Yazarlar bu çalışmada kullanılan insan numuneler için bağış, RCWIH BioBank ve Mount Sinai Hastanesi/bunlar bölümü kadın doğum ve jinekoloji teşekkür etmek istiyorum. Küllü su Laboratuvarı, özellikle Dr. Caroline Dunk için onun yardım yöntemi geliştirilmesi ile üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Burroughs hoş geldiniz Fonu (grant #1013759) tarafından desteklenmektedir.

Placentae sağlıklı vadede değil seçmeli cesarean bölüm geçiren işçi kadınlar üzerinden toplanır. Toplama, işleme ve insan örnekleri tek kullanımlık Mount Sinai Hastanesi Etik Kurulu yönergeleri için uygun. Yazılı izni her hastadan elde edilir. Bu çalışmada, Mount Sinai Hastanesi araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlıkları
Not: Tüm adımları bir duman başlık altında yürütülen gerekir ve duman başlıklı yerleşim önce otoklav ile tüm cerrahi aletler sterilize edilmiştir. Tüm diğer malzemeler (şişeler, 50 mL tüpler, vb) % 70 etanol çözüm ile sterilize gerekir. Her zaman giyim kişisel koruyucu ekipman her zaman biyolojik atık (önlük, eldiven, uzun saç geri bağlı, vb) ile çalışırken.
<ol><li>
Enzimatik sindirim çözüm (nihai çözüm: 200 mL)
	<ol>
<li>HBSS - 180 mL pipet / - steril karıştırma mıknatıs 500 mL kabı ekleyin ve yer oda sıcaklığında plaka karıştırma.</li>
		<li>Tartmak ve şu HBSS-/-yavaş yavaş ve sırayla ekleyin: FBS, 20 mL 400 mg Collagenase 2 ([final] 2 mg/mL =), 20 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg Dnaz 1 ([final] 0.15 mg/mL =) ve 200 mg BSA ([final] 1 mg/mL =)</li>
		<li>Karıştırma için Orta hızda ayarlayın ve 10-20 dk (kalay folyo veya parafin film süre karıştırma ile kapak) için karıştırın karışım izin verin.</li>
		<li>Karışık çözüm plastik huni kullanarak 250 mL cam şişe içine dökün ve duman mahallede yer.</li>
		<li>Bir plastik top filtrasyon ünitesi (0,22 mikron membran filtre, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL tüpler (10 tüpler toplam) ve mağaza-20 ° c kadar kullanım ile çözüme geçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 medya (çözüm ve % 10 tam büyüme orta yıkama %2)
	<ol>
<li>RPMI 1640 ve FBS duman başlıklı bir cam şişe içinde birleştirir.</li>
		<li>İçin % 2 FBS çözüm, 490 mL RPMI 1640 ve 10 mL FBS birleştirin.</li>
		<li>% 10 FBS çözüm için 450 mL RPMI 1640 ve 50 mL FBS birleştirir.</li>
		<li>500 mL cam şişe RPMI medya ve FBS (50 mg/mL stok, 0,05 mg/mL çalışma konsantrasyonu) içeren önceki adımdaki içine normocin 500 μL pipet.</li>
		<li>Medya aracılığıyla bir 0,22 mikron membran filtre ve mağaza 500 mL cam şişe 4 ° c kadar kullanmak geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>deneme, başlamadan önce 30 dk 20 mL aliquot, Enzimatik sindirim çözüm bir 37 ° C boncuk banyoda dondurulmuş koyun, %2 yer FBS ve 37 ° C boncuk banyo, % 10 FBS RPMI 1640 medyada üzerinde sallanan su banyosu açmak ve 37 ° C için ayarla , 2 g ve set 4 ° c sıcaklık kontrollü santrifüj</li>
</ol>2. dönem plasental zarlar Decidual doku toplanması
<ol><li>Yer HBSS ile şişe +/ +, HBSS-/- ve beş 50 mL tüpler bir rafa duman başlık altında. HBSS 25 mL pipet +/ + bir tüp.</li>
	<li>
Eldivenli ellerini kullanarak, terim plasenta ameliyathane tiyatro taşınmasında kullanılan kapsayıcı üzerinden çıkar. Plasenta bebek bezi pad (anne tarafı yukarı) yerleştirin ve makas ve forseps kullanarak fetal membranlar yayıldı.
	<ol>
<li>Üst üste gelen bebek bezi yastıkları duman kaputa yatıyordu.</li>
		<li>Böylece anne yan yüz kadar plasenta çevirmek için ayrı bir bez kullanın.</li>
		<li>Membran rüptürü nokta bulmak ve membran açılmak ve fumehood yüzeyinde yat izin vermek için insizyon olun. Not: bir kez membran plasenta geri çekilir, decidua koryon katmandaki arka amnion katmanında ile dinlenme kadar yüzü olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak dikkatlice kazımak koryon ve 25 mL HBSS içeren 50 mL tüp yerde kapalı decidual doku +/ +.</li>
	<li>Orta basınç ile membran kazı. Koryon kirlenme neden olabileceğinden çok baskı uygulamayın. Küçük kan pıhtıları yanı sıra, bu decidual bazı hücreler içeren toplamak. Dikkat: decidual toplandıktan sonra plasenta olmalı bir biohazard plastik depo gözünde paketlenmiş ve -20 ° C-dondurucu (göre kurumsal kurallarınızı) uygun bertaraf önce donup kalan ev. Kanlı bezi yastıkları mühür geçirmez plastik bir torbaya sarılmış ve biohazard kasa içinde bertaraf gerekir.</li>
</ol>3. yıkama ve Enzimatik sindirim Decidual doku
<ol><li>Yavaşça 50 mL tüp el sallayarak ve bir 250 Mikron metal elek (250 mikron, boyutu 60 mesh) steril numune (idrar) konteyner üzerinde dinlenme üzerinden geçen tarafından toplanan doku yıkayın.</li>
	<li>Yıkama HBSS ile iki kez tekrar +/ + ve iki kez ile HBSS-/ - her yıkama için taze tüpler. (final yıkar HBSS - ile /-kalsiyum ve magnezyum HBSS içinde mevcut kaldırılması için sağlar + / +, hangi aksi takdirde aşağıdaki Enzimatik sindirim işlemine engel). DİKKAT EDİN. Çamaşır adımları uyguladığınızda, koryon doku kirlenme decidual doku pembe renkte ışık ve amorf, koryon ise beyaz, yoğun ve lifli olduğu belli olacak. Bu nedenle, koryon kirlenme Forseps ile kolayca kaldırılabilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, decidual doku kalın ise, steril 10 cm Çap petri kabına aktarmak ve tabak içinde iki karşıt neşter ile dokusunun kıyma geçin.</li>
	<li>
Yıkanmış doku doku/mL Enzimatik sindirim çözeltisi 100 mg içeren steril 50 mL tüp içinde yer (hazırlıklar bakın).
	<ol>
<li>Bir referans noktası olarak decidual doku düzeyini 5-10 mL işareti 50 mL tüp ulaştığından emin olmak.</li>
		<li>Bütün dönem fetal membran toplanan toplam decidua sindirmek için yaklaşık 20 mL Enzimatik sindirim çözeltisi (hazırlanan adım 1.1) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parafin film ile tüpün kapağı kapatın (tüp sıkıca kapatın ve parafin film kapağı ve tüpün üst etrafında sarın) kültür altında hood ve titreyen bir su banyosu (145 rpm içinde 20 dk 37 ° C'de decidual doku kuluçkaya 2 g).</li>
	<li>Kuluçka sonra parafin film kaldırmak ve % 70 etanol ile sindirilir doku içeren boru yüzeyine sterilize ve duman başlık altında getir. Tüp kısaca el salla.</li>
	<li>Hücre süspansiyon metal elekten (250 mikron, boyutu 60 mesh) yeni bir steril numune konteyner içine toplamak. Bir eşit hacmi enzimatik reaksiyon durdurmak için RPMI + % 10 FBS kapsayan %0,1 normocin ile (20 mL) oranında seyreltin. Doğrudan Santrifüjü adıma 4.1 geçin.</li>
	<li>Gerekirse, 20 mL taze Enzimatik sindirim çözeltisi ile yeni bir 50 mL tüp içine geri kalan sindirilmemiş doku yerleştirin ve sindirim (20 dk, su banyosu sallayarak 37 ° C) tekrarlayın.</li>
	<li>İkinci bir sindirim gerekli ise, hücre süspansiyon ile ilk tüp buz (steril tutmaya parafin film ile kapak) yerleştirin. 3.5-3,6 adımı yineleyin ve iki hücre süspansiyonlar birleştirir.</li>
</ol>4. bir tek hücre süspansiyon oluşturma
<ol><li>Hücre süspansiyon (420 g, 4 ° C, 11 dk) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve RPMI + %2 FBS içeren % 0,1 normocin ("yıkama tampon") 40 mL hücrelerde resuspend. Not: Hücre Pelet gevşek ve kırmızı kan hücresi kontaminasyon nedeniyle jelatinimsi, dikkatle süpernatant Aspire edin. El ile bir pipet ile üst aşama kaldırılması gerekebilir.</li>
	<li>Santrifüjü 420 g 4 ° c de 11 dk için yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant (Not Adım 4.2 içinde belirtildiği gibi) kaldırın ve hücre Pelet yıkama arabellek 5 mL resuspend ve 35 mL eritrosit lizis arabellek aynı tüpte ekleyin. Not: Pelet büyük ya da çok kanlı ise, bu iki tüp eritrosit lizis adım için yıkama arabellek 10 mL ekleme ve eşit iki tüpler içine bölünüp her tüpün 35 mL eritrosit lizis arabelleği ekleyerek bölünebilir.</li>
	<li>20 dk. kısaca girdap tüpler başında ve sonunda, kırmızı kan hücreleri parçalayıcı kuluçka için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de 11 dakika için 420 g, santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Dikkatle, süpernatant kaldırmak ve Pelet yıkama arabellek 40 mL resuspend.</li>
	<li>Hücreleri hücre kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon filtre geçmek.</li>
	<li>4 ° C'de 11 dk için 420 g, santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 10 mL tam orta resuspend (RPMI % 10 + %0,1 normocin içeren FBS).</li>
	<li>
Aşağıda açıklandığı gibi trypan mavi boya-dışlama hemasitometre yordamı kullanarak hücreleri saymak:
	<ol>
<li>Kültür başlık altında hafifçe yukarı ve aşağı 3 x hücre süspansiyon trypan mavi ile birleştirerek daha önce iyice karıştırın için pipet. Bir 1,5 mL tüp hazırlamak hücre süspansiyon, 1:2 (birleştirme 20 μL trypan mavi çözüm) ve decidual hücre süspansiyon, 20 μL seyreltilmiş. Dikkatle trypan mavi-hücre çözümü birkaç kez (Bu çözüm steril değildir) yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.</li>
		<li>Hemasitometre cam coverslip üstte mikroskopla sahne yerleştirin. Not: Bir mikroskop slaytta Izgaralar ile üçlü çizgi tarafından bölünmüş dokuz büyük kareler vermek için hemasitometre var. Her büyük kare 1 mm2lik bir alana sahiptir ve sıvı odasında derinliği 0.1 mm. Bu nedenle, her büyük kare doldurabilirsiniz sıvı hacmi 1 mm * 1 mm olan * 0,1 mm = 0.1 mm310-4 mL =.</li>
		<li>Yavaş yavaş trypan mavi-hücre karışımı 10 μL kılcal eylem hücre karışımı tüm slayta (karışımı de doldurur önce Durdur) dağıtmak için izin hemasitometre, oluk içine ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri (10 X büyütme), mikroskop altında görüntüleyebilir ve (bu hücrelerin vardır) trypan mavi hemasitometre dört büyük dış karelerinin içinde hariç tüm beyaz/yeşil hücreleri saymak. Yolun dokunma hücre sayım sırasında yalnızca sağ dokunma ve üst satırları ama değil, bu sol ve alt çizgiler dokunmadan sayısı. Koyu mavi hücreler sayılmaz; mavi renk trypan mavi boya kolayca plazma zarı ile sitoplazma nüfuz edebilir gibi hücre ölü olduğunu gösterir.</li>
		<li>1 ml hücre süspansiyon (X), hücrelerin sayısını hesaplamak için: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = seyreltme faktörü 10.000 dönüştürme faktörü = (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir arzu edilen son konsantrasyon RPMI + % 10 decidual hücrelere seyreltik FBS (büyüme orta). Not: doku kültürü kaplama, 2 * 106 hücreler/iyi pipet plastik bir 6-şey plaka, 10 * 106 hücre içine 10 cm plastik tabak veya cam coverslip için 75.000 hücre içine.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells.">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li><li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).</li><li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li><li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li><li>Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy.">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li><li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua.">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li><li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+natural+killer+cells:+key+regulators+of+placental+development.">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li><li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy.">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li><li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta.">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cachectin/tumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor.">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li><li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms.">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li><li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling.">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li><li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes,+decidua,+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term.">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li><li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women.">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li><li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor:+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor.">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour.">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li><li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition.">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li><li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+in+term+and+preterm+labor.">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li><li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface.">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li><li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface.">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li><li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens.">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li><li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue.">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li><li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization.">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li><li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour,+both+term+and+preterm.">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Burada açıklanan protokol bir maliyet ve çok erişilebilir ve doğru sözlü birincil decidual hücreleri izole için etkili yöntem tüm insan dönem placentae fetal membranlar toplanan saat gösterir. Bu protokol iki kritik faktörler, (1) decidual (2) ile decidual hücreler boyunca protokolünün işlenme bakım ve fetal membranlar koryon katmanından kazıma verimliliğini bağımlı bir başarıdır. Koryon doku kirlenme yok decidual kazıma sırasında ve belirlenmesi ve herhangi bir kirlenme çamaşır adımlar...

Endometrium, biri en aktif yetişkin kadın dokuları, dramatik yumurtalık hormonlar, (E2) östrojen ve progesteron (P4) tarafından yanıt olarak uyarılması her adet döngüsü remodeling uğrar. Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, P4 tahrik farklılaşma E2-baskın proliferatif faz takip sonucunda postovulatory aşamasının sonunda oluşan kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Hormonal faktörler başarılı blastosist implantasyon ve fetal homogreft anne tolerans korumak için rahim plasental arayüzü geliştirilmesi salgılanmasını sorumlu decidual hücrelerdir.
Decidualization implantasyon ve sonraki decidual sarmal damarların remodeling için gereklidir. Endometrium stromal hücreler decidualization P4 ve kamp, kontrol altında geç luteal faz1adet döngüsü sırasında tabi. Bu işlem kan damarları ve damarlara yenileme ve düzenleme kaçakçılığı lökosit rolü düşündüren stroma boyunca yayılır çevresinde başlatılır. Bu hücresel dönüşüm dairesel Morfoloji, artan nükleer boyutu ve kaba endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtı2genişleme ile karakterizedir. Decidualized stromal hücreler blastosist implantasyon desteklemek parakrin faktörler üretebilen ve çok sayıda hormonlar (Yani prolaktin), anjiogenik büyüme faktörleri, insülin büyüme faktörü bağlayıcı protein-1 salgılanmasını tarafından karakterize (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (hücre içi kampın uyarıcı), sitokinler, hücre dışı matriks bileşenleri ve gerekli besinlerden plasental implantasyon ve geliştirme3,4,5için,6 .
Decidual hücre nüfus yalnızca decidualized stromal hücreler oluşur değil ama büyük, gebelik özgü decidual lökosit nüfus da içerir. Decidualization geçici lokalize ödem ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, T-hücreleri, dendritik hücreleri ve makrofajlar akını içerir. En büyük lökosit subpopulation tüm maternal lökosit Infiltrating sitokinler kaynağı olan decidua ve decidualization sürecinde yardım ve artış anjiogenik faktörler yaklaşık % 50-70 oluşan rahim NK hücreleri olduğunu gebelik7boyunca numarası. Makrofajlar, bağışıklık hücreleri, ikinci büyük subpopulation olmak ve gebelik8sırasında artış implantasyon site içinde bulundu. Onlar sitokinler kaynağıdır ve büyüme faktörleri gibi koloni uyarıcı faktör (CSF-1)9, tümör nekrozis faktör α (TNFα)10 ve prostaglandin (SY) E11.
Hamilelik boyunca ve terim emek önce decidua sitokinler ve kemokinler sorumlu anne periferik lökosit harekete geçirmek ve emek başlatmak için rahim dokuların içine sonraki geçiş için büyük bir kaynaktır. Hayvan çalışmaları gösterdi kadar fare decidua içinde düzenlenir, çok sayıda pro-inflamatuar sitokinlerin doğum sırasında gibi TNF-a, Il-6, IL-12 ve IL-1b12. İçinde insan decidua, pro-inflamatuar sitokinlerin IL-1b, Il-6 ve Il-8 (büyük nötrofil chemoattractant) sırasında emek değil emek13' te kıyasla daha yüksek ifade sergi. Bunlar salgılanan sitokinler sonuç bir harekete geçirmek ve lökosit akını decidual dokular14; decidual makrofaj ve nötrofil infiltrasyon her iki insan ve fare bir artış decidual infiltrasyon myometrial 4'e katlanmış büyük bir çağlayan bu iki bitişik rahim dokulara arasında etkinleştirme gösteren önceki dönem doğum sırasında görülür 15. bunlar lökosit infiltre PGs myometrium16eşzamanlı kasılmaları aktive yeteneğine sahip üretmek, membran başlatmak için matriks metalloproteinazların (MMPs) rüptürü17,18, hem de pro-inflamatuar sitokinlerin rahim etkinleştirme işlemi ('sitokin fırtına') yükseltmek için.
Decidual hücrelerinin, erken gebelik ve terim, vasıl belgili tanımlık harekete geçirmek-emek katılan maternal-fetal tolerans Bakımı implantasyon sürecinde kritik bir rol oynuyor gibi birçok önemli işlevleri nedeniyle farklı patolojileri sırasında ortaya çıkabilir gebelik. Örneğin, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve tekrarlayan gebelik kaybı nedeniyle (1) infertilite decidual olgunlaşma hatasından kaynaklanabilir; (2) intrauterin büyüme kısıtlama (IUGR) ve preeklampsi uygunsuz geliştirme ve decidua/plasenta veya decidual myometrial kavşağında güvenliği aşılan vasküler dönüştürme işlev bozukluğu nedeniyle; (3) erken doğum yanı sıra hangi erken decidual aktivasyon neden olabilir.
İnsan in vivo çalışmalar, etik ve pratik sınırlamalar ile birleştiğinde bu önemli bozuklukların ışığında birincil insan decidual hücre hatları kurulması vitro analiz amacı ile daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve gebelik komplikasyonları klinik yönetiminin iyileştirilmesi. Bu nedenle, bizim araştırma amacı insan birincil decidual hücreleri yüksek hücre verim ve dönem placentae fetal membranlar toplanan canlılığı ile yalıtım için izin veren bir protokol geliştirmekti. Decidual, belirli alt türlerinden yalıtma hangi hücreleri için bu geçerli protokol açıkça bir zaman ve cost effective yöntemi açıklanır var olmak kullanılmış için a değişiklik-in vitro analizler. Bereket karakterizasyonu ve fenotip terim ve karşılaştırma birinci veya ikinci üç aylık dönem için decidual alt nüfusun insan gebelik boyunca onların rolleri tanımlama için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution with calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution without calcium and magnesium</td><td>Prepared in facility (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaper pads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical scissors</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Large surgical forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastic disposable cell scraper (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (size 60 mesh) metal sieve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel with plastic handle (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filter (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Erythrocyte lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2, lyophilized powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Soy bean trypsin inhibitor, powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNase powder</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA powder)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA software</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated Vimentin antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-conjugated CD45 antibody</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Cytokeratin antibody</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Fixable Viability dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin primary antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin primary antibody</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 7 primary antibody</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 secondary antibody</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae

Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Decidual hücreleri, esas olarak decidualized stromal hücreler ve bağışıklık hücreleri, oluşan salgısı ve hormonal ve inflamatuar faktörlerin hangi başarılı blastosist implantasyonu, plasental gelişimi için kritik olan ve bir rol oynamak için sorumlu term ve preterm emek başlangıcında. Birçok gebelik komplikasyonları farklı hücre popülasyonlarının decidua oluşan ince bir denge tedirginlikler ortaya çıkabilir. Belirli decidual hücre tipleri oranındaki değişikliklere çok önemli bu işlemler bozabilir ve gebeliğin embriyo implantasyonu başarısız, intrauterin büyüme kısıtlama, preeklampsi gibi ciddi komplikasyonlar riskini artırmak ve Preterm emek. Burada özetlenen protokolü bir maliyet ve zaman birincil insan decidual hücrelerin izolasyonu için etkili yöntem dönem placentae fetal membranlar toplanan gösterir. Enzimatik sindirim ve decidual doku nazik mekanik bozulma birleştirerek, yüksek verim decidual hücre hemen hemen hiçbir koryon kirlenme ile elde edildi. Önemlisi, izole decidual hücreleri ile karakterize (stromal hücreler (55-%60), lökosit (% 35), epitel (% 1) veya (% 0.01) Trofoblast hücreleri) ve çok renkli görüntüleme Akış Sitometresi tahlil tarafından doğrulandı yüksek canlılık (% 80) yapılmaktadır. Bu iletişim kuralı için decidua parietalis belirli ve birinci ve ikinci üç aylık placentae için adapte edilebilir. Bir zamanlar decidual hücreler farklı decidual hücre alt nüfus içinde gebelik komplikasyonları rolünü anlamak amaçlayan deneysel uygulamalar için kullanılabilir.

Verimlilik ve izole hücre canlılığı doğrulamak için onlar iki yöntemlerle karakterize: Akış Sitometresi ve immunocytochemistry (ICC). 4 hücre popülasyonlarının hedef; pan-lökosit marker CD45 decidual bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanılan, cytokeratin epitel/endotel hücreleri algılamak için kullanılan ve son olarak, cytokeratin 7 herhangi algılamak için kullanılan decidualized stromal hücreler anti-vimentin antikor tarafından algılandı potansiye...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae at JoVE.com

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K Görüntüleme.  University of Toronto. Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Video: Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetik

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Gelişim Biyolojisi

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biyoloji

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Biyomühendislik

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Tıp

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...