya + enzimatik solüsyon) numuneler ile tüm 2 ml konik tüpler aktarın ve nazik bir yörünge ajitasyon (80 rpm) gerçekleştirin. 35 dakika - 30 inkübe. Kuluçka sıcaklığı inkübasyon süresi başlamadan önce stabilize olduğundan emin olun. </li><li> İnkübasyon sonrasında, inkübatör ayrışmış dokularla 2 ml konik tüpler çıkarın ve başka sindirim önlemek için buz üzerine koyun. </li><li> Doku tipine bağlı olarak, steril 50 ml konik tüp etiketleyin. Kapakları çıkarın ve steril bir hücre süzgeç (100 mikron gözenek boyutu) ile değiştirin. </li><li> ~ 1 x PBS çözeltisi 20 ml hücre süzgecinden konik tüp kullanılarak 2 ml ayrışmış dokuları dökün. doku fragmanları hücre süzgecinden kalır ve hücre süspansiyonu içinden geçecek. </li><li> Di yıkayınhücre süzgecinden ssociated dokular 2 - Bir transfer pipeti kullanarak, 1x PBS çözeltisi, 20 ml ile 3 kez. </li><li> Boş 2 ml 1 x PBS çözeltisi (1 mi) ile konik tüp durulayın ve hücre süzgeçler yoluyla içeriğini dökün. </li><li> 50 ml konik tüpler hücre süzgeçler çıkarın ve kapaklarını değiştirin. 4 ºC de 10 dakika boyunca 1.250 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> Dikkatle, hücre pelet bozmadan süpernatant aspire. Hücre pelet izole lökositler ve stromal hücreler içerir. </li><li> Fetal sığır serumu (FBS) içermeyen RPMI kültür ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hafifçe karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp düzgün FBS 500 ul ekleyin ve yavaş yavaş hücre süspansiyonu kaplaması. </li><li> Hücresel kalıntı PBS / FBS arayüzde korunur ise, oda sıcaklığında freni olmadan 1,100 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj canlı hücre pelet. </li><li> Hücre pelet dokunmadan süpernatant aspire. cell pelet çoğunlukla canlı hücreleri içerir. </li><li> İsteğe bağlı: Aşağıda açıklandığı gibi mononükleer hücreleri konsantre etmek,% 20 doymuş polisakkarit çözümü kullanın. <ol><li> FBS&#39;siz RPMI kültür ortamının 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 5 ml polistiren plastik tüpe% 20 doymuş polisakarit çözeltisi 1 ml ilave edilir ve yavaşça, bu çözeltinin üzerine hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman birlikte, hücre süspansiyonu% 20 doymuş polisakarit çözeltisi karıştırma kaçının. </li><li> Frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücrelerin karıştırma ve degrade kaybetmemek için fren kapatmak için çok önemlidir. Mononükleer hücreler,% 20 doymuş polisakarit çözeltisi ve 1 x PBS çözeltisi arasında arayüzde bulunacaktır. </li><li> Aspire ve süpernatant atın. Hücre topağı çoğunlukla mononükleer hücreleri içerir. Hayırte: gerçekleştirmek için adım 6&#39;ya bakınız, izole lökositlerin hücre kültürü gerçekleştirmek için adım 5. bkz canlılık boyama ve sadece dışı boyama gerçekleştirmek için adım 4. bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için 3. adımı bkz canlılık boyama ve hücre içi boyama gerçekleştirmek için Manyetik hücre sıralama, adım 7 bkz. </li></ol></li></ol> Tamir edilebilir Hücreler 3. geçerlilik boyaması <ol><li> 1x PBS çözeltisi 1.100 ul hücre pelletini. Hafifçe mikro-pipet kullanılarak karıştırılır. </li><li> 5 ml&#39;lik bir polistiren plastik tüp içine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. 5 ml polistiren tüp 1x PBS çözeltisi 400 ul ekleyin. Bu tüp, doku bir oto-floresan için kontrol edilmesidir. Adım 3.5 kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yeni 5 ml polistiren plastik hücre süspansiyonunun tüpe Geriye kalan 1000 ul aktarma. Canlılık boya 1 ul ekleyin ve hafifçe homojenize. 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sonrasında, 1,000 &amp; # ekleyin181; 1 x PBS çözeltisi l. Elle hafifçe karıştırın. </li><li> Santrifüj her ikisi de 5 ml polistiren tüpler 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1250 x g&#39;de (3.2 ve 3.3 adım). Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre topağı (aşama 3.3), doku bir oto-floresan için bir kontrol olarak hizmet edecek aşama 4. hücre topağı (aşama 3.2) kullanılır. </li></ol> 4. İmmünofenotipleme <ol><li> Anti-fare CD16 / CD32, 50 ul hücre pelletini (1 seyreltilmiştir: FACS tampon maddesi içinde 100 [% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid, 1x PBS çözeltisi, pH 7.4]). Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C de karanlıkta 5 ml polistiren bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücre-dışı hücre yüzey markörlerinin veya izotip-eşleştirilmiş kontrol antikoru ile reaksiyona sokulması her anti-lökosit monoklonal antikor 50 ul (antikor seyreltme doğrulanması gerekir) ekleyin. Örneğin, lökosit alt popülasyonları analiz anti-mo kullanmak içinCD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 (Tablo 1): Aşağıdaki lökosit hücre yüzey belirteçleri ile reaksiyona antikorları kullanır. </li><li> Hücre-dışı belirteçleri karşı antikorlar, 5 ml polistiren plastik tüpe ilave edildikten sonra, yavaşça karıştırın. 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Bu kuluçka sırasında hazırlanması ve (iyonu giderilmiş su ile seyreltildi, 1: 5) sabitleme tampon çözeltisi önceden ısıtmak, gerekirse 37 ºC&#39;ye. Kullanımı gereklidir kadar karanlıkta 37 ºC &#39;de tampon tutun. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 ml polistiren plastik tüp FACS tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Bu adım, hücrelerin yıkayın ve bağlanmamış antikor fazlasını uzaklaştırmak için gereklidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre içi boyama gerekli değilse, hücre içi boyama gerekli ise, adım 5 bkz geçirgenliği yapmak ve hücreler arasıular boyama burada ve daha sonra sabitleme (adım 4.8) ile devam edin. </li><li> Hücre pelletine önceden ısıtılmış sabitleme tampon çözeltisi 500 ul ilave edin ve 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp içine FACS tampon 500 ul koyun. Hafifçe karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. </li><li> Her bir örnek için FACS tampon 500 ul ekle. Bu örnekler hemen akış sitometrisi ile analiz edilebilir. En iyi sonuçlar için derhal örnekleri edinin. </li></ol> Unfixable Hücreler 5. geçerlilik boyaması <ol><li> Hücre-dışı immünofenotiplendirme sonra FACS tampon 500 ul hücre pelletini. </li><li> Sadece örnek elde edilmesinden önce 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI, 200 ug / ml) 1 ul ekle. </li><li> Debi sitometresinde DAPI ekledikten sonra 2 dakika - 1 içindeki örnekleri gözünüzde canlandırın. </li></ol><ol><li> Steril bir davlumbaz altında bir iş istasyonu hazırlayın. Bir su banyosu kullanılarak 37 ° C RPMI kültür ortamının önceden ısıtın. </li><li> Hücre sayımı için FACS tampon 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanılarak canlı hücre sayısı, saymak. Toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreler 10 dakika FACS tampon kaldırmak için. </li><li> Yavaşça 2-3 kez pipetleme önceden ısıtılmış RPMI kültür ortamında 500 ul hücre pelletini. </li><li> Steril 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin istenilen sayıda plaka ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kuluçka süresi araştırma sorusu ile belirlenecektir. </li></ol> 7. Manyetik Hücre Ayırma <ol><li> MS sütunlar, manyetik hücre ayırıcı, 15: Aşağıda yer alan maddelerle temiz bir iş istasyonu kurmakml konik tüpler, 30 mikron ön ayırma filtreleri ve bir çok standı. </li><li> MACS tamponu (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS çözeltisi, pH 7.2) içinde 500 ul hücre pelletini. </li><li> Otomatik Hücre sayıcı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözümü kullanarak, saymak ve toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu başka 500 ul ekleyin. </li><li> Üreticinin önerilerine aşağıdaki manyetik ayırma gerçekleştirmek için devam edin. </li><li> Flow sitometri veya mikroskop ile saflığını belirlemek. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.

maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları fark...

Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir. En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü gebeliğin 10-16 erken ve geç evrelerinde hastalık mekanizmasını kabul edilir. Maternal-fetal tolerans T hücreleri (düzenleyici T hücreleri, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri ve Th17 hücreleri), mac dahil olmak üzere çeşitli lökosit alt popülasyonları, katılımını gerektirirrophages, nötrofiller, mast hücreleri, NK hücreleri, ve NKT hücreleri, dendritik hücreler ve B hücreleri, gebelik 15,17-19 boyunca yoğunluk ve lokalizasyon bu değişiklik. Annenin bağışıklık sistemi cenin antijenler 20,21 ile etkileşime anatomik sitede - Maternal-Fetal tolerans maternal-fetal arayüzü 20&#39;de zenginleştirilmiştir. Fetal extravillous trofoblastların rahim mukozası 22-24 istila ettiğinde maternal-fetal arayüz plasenta sırasında oluşturulur. Bu arayüz fetal tarafında, fetüsü çevreleyen zarlar plasenta içindeki özel bir epitel yüzey oluşturmak ve sinsityotrofoblast hücreleri anne kanındaki 22 ile doğrudan temas yoluyla besin alışverişini kontrol eder. Arayüzü maternal tarafında, Desidua farelerde bütün desidual hücrelerde% 50% 30&#39;unu lökositlerin heterojen havuz işe. MATERN katılımları yanı sıraEl immun tolerans, bu hücrelerin gebelik sırasında farklı süreçler, örneğin., enfeksiyonlar, döllenmenin gelen üreme sisteminde korunması, embriyo implantasyonu 7,25, desidual anjiyogenez 26 vasküler remodeling 24,27, trofoblast invazyonu 28, plasental anahtar sebeplerindendir kalkınma 24,25 ve nihayetinde, emek ve dağıtım 15,17. Bu nedenle, maternal-fetal tolerans katılan lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonların patogenezi aydınlatılması esastır. Immünhistokimyasal ve immünofloresan kullanımı doğrudan görselleştirme ve uterin, desidual veya plasental lökositlerin 29,30 lokalizasyonu için veri üretti ederken, ayrıca bu dokuların 31,32 her lökositlerin belirli alt kümelerini ortaya çıkarmıştır sitometri analizi akış. Ayrıca, sitometri yoğunluğu ve mater oranını belirlemek için kullanılır olmuştur akışNAL fetal arayüz hücre dışı ve hücre içi proteinlerin 8-10,34 33 ve ekspresyon seviyelerini lökosit. Maternal-fetal arayüzünde lökositlerin sitometrik akış analizi tek bir hücre süspansiyonu gerektirir. Desidual, rahim ve plasenta dokularından süzücü lökositlerin izole etmek için, doku ayrışma için iki yöntem kullanılmıştır: mekanik ve enzimatik. Her iki yöntem de, bu dokuların hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili infiltre lökosit ayrılmasını sağlar. Daha az kesme kuvveti ile ilişkili hasar 35 ile lökositlerin yüksek verim verir gibi enzimatik doku ayrışma mekanik doku ayrılma üstündür. Sonuç olarak, mekanik doku ayrışma örnekleri değişkenliği ve heterojenitesini artırabilir dokuların 36, havuzlama gerektirir. Bununla birlikte, mekanik ayrıştırma İlgi konusu antigen enzimatik ayrışma veya değiştirilebilir zaman seçim olabilir hücre işleviFaiz ihtiyacı s korunacak (örn., NK hücrelerinin sitotoksisite) 35. ECM aşağılamak özel enzimlerle proteoliz kullanımı mekanik ayrışma ile gözlenen düşük verim ortadan kaldırır. Çeşitli çalışmalar tripsin 32, kollajenaz 37, DNaz 31, 38 dispase ve çeşitli enzimlerin 32,39 ticari kokteyller kullanımını bildirmişlerdir. Bununla birlikte, doğal ve farklı enzim konsantrasyonu ve sindirim süresi titizlikle tanımlandığı gibidir ve immünofenotipleme için gerekli olan hücre yüzeyi antijenik epitopların bütünlüğünün korunmasını sağlamak için doğrulanması gerekir. Çeşitli yüzey yapıları bir çok monoklonal antikorlar tarafından tanınan lökosit yüzey epitoplarını sıyırma için ünlü olan tripsin gibi bazı enzimler ile, farklı enzimlerin yok farklı olarak duyarlı olan. Bu tarifnamede sunulan bir proteolyt kullanılan bir yöntem olupAccutase denilen ic ve kolajenolitik enzimatik kokteyl. Bu enzimatik solüsyon kadar anne-fetal arayüzünde sıçangil hücreleri ayrıştırma sırasında halen etkin nazik ve ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için başka ayrışan reaktifler veya serum eklenmesini gerektirmez. Ayrışma zamanı doğrulanması gerekiyor, ancak Ayrıca, yukarıda belirtilen enzimler 40,41 daha sağlamdır, tedarik edildiği gibi kullanıma hazırdır ve. Doku ayrıştırma her iki tip bir kombinasyonunun kullanılması elde edilen hücrelerin kalitesi ve miktarı artırır; Böylece, çeşitli çalışmalar tatmin edici sonuçlar 31,32,37 ile mekanik ve enzimatik ayrılma kombine kullanımının hayata geçirdik. Burada tarif edilen bir protokol kurulmuş ve laboratuvarda doğrulandı; o sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif bir mekanik ayrışma bir arada kullanır. Bu protokol izolasyonu ve daha fazla çalışma izin verirmaternal-fetal arayüzünde fare dokularda sızan lökositler (rahim, desidua ve plasenta). Akış sitometrik analizi ile gösterildiği gibi, aşağıdaki protokol aynı zamanda, hücre yüzey belirteçleri ve aşağı doğru uygulamalar için verim kadar canlı hücre bütünlüğünü korur. Son olarak, bu protokol analizi ve maternal-fetal arayüz oluşturan farklı fare dokuların karşılaştırma için hücre hazırlama tutarlılığını korumaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (&gt;% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.

maternal-fetal arayüzü fare dokuların diseksiyonu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir; Bu prosedür, periton boşluğu (Şekil 1A, B), emplantasyon yerlerinin (Şekil 1D) içeren rahim boynuzları (Şekil 1C) ve uterus dokularının toplama (Şekil 1E), plasenta (Şekil 1F) ve desidual dokuları açıklığı kapsamaktadır 16.5 at (Şekil 1G) DPC. Şekil 2 izole makrofajlar morfolojisi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

İzolasyon ve Farklı Yaşlı Fare Timik Greft Nakli.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...