This work was supported by the Dr. Werner Jackst&#228;dt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).

Hayvan deneyleri hükümet onayı ile yapıldı (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 ve G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım NIH Rehberi dayalı. 1. Hazırlık, mini-ozmotik pompalar ve <ol><li> Steril bir ortamda (yani., Hücre kültürü davlumbaz), pompa, kateter elde moderatör, beyin infüzyon kanülü ve aralayıcı diskler kullanılabilir (Şekil 1) akar. </li><li> Kanül iğnenin sadece ucu ventrikül ile temas halindedir ve böylece doğrudan ventriküller içine ilaçların verilmesi için tek bir boşluk disk kullanın. Baş aşağı forseps ile kanül tutun. Siyanoakrilat yapıştırıcı (CA) iki damla ekleyin ve bir boşluk diski tanıtmak. </li><li> Yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye kanül bırakın, böylece boşluk disk ve kanül kurudukça arasındaki tutkal. </li><li> Yaklaşık 2.5 cm bölümlerinde kateter kesilir. </li><li> Ea içinBu kateter içinde kabarcıkların oluşumunu önlemek için bunun içinde tamamen ve böylece tüm havayı ekstrüzyon pompa doldurmak için gerekli olacak kadar kanal pompası, ilgi konusu çözeltinin 300-350 ul az hazırlar. Kabarcıklar akışını engelleyecektir beyin içine çözeltisi. </li><li> Dikkatle akış moderatörlüğe kateter bağlayın. </li><li> Çözeltinin az miktarda, böylece bunun içindeki hava kabarcıklarını önlemek, pompa çıkana kadar beyin infüzyon kiti tarafından sağlanan iğnesine bağlanır 2 ml&#39;lik bir şırınga kullanarak, pompa doldurun. </li><li> Dikkatle akış moderatör doldurup dikkat kateter kateter içinde kalan kabarcıklarını engellemek için. </li><li> Pompa içindeki akış moderatör tanıtın. </li><li> Doldurulduktan sonra, dikkatli bir şekilde kateterin ucuna kanül bağlayın. Bir kabarcık kanül çıkarın ve dikkatli bir şekilde taşıyıcı veya ilaç solüsyonu ile kateter dolum ve daha sonra kanül yeniden gündeme oluşturulduğu görülmektedir edin. </li><li> Pu yerleştirinSteril tuzlu su çözeltisi ile bir kapta mp ve 37 ° CO / N de bırakın. </li><li> Implantasyon öncesi kabarcık oluşumu için tekrar kontrol edin. Gerekli (yani., Kabarcıklar izlenir) Eğer kanül kaldırmak ve tüp dolum. Kanül takın. Bu çözeltinin bir kaç mikrolitre almalıdır. </li></ol> Ozmotik 2. implantasyonu Pompalar Not: Bu deneyler hayvanların% 1 izofluran (% 30 O 2,% 70 N 2 O) ile anestezi yapıldı için. Bu mevcut değildir ancak eğer anestezi intraperitoneal kullanımı da 11 mümkündür. <ol><li> Anestezi altında stereotaktik cihazda hayvan bulun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin. </li><li> O aşkın kürk Cutmakas veya tıraş makinesi ile ya reklam. Cilde zarar vermeden mümkün olduğunca kesin. </li><li> Antibakteriyel ve fungisit özelliklere sahip% 70 etanol ve dezenfektan ile cildi temizleyin. </li><li> Bir neşter ile orta hatta biraz sağında 1 cm&#39;lik kesi açıp kafatası maruz. </li><li> Bir pamuklu çubuk ile kafatası temizleyin. % 70 etanol ile ıslatın ve kafatası üzerinde geçmek. Bu kafatası kurumaya neden olacaktır. </li><li> Kafatası ışığı kanaması varsa, herhangi bir kanama noktaları ortadan kaldırmak için bir cauterizer kullanın. Kan kanül yerleştirilir kez kemik üzerinde düzgün kurumasını CA önler. </li><li> Kanül implante edilecek kafatası noktasında bir işareti yapmak için stereotaktik aygıtı kullanın. Sol hemisfer koordinatlarına ventriküler infüzyon için -0.2 mm kaudal, bregmaya 0.9 yanal mm (Şekil 2A) bulunmaktadır. </li><li> Yavaşça 45 ° açı yaparak kafatası üzerinde matkap; Bu kazayla Brai girmesini engeller matkapn. Tekrar tekrar birkaç saniye matkap ve sonra delik ne kadar derin olduğunu kontrol edin. Kafatası inceltilmiş ama hala tam olarak nüfuz değil edildikten sonra sondaj durdurun. </li><li> Beyin tamamına erişim elde edilene kadar steril bir iğne ucu ile meninks kırın. Beyin zarar vermeyecek şekilde yavaşça çekin. </li><li> Bir pamuklu çubuk kullanarak% 70 etanol ile kafatası temizleyin. </li><li> Bir ön-kaudal yönde hayvanın derisinin altına düz bir forseps tanıtın. Pompa implante edilecek hayvanın sırtına deri altına alan açmak için forseps kullanabilir. Dış kateter ve kanül (Şekil 2B) ayrılan hayvanın sırtına Pompayı tanıtılması. Kaldırılır ve tespitin her türlü ihtiyacı yoktur kadar pompa bu konumda kalacaktır. </li><li> Dikkatle sonraki kanül iğne tutkal dört küçük damla koyun. </li><li> Dikkatle yanlara doğru hareket ettirmeden kafatası yoluyla iğne tanıtmak. 15-30 saniye konumda tutun uKanül, tamamen bağlı ntil (Şekil 2C.1). Bir ara disk kullanılmış ise bir kez yerinde, kanül dorso ventral yönde 2.5 mm ulaşacak. Düzgün takılı ise, kanül deneyin sonuna kadar kemiğe bağlı kalacaktır. </li><li> Çıkarılabilir sekmesinin üzerine bir parmağınızı yerleştirin ve sonra makas bir dizi (Şekil 2C.2) ile boynundan kesti diğer elinizi kullanın. </li><li> 5-0 sütür ile cilt üzerinde yara kapatın ve (Şekil 2D) enfeksiyonunu önlemek için yara üzerine povidon-iyot çözeltisi (PVP-I) ve bir kaç damla ekleyin. </li><li> Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymayın. İlaç uygulamaları sırasında kafeslerine yalnız pompalarla implante edilmiş hayvanları tutun. </li><li> Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın. </li></ol> 3. Pompa Removablel Not: Genellikle deney pompası tarafından izin verilen teslimat süresi sonunda sona erecek, ancak bir uyuşturucu teslim takip olarak ikincil deneyler yapmak için pompayı kaldırmak mümkündür. Yolu izli enjeksiyonları yapmak için bu pompayı kaldırmak ve böylece gereklidir. <ol><li> Anestezi altında seterotactic cihazda hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için koruyucu merhem gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin. </li><li> Dikkatle pompa implantasyon gününde yapılan kesiden keserek cilt açın. </li><li> Cerrahi kelepçe ile kanül tutun ve çekin. Kolayca kafatası çıkarılmalıdır. Nazik kanama beklendiği gibi, bir pamuklu çubuk yerleştirerek onu durdurmak ve 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Kateter pompayı dışarı çekin. Kendisio iterek cilt üzerinde baskı oluşturarak çıkıp lp. </li><li> 5-0 sütür ile tekrar yara kapatın ve PVP-I birkaç damla ekleyin. </li><li> Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir. </li><li> Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın. </li><li> Hayvan yolu tracer enjeksiyonundan geçmeden önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin. </li></ol> Sağ Motor cortex 45 ° Açılar at 4. Basınç Yolu Tracer Enjeksiyon <ol><li> Anestezi altında stereotaktik cihaz üzerinde hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin. </li><li> Baş yara açın. </li><li> C% 70 Etanol bir pamuklu bir bez kullanarak kafatası yalın. </li><li> Cihazın dikey tutucu bir 5 ul cam şırınga (26S ga) tanıtın. Cam tutucu alt uç tutucu parçasına tam olduğundan emin olun. O zaman dikey konumdan 45 ° yerleştirin ve enjeksiyon yapmak imkansız olacak gibi şırınga çok altında olmamalıdır. </li><li> Bregma üzerinden doğrudan şırınga yönlendirmek ve ardından istediğiniz koordinatları bulun. Point # 1: 0,5 mm rostral ve 2,5 mm bregma göre yanal motor korteks koordinatları bir enjeksiyon içindir. Point # 2: 1,34 mm rostral, bregma göre 2,5 mm yanal. </li><li> Koordinatları bulunduktan sonra, ince bir ucu ile bir işaretleyici ile kafatası üzerinde konumlarını gösterir. Doğru koordinat gizlemek olabilir aşırı mürekkep sürümü olarak kafatasında tek bir nokta yapın. </li><li> Dikkatle 45 ° matkap tutan kafatası matkap. Tam perf değildir, böylece adım 2.8 olduğu gibi, sık kafatası kontrolmatkap yol açtığı beyin hasarı önlemek için orated. Tüm kemik kaldırıldı emin olmak için bir şırınganın ucu kullanın. </li><li> Şırıngaya yolu izleyici seyreltme 600 nl yükleyin. </li><li> Hayvanın sağ tarafına doğru 45 ° dikey konumunu ayarlar. Mikroskop altında, sağ deliğin önünde şırınga en iğne ucu yerleştirin. </li><li> 1,5 mm dikey yönde hareket ettirin. Basınç enjeksiyonları yapmadan önce 30 saniye ile 1 dakika boyunca bu pozisyonda iğne istikrarlı edelim. </li><li> 30 saniye süre ile birbirinden ayrılmış 100 nl üç adımda izleyici seyreltme 300 nl enjekte edilir. Son enjeksiyondan sonra beyin akmaya izleyici önlemek için 30 saniye ile 1 dakika için sürekli şırınga bırakın. </li><li> Yavaşça, şırıngayı çekin ikinci deliğin üzerine taşınmaya ve şırınga içinde olan, kalan 300 nl aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> İkinci enjeksiyondan sonra, şırınga kaldırmak ve Wou kapatmak için devamnd ve 5-0 sütür ile PVP-I birkaç damla ekleyin. </li><li> Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın. </li><li> Hayvan kurban önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin. </li></ol> 5. Yolu Tracer Gözlem <ol><li> Kurumsal kurallarına göre tamamen hayvan anestezisi. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin. </li><li> Standart protokoller 6 altında PBS içinde% 4 paraformaldehid (pH 7) ile hayvanların serpmek. </li><li> % 4 paraformaldehid O / N daldırma yoluyla beyin ve sonrası düzeltme onu kaldırın. </li><li> Beyin lavaboya kadar% 30 sakaroz olarak beyinleri cryoprotect. Sonra beyinleri çıkarın ve 10 saniye Imme onları dondurmaksıvı nitrojen içinde rsion. Bölümler üretilmektedir kadar -80 ° C&#39;de beyinleri tutun. </li><li> Bir cryostate üzerinde kesit ile retrograd yolu tracer analizi ve anterograde yolu izleyici analizi için 40 mikron 20 mikron de bölümleri üretin. </li></ol> Not: FG etiketli nöronlar ultraviyole ışık uyarma altında beyaz hücreler olarak görülebilir. BDA elyaf 6,7 kontrastının arttırılması için bir avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi ve% 0.4 nikel ilavesiyle 3,3 &#39;diaminobenzidin ile O / N içerikli inkübasyon ile tespit edilir.

<ol>
	<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+protects+against+focal+cerebral+ischemia+via+mechanisms+involving+Usp14-dependent+REST+degradation.">MicroRNA-124 protects against focal cerebral ischemia via mechanisms involving Usp14-dependent REST degradation.</a> Acta Neuropathol. 126, 251-265 (2013).</li><li>Hoyo-Becerra, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Regulation+of+Depression-Associated+Genes+in+a+New+Mouse+Model+Mimicking+Interferon-alpha-Related+Depression+in+Hepatitis+C+Virus+Infection.">Rapid Regulation of Depression-Associated Genes in a New Mouse Model Mimicking Interferon-alpha-Related Depression in Hepatitis C Virus Infection.</a> Mol Neurobiol. , (2014).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, Unit 4.24 (2010).</li><li>Miao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+adiponectin+improves+neurobehavioral+outcomes+after+focal+cerebral+ischemia+in+aged+mice.">Overexpression of adiponectin improves neurobehavioral outcomes after focal cerebral ischemia in aged mice.</a> CNS Neurosci Ther. 19, 969-977 (2013).</li><li>Pellegrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+benefit+of+a+combined+strategy+using+erythropoietin+and+endothelial+progenitor+cells+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Therapeutic benefit of a combined strategy using erythropoietin and endothelial progenitor cells after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Neurol Res. 35, 937-947 (2013).</li><li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-acute+delivery+of+erythropoietin+induces+stroke+recovery+by+promoting+perilesional+tissue+remodelling+and+contralesional+pyramidal+tract+plasticity.">Post-acute delivery of erythropoietin induces stroke recovery by promoting perilesional tissue remodelling and contralesional pyramidal tract plasticity.</a> Brain. 134, 84-99 (2011).</li><li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+induces+contralesional+corticobulbar+plasticity+and+functional+neurological+recovery+in+the+ischemic+brain.">Vascular endothelial growth factor induces contralesional corticobulbar plasticity and functional neurological recovery in the ischemic brain.</a> Acta Neuropathol. 123, 273-284 (2012).</li><li>Hermann, D. M., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+brain+remodelling+and+plasticity+for+stroke+recovery:+therapeutic+promise+and+potential+pitfalls+of+clinical+translation.">Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery: therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation.</a> Lancet Neurol. 11, 369-380 (2012).</li><li>Overman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+ephrin-A5+in+axonal+sprouting,+recovery,+and+activity-dependent+plasticity+after+stroke.">A role for ephrin-A5 in axonal sprouting, recovery, and activity-dependent plasticity after stroke.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E2230-E2239 (2012).</li><li>Wolf, W. A., Martin, J. L., Kartje, G. L., Farrer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Fibroblast+Growth+Factor-2+as+a+Mediator+of+Amphetamine-Enhanced+Motor+Improvement+following+Stroke.">Evidence for Fibroblast Growth Factor-2 as a Mediator of Amphetamine-Enhanced Motor Improvement following Stroke.</a> PLoS One. 9, e108031 (2014).</li><li>Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intraperitoneal+injection+anesthesia+in+mice:+drugs,+dosages,+adverse+effects,+and+anesthesia+depth.">Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth.</a> Comp Med. 51, 443-456 (2001).</li></ol>

Bu maddede kullanılan mini-ozmotik pompalar üreten DURECT Corporation tarafından sağlanan üretim ve Açık Erişim yayın ücretleri.

Uzun yıllar boyunca, iskemik inme veya travmatik beyin hasarı gibi nörodejeneratif koşulları araştırma akut inme aşamasında nöronal canlılığı teşvik etmeyi amaçlamaktadır nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır. Kliniğe çevrilirken bulunmuştur ilaç tedavilerinin büyük çoğunluğu başarısız kemirgen modellerinde etkili olduğu bulunmuştur. Bu tedavi başarısızlığının nedenleri arasında, ancak fonksiyonel nörolojik iyileşme kalıcı sonuçlanan sürekli ilaç etkileri olmaması sınırlı değildir. Bu uzun vadede beyin yenileme teşvik stratejileri geliştirmek ve böylece önemlidir. Nöronal hayatta kalma promosyon yalnız başarılı inme kurtarma izin vermek için yeterli değildir, çünkü başarısız nöro çalışmaların çok sayıda tarafından önerilen, nöronal plastisite uyarılması son zamanlarda alanında büyük bir ilgi aldı. Ilaç dağıtım olan intraperitoneal enjeksiyon, kuyruk intravasküler i için araçlarnjection femoral enjeksiyon, tek stereotaktik beyin içine vektörlerin enjeksiyon ve mini-ozmotik pompalar ile sabit teslim sürdürdü. Pompa bir kanül yoktur, ya da biz beyne teslimat için gösterdiği gibi, organı yönlendirilmiş edilebildiği takdirde ikincisi, sistemik teslimat içerebilir. Mini-ozmotik pompalar hariç ve viral vektörlerin kullanımı, tüm diğer stratejiler dalgalı ilaç konsantrasyonları neden olacaktır. Uzun süreli deneyler için böylece sıklıkla enjeksiyonlarını alan strese hayvan göndermek için gerekli olur. BBB beyinde terapötik konsantrasyonları elde etmek için büyük bir protein ya da ilaç dozlarına ihtiyaç sonuçlanan kan protein veya ilaçların beyne alınmasındaki için önemli bir engel getirmektedir. Örnek Pellegrini ve diğerleri için. 30 g (300 g bir fare için 750 IU / gün), bir hayvan için 75 lU / gün eşdeğer bir dozda intraperitonal enjeksiyon yoluyla rhEPO teslim (2013) 5. Buna karşılık, rhEp teslim hedeflenenbeyne o bize 0,25 ul / saat sabit bir hızda büyük bir zaman ölçeği üzerinde iyileşme elde etmemizi sağladı başarılı inme kurtarma için çalışmamızda, sadece 10 IU / gün çok daha düşük dozda kullanmak için izin. Bu çalışmada biz, böylece BBB engellemeyi, ventrikül içine doğrudan plastisite teşvik protein rhEPO sunmak için kafatasına bağlı bir kanül mini pompalardan implantasyon yöntemini göstermiştir. Bu yöntem ile, rhEPO enfarktüs boyutunun azaltılması, glial yara oluşumunun azaltılmasına ve anjiyogenez indüksiyonu da dahil olmak üzere, bir dizi yolla, nörolojik düzelme sağlamıştır. rhEPO da nöronal hayatta kalma terfi ve Denerve kırmızı çekirdek ve yüz çekirdekleri karşı contralesional motor korteks gelen projeksiyonlar yükselmiştir. Liflerin filizlenme motor korteks (Şekil 4A ve 5A) içine anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyonuyla ortaya çıktı. Liflerin filizlenmesi için fonksiyonel bir korelasyon prmotor becerilerinin geliştirilmesi (Şekil 5B) tarafından ovided. Buna ek olarak, sistem izleyici enjeksiyon için aynı yaklaşım retrograd yolu tracer FG (Şekil 6B) enjeksiyonu ile talamo-kortikal bağlantıları meydana çıkarmak için uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Mini-ozmotik pompası hazırlanmasında, hedef noktası ve aralama kullanımını dikkate için kritik öneme sahiptir. Biz birlikte, 0.9 mm yanal, iğnenin çok uç verilen koordinatlarda ventrikül ile temas (-0.2 mm kuyruktaki bu yolla olduğu gibi 0.5mm 2,5 mm dorso ventral iğnenin uzunluğu azaltmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz Bregma saygı). Derin yapılar Araştırmanın hedefi olan ancak, daha sonra hiçbir pullar ihtiyaç duyulacaktır. Daha harici teslim noktası isteniyorsa Benzer şekilde, (yani., Korteks), daha sonra boşluk diskler gerekli olacaktır. Pompa kafasının çok yakın değildir bu yüzden MM&#39;nin hareketlerini engelleyecektir kateter, yeterince uzun olmalıdırse, aynı zamanda çok uzun zaman olduğu gibi bir kez implante aşırı uzunluğu böylece fare doğal hareketi ile kanül çıkarılması riskini artıran, kateter eğilmesine neden olabilir. Kateterin 2 cm bir bölümü hareketlilik ve implantın stabilitesi (Şekiller 1 ve 2) açısından çok iyi sonuçlar vermektedir. 37 ° CO / N pompanın Kuluçka pompa hemen implantasyon anında beyine ilaç pompalamaya başlamanızı sağlar. Mini-ozmotik pompa implantasyonu o kafatası düzgün kanül implante önce kurutulur sağlamak için kritik öneme sahiptir. Genellikle kuru kemik neden olacaktır% 70 Etanol ile temizlik, ama sürekli kanama tespit edilmesi halinde, bir cauterizer hafifçe kafatası dokunmadan tamamen kurur. Bu iğne giriş mümkün olduğu kadar dikey ve yavaş olduğundan emin olmak için önemlidir. Pozisyonda, ve tutkal kururken sonra, kanül üstünde parmak yerleştirme ov yanlara hareket etmesini önlerkafatası er. Özel bakım kanül yara ve yerleştirme verilmelidir. Bu kesi tam kafatasının orta hat üzerinde ama biraz sağ tarafında gerçekleştirilmez önemlidir. Yarayı kapatırken insizyon orta hattında yapıldığı takdirde, cilt ve böylece yara açılması riskini artırarak, overstretched olacaktır. Bir tarafa hafifçe kesi yaparak dikiş noktaları kanül en yüksek kesiminde uzak olmasını sağlayacaktır. Sonuç olarak orada dikiş noktaları daha az gerginlik olacak ve yara düzgün iyileşir. Hayvanlar yalnız kafesli ve özellikle implantasyon sonrası ilk 10-15 gün boyunca, her gün kontrol edilmelidir. Yara açılması durumunda, yaralar kısa sürede kapalı olması gerekir. Kanül çıkarılır veya hayvan enfeksiyon sunarsa, deney sonlandırılır için vardır. Kanülün yeniden implantasyonu tavsiye edilmez. Başarılı implantasyon doku reklamın yeterli miktarda kullanmak için çok önemlidirhesive (çok değil!) bu kemik alçaltır ve kanül çıkarılması riskini artırır olarak. Ancak, aynı zamanda kemiğe bağlı kanül tutmayacağını çok az yapıştırıcı kullanılarak. Mini-ozmotik pompalar Çözücü biyolojik olarak uyumlu olan, bu tek sınırlama olarak, maddelerin çeşitli içinde çözülmüş ilaç taşıyabilir. Buna ek olarak, hacim ufak olacak verilen (200 ul), bir deney için gerekli konsantrasyon uygun olup olmadığını tespit olmalı ve pompa içindeki çökelmesine neden olmaz. Anterograd veya retrograd ya izleyiciler ile izleme Yolu beyin bağlantısı ve plastisite incelemek için çok iyi kurulmuş bir tekniktir. Tek incelemek istediği beyin alanı hedefleme doğruluğunu sağlamak için enjekte dikkatli kullanımı stereotaktik çerçeveler verilmelidir (korteks enjekte ederken, yani korpus kallosum üzerinde enjeksiyon engellemek için). Tüm cerrahi müdahaleler için ve ağrıyı azaltmak için veinflamasyon, hayvanlar müdahaleden sonra üç gün / kg, günde bir kez 4 mg müdahale ve Caprofen önce 0.1 mg / kg Buprenorfin ile tedavi edilmelidir. Sonuç olarak, bu yaklaşım, zamanda beyin plastisitesi çalışmalar için uygun olan bir yöntem temsil yaralı beyinde protein ya da farmakolojik bileşiklerin etkisini incelemek için uygun bir araç sağlar.

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7. 
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Alzet miniosmotic pump. Model 2004.</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">000298</td>
			<td style="width:183px;">Drug container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Brain infusion kit 3 1-3mm</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">0008851</td>
			<td>Drug brain delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">Loctite&#160; 454 Prism gel&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Loctite</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td style="width:183px;">Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">75N glass syringe&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">87900/00</td>
			<td>Injection of tract tracers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Biotin Dextran Amine (10000 MW)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;">N-7167</td>
			<td>Anterograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Fluorogold</td>
			<td style="width:115px;">Fluorochrome, LLC.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Retrograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
			<td style="width:115px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">53311</td>
			<td style="width:183px;">Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of miniosmotic pumps and delivery of tract tracers to study brain reorganization in pathophysiological conditions

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

Biz 3 gün sonra başlayan 30 gün boyunca ozmotik pompalar (Şekil 1, Şekil 3) vasıtasıyla doğrudan beyne rhEPO teslim sonra sol striatum lezyon ve uyaran intraluminal sütür yöntemiyle orta serebral arter tıkanıklığı 30 dakika hayvanların teslim strok 6. Şekil 4 CB ve BDA enjeksiyonu ve izleyiciler enjekte edildi alana sonrasında takip edildi kortiko spinal kanalın şemasını göstermektedir. Biz sırasıyla rhEPO teslimat 14 ve 42 gün sonra kavrama gücü ve motor performansı (Şekil 5) bir iyileşme gösterdi. Sol striatum bir inme alınan hayvanların sağ motor korteksin içine BDA teslim olarak lifleri çimlenme başarılı boyama gösteren kırmızı ve yüz çekirdek düzeyinde orta çizgiyi motor lifler bir artış (Şekil 5) gösterdi miniosmot ile farmakolojik bir tedavi sonucuic pompalar. rhEPO tedavisi de yaygın astrositoz gecikmiş nöronal hayatta kalma artmış glial skar oluşumu azalır ve çalışılan dönemde 6 anjiyogenez arttı. Yolu izleyici enjeksiyon için aynı tekniği kullanarak başarılı retrograd yolu izleyici FG enjeksiyonu (Şekil 6) tarafından korteks bağlı talamik çekirdekleri algılayabilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Şekil Bu protokolde kullanılan mini-ozmotik pompa 1. Bileşenleri. Aralama disk, kanül ve çıkarılabilir sekme, kateter, akış moderatör ve mini-ozmotik pompa görülebilir. Tam olarak monte pompa yönü Şekil 2A görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ithin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Pompa implantasyonu kilit noktaları 2. Özeti Şekil. Yanında tam olarak inşa, mini-ozmotik pompa ile stereotaktik cihaz yerleştirilir (A), fare gösterilmiştir. Ok implantasyonu için seçilen koordinatları gösterir. (B) pompa hayvanın sırtında tanıttı ve sadece kanül dış yüzeyinde kalır edilmiştir. İmplantasyondan sonra baş kafatası önceden delinmiştir. (C) boy. (C.1) kanül konumuna ancak çıkarılabilir sekme kesilmiş edilmemiştir. (C.2) çıkarılabilir sekme kesilmiş ve dikiş arasında olmuştur Yara hemen başlayabilir. (D) yıldız 30 gün implantasyon (#) sonra, bir hayvan ile karşılaştırıldığında, bir son implante hayvan gösterir. Doğru yer zaman görüntüde gösterildiği gibi, yara prosedürü sonuna kadar kapalı kalmalıdır.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Şekil 3. korteks üzerinde implantasyon siteyi gösteren Nissl boyama. Küçük bir kesi, sol korteks (ok) kısmında görülebilir. Nüfuz alanının genişliği yaklaşık 50 mm. Karşılık gelen karşı taraftaki bölgede (*) ile karşılaştırıldığında Nissl boyama göre belirgin bir ciddi doku değişiklikler vardır. R: Sağ hemisfer. L: Sol yarım küre. Ölçek çubuğu = 300 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Şekil 4. YoluReitmeier ve ark., 6,7 ile daha önce yayınlanmış olan izleyici enjeksiyon stratejisi. (A) CB ise kontralateral motor korteks de yolu izleyici BDA için şematik belirten enjeksiyon siteleri enfarkte yarımkürenin motor kortekste enjekte edildi. Lifler gösterilen kırmızı çekirdeğe (gösterilmemiştir) ve yüz çekirdeğe (Şekil 5). (B) aşağıdaki motor korteks anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyon site takip edildi. Siyah ok BDA etiketli birkaç kortikal hücreler gösterir, oysa iğne izi gösteren kırmızı ok unutmayın. Cx: Cortex. CC: Korpus kallosum. V: Ventrikül. FN: Sakal çekirdeği. B Ölçek çubuğu = 200 mikron. Şekil 4A tür izni 6 çoğaltılamaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt = &quot;Şekil 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; RhEPO doğum sonrası enfarkte beyin Şekil 5. Kurtarma. (A) BDA contralesional motor korteks enjekte daha sonra yüz çekirdeğin seviyesinin (bregma -5.8 mm -6,3 mm) kortikobulbar lifleri tespit edilir. Her bir yarım küre üzerinde kesişme hatları orta hat ve ipsilesional ve contralesional yarımküre yönünde her satırı geçen liflerin paralel çizildi sayılır ve kortikospinal sistem toplam etiketlenmiş liflerin yüzdesi olarak ifade edildi. Araçlar + Eritropoietin contralesional yüz çekirdek Veri yönünde lif geçişleri arttı vardır - SD. Veriler en az önemli farklar testleri, §P &lt;0.05 araçla tedavi edilen iskemik olmayan fareler ile karşılaştırıldığında. (B) motor davranışı rota çubuk testinde el kavrama gücü ve koordinasyon bir iyileşme göstermiştir ve ardından tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. Veriler ortalama valu vardıres + - SD. Veriler, her zaman noktası için tek yönlü ANOVA / en az önemli farklar testleri, ardından iki tekrarlı ölçümler ANOVA ile analiz edilmiştir. §P &lt;pre-iskemik başlangıca kıyasla 0,05; * P araçla tedavi iskemik farelere kıyasla &lt;0.05. 5A ve B tür izni 6 ile yeniden üretilir Şekil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Şekil 6. Hedef yapıları Fluorogold (FG) enjeksiyonundan sonra ulaştı. (A) motor korteksin yanında FG enjeksiyon sitesi Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi. İğne parça ve birkaç etiketli hücreleri gösteren beyaz ok gösteren kırmızı ok Not Korteks. (B) FG motora yakın enjektekorteks VPL saptanır. Fi: fimbria. IC: İç kapsül. RT: Talamik retiküler nükleus. VPL: Talamik ventral posterolateral çekirdek. Ölçek çubuğu = 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions at JoVE.com

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

implantation-miniosmotic-pumps-delivery-tract-tracers-to-study-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Görüntüleme.  University of Duisburg-Essen. In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Video: Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Nörobilim

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Kronik yaygın Marmoset bütün kortikal Electrocorticographic dizide implantasyonu

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential for recovery based on clinical assessments alone. The functional integrity of the corticospinal tract is an important prognostic biomarker for recovery of UL function, particularly for those with severe initial UL impairment. This article presents a protocol for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. This protocol can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve UL motor recovery and outcomes after stroke. The protocol also forms part of the PREP2 algorithm, which predicts UL function for individual patients 3 months poststroke. The algorithm sequentially combines a UL strength assessment, age, transcranial magnetic stimulation, and stroke severity, within a few days of the stroke. The benefits of using PREP2 in clinical practice are described elsewhere. This article focuses on the use of a UL strength assessment and transcranial magnetic stimulation to evaluate corticospinal tract function.

This protocol is for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. It can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve upper limb motor recovery and outcomes and in clinical practice for predicting upper limb functional outcomes 3 months after stroke.

İnmeden Sonraki Bir Hafta İçinde Kortikospinal Yol'un Fonksiyonel Durumunun Belirlenmesi

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...