Tüm deneyler Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve Purdue Üniversitesi Laboratuar Hayvan Programı gözetiminde yapıldı. Bu çalışma sayesinde, Güvenilir Sinir Teknolojisi Programı kapsamında Dr Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) himayesinde Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Microsystems Teknoloji Ofisi (MTO) tarafından sponsor oldu Uzay ve Deniz Harp Sistemleri Komutanlığı (SPAWAR) Sistemleri Merkezi (SSC) Pasifik Hibe No N66001-11-1-4013. Yazarlar mikroskopi uzmanlık paylaşımı için Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, ve Kevin Eliceiri teşekkür etmek istiyorum.

Çözümler PH 7.4 &#39;de 9 g NaCl, 0.144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4,; g / l - Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış % 4 formaldehit - ml / l, 202 mL sodyum fosfat dibazik çözeltisi (0.4 M Na 2 HPO 4), 48 ml sodyum fosfat monobazik çözeltisi (0.4 M NaH 2 PO 4), 500 ml% 8 formaldehit çözeltisi, 250 ml Milli- pH 7.4 &#39;te Q DDi su, 7.5 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.06 g KH 2 PO 4, 0.13 g Na 2 HPO 4, 2 g glukoz, 2.4 g HEPES, 0.05 g MgCl2; g / l - Hepes Sodyum Azid (HBHS) ile Hank Tamponlu Salin 6 kısım H2O, 0.05 g MgSO4 7 kısım H2O, 0.165 g CaCl2, pH 7.4 &#39;de 0.09 g NaN3 Yıkama Çözeltisi (WS) - 1% Vol / Vol, Normal Keçi Serum,% 0.3 Triton sodyum azid (NaN 3) ile HBHS X-100,. 4 ° C de daha sonraki adımda kullanım öncesinde WS buzdolabında. U2 Sca l e Çözelti - 4 M üre,% 30 gliserol ve% 0.1 Triton X-100, 17 PROSEDÜRÜ Tüm deneyler Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve Purdue Üniversitesi Laboratuar Hayvan Programı gözetiminde yapıldı. 1. Cerrahlık <ol><li> Çeşitli aseptik cerrahi yöntemler sunulmaktadır histolojik yöntem ile uyumludur. Bir stereotaksik çerçeve ve otomatik inserters kullanımı stereotaksik düzlemlerine göre tekrarlanabilirliği ve mikroelektrot diziler (MEA) kontrolünü implantasyonu açısını iyileştirmek için tavsiye edilir. </li></ol> Not: aşağıdaki gibi bu tanıtımda bizim cerrahi yöntem: stereotaksik earbars whil kemirgen konu tutunizofluran anestezi altında e (% 1-3 arası) tıbbi sınıf oksijen taşıdı. Bir ayak tutam eksikliği için test hayvanın tamamen uyuşturulduktan onaylamak için fareyi bir kuyruk tutam refleks sıçan veya eksikliği yansıtıyor. Göz merhemi sürün ve Betadine ve etanol üç alternatif yıkar ile cerrahi alan temizleyin. Ellerinizi yıkayın, şafak cerrahi eldiven, saç filesi, yüz maskesi ve cüppe. , Cerrahi alanı uyuşturmak makas veya kemik kazıyıcı ve pamuk aplikatör ile bir neşter, net periost kullanarak bir kesi oluşturmak ve bir diş matkap Handpiece ve matkap ucu kullanarak bir kranyotomi oluşturmak için Lidokain bir bolus enjekte edilir. Bir mikromanipülatör kullanarak korteksin içine tek-şaft MEA sürün. Aseptik cerrahi koşulları sürdürmek bir cerrahi asistanı yardımı var ve ameliyat ilerleme belge. <ol start="2"><li> Beyin içine MEA implantasyonu takiben, b etrafında kafatası nihai kaldırılması bilgilendirmek için cerrahi bir mikroskop aracılığıyla görüntüler toplamakyağmur. Cihazları İmplante kısımları in situ olarak korunur. </li></ol> Not: Yerinde cihazlar ile doku nihai koleksiyonu yakından doku kesit düzlemi ile cihazın yerleştirilmesi düzleminde eşleşen dayanmaktadır. Beyin göre aygıt ekleme düzlemi ile ilgili ayrıntılı notlar bu nedenle çok önemlidir. <ol start="3"><li> Cihaz yerleştirildikten sonra açıkta MEA Shanks veya kablo etrafına, silikon elastomer Kwik-Sil (TEFE) uygulayın ve kürlenmesini bekleyin. Böyle bir kesik bir pipet ucu gibi bir steril plastik bir parça, sertleştirme sırasında küçük bir kranyotomi iyi etrafında silikon elastomer içeren yardımcı olmak için kullanılabilir. </li><li> İki parçalı bir katman Kwik-Sil fazla dental akrilik (&quot;Jet Sıvı içinde&quot; ve Lang Diş gelen &quot;Jet Toz&quot;) ve açıkta kafatası uygulayın. </li></ol> Not: daha sonraki bir adımda, headcap ayrılması için bir implant için izin vermek için eritilerek yoluyla olacaktırkafatası. Bu çok sert akrilik sonra kaldırmak için zor olduğu gibi UV ile kür alan akrilik, Kwik-Sil ve kraniotomi üzerinde kaçınılmalıdır. Implant çevresindeki Görme opak malzemeler de kaçınılmalıdır; net Kwik-Sil Bu protokolün müteakip adımları esnasında implantın bir görünüm sağlar. <ol start="5"><li> Hayvan refahı düzenlemeleri yerel protokol gereği gibi post-operatif bakım yordamlarını uygulayın ve tek yer kafes kutularına ambulatuar dönün. </li></ol> 2. Perfüzyon ve Doku Koleksiyonu Not: Gage ve ark. sıçan hayvan modelinde 19 ayrıntılı bir perfüzyon prosedürü walkthrough için. <ol><li> Kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış anestezi ve perfüzyon protokolü kullanın. Derinden kemirgen (fare ya da fare kuyruk tutam refleks ayak tutam refleksi eksikliği ile onaylanır) anestezi ve kalp açıkladıktan sonra, sığ makas kesim yapmaksol ventrikül ve sağ atrium. Sol ventrikül içine künt iğne takın ve oda sıcaklığında PBS teslim. Az ~ 10 ml PBS&#39;lik toplam bir teslim ~ 5 ml / dak, farelerde ve ~ 200 ml PBS ~ az 100 ml / sıçan dak. Sırasında karaciğer kan izni için bak. </li><li> Yani istenirse kabarcıkları tanıtma önlemek için alınan bakım ile şırınga ile, transkardiyal histolojik ilgili kimyasal etiketleri enjekte. </li></ol> Not: Vasküler etiketler (örneğin, DII) ve nükleik asit counterstain boyalar (Hoechst 33342 gibi) perfüzyon sırasında verilebilir kimyasal etiket örnekleridir. Doğru uygulandığında, bu histolojik işaretleri tüm hayvan 20 etiketlemek gerekir. <ol start="3"><li> Tamponlu, oda sıcaklığında, hayvan düzeltmek için transkardiyal% 4 formaldehit sunun. Perfüzyon sırasında akciğer-burun drenajı ile kanıtlandığı edilebilir kalp genelinde septum perforasyonu kaçının. Büyük kaslar fiksasyon titreme arayıntam perfüzyon gösterir. Az ~ 10 ml sabitleştirici toplam sunun ~ 5 ml / dak ve farelerde de ~ ~ 200 ml sabitleştirici 100 ml / sıçan dak. </li><li> Perfüzyon takiben, hayvan başını kesmek 4 ° C&#39;de beyin sapı veya gece boyunca% 4 formaldehit solüsyonunda rongeurs veya makas ve bir yerde kafasını kullanarak beyincik kısmı açığa </li><li> Yıkamalar arasında 1-4 saat ara ile PBS üç değişiklikleri kafa yıkayın. </li><li> Günler veya aylar boyunca 4 ° C de sodyum azit içeren HBHS içinde sabit kafaları saklayın. </li></ol> 3. In situ Cihazlar ile Beyin Kaldırma Not: Uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek bir davlumbaz bu bölümde gerçekleştirin. Periyodik çözüm HBHS için sabit kafa iade ederek doku kuruma kaçının. <ol><li> Forseps ve küçük makas kullanarak akrilik kafatası kap yerinden deri ve diğer dokular dikkatle uzak teşrih. </li><li> Isı-i giyildiğinsensitive eldivenler, diş akrilik kaldırmak ve Kwik-Sil (Şekil 2a) açık yatan bir alanı göstermek için bir havya kullanın. </li></ol> Not: Bu adımın amacı beyne yerleştirilmiş bileşenleri kafatası sabitlenmiş parçalar ayrı olabilir, böylece mikro makas implante cihazları beyin girmek pozisyonları erişim uygun bir açı sağlamaktır. <ol start="3"><li> Cerrahi mikroskop altında, cihazların beyni girdiğiniz konuma cımbız ile Kwik-Sil küçük parçalar aşağı kaldırarak, kavisli mikro-makas ile silikon elastomer içine kesti. </li><li> Beyin implante bileşenleri polisilikon ve kafatası bağlanan ayrı bir aygıt bileşenlerinin kavisli mikro makas ile kranyotomi yüzeyi boyunca kesme devam edin. Maruz kalan cihazın parçaları aracılığıyla keserken Yine imp itme veya sürükleyerek önlemek için dikkat çekici, mikroskop büyütme ve büyük bir dikkatle kullanınsabit doku içinde lants. </li><li> Rongeurs kullanarak dikkatle headcap çevresindeki kemik çıkarın. Kafatası implante cihazlarıyla beyin ayırmak için bir spatula kullanın. Dilim hazır olana kadar HBHS çözüm beyin saklayın. </li><li> HBHS ile dolu bir cam Petri kabındaki beyin yerleştirin ve cihazın implantasyonu konumunuza uygun olup olmamasına bağlı olarak, spinal kord, serebellum veya koku ampul gibi, yabancı doku kaldırmak için bir jilet kullanın. Bölüm beyin için bir beyin blok (Ted Pella) ve tıraş bıçağı kullanma ve yakından Kullanılan cihazların açı uygun düz bir düzlem oluşturma; bu gibi herhangi ki beyin yönlendirilmesi, bir uygun büyüklükte bir beyin blok beyin yerleştirilerek gerçekleştirilir İmplantın görünür kısmı jilet kılavuzu ile paralel olduğunu ve bir bıçak kılavuzu implant en az 2 mm bir jilet yerleştirerek. Doku ile jilet basın. Bir vibratome platformu için bu yüzeye monte edin. Alternatif olarak, bir jilet yakından implantın yönüne uygun bir düzlem oluşturmak üzere beyin blok olarak bir benzer bir şekilde kontrol edilen bir şekilde kullanılabilecek bir mikromanipülatör monte edilir. </li><li> Sıra vibratome platform altında buz ve, doku yüzeyinin kısaca bir kağıt havlu üzerinde kurumaya izin verildikten sonra, Super Glue kullanarak vibratome için beyin uygun. Tutkal önceki adımda oluşturduğunuz düz doku uçağı sahne olduğunu. Asimetrik doku boyutlar ile, kablonun en geniş boyut potansiyel fazla doku vurma bıçak önlemek için vibratome bıçağın hareket yönüne paralel olarak yapıştırılmış, bu gibi numune. Tutkal setleri sonra (~ 1-2 dk), eklemek soğutulmuş (~ 4 ° C) doku çevresindeki vibratome çanak PBS. </li><li> Ho 10 ° &#39;lik bir bıçak açısı ile maksimum titreşim hızı (~ 100 Hz) ve yavaş bir bıçak ilerleme hızı (saniye başına &lt;0,2 mm) kullanarak, kontrol doku dahil 200-400 mikron arasında kalın bir doku dilim toplayınYHTKIP. 4 at 24 de plaka HBHS bir fırça veya kaşık spatula ve mağaza ile dikkatlice dilimleri toplayın ° C. </li><li> Yerinde cihaz çıplak gözle veya cerrahi mikroskop görünür sonra, 100 mikron veya daha az dilim artışlarla cihazı yaklaşım ince kesitler toplamak. </li></ol> Not: Tipik silikon mikro-implant cihazı yüzeyinden 300 ve 500 mm arasında formaldehit ile fikse kemirgen serebral korteks dokusunda çıplak gözle görülebilir. <ol start="10"><li> In situ cihaz şu anda doku yüzeyine yakın olan aygıt içinde içeren bir&gt; 250 um doku dilim toplamak. Gerekli kalınlığa tahmini önceden toplanmış dilimleri referans ile destekli olabilir. </li></ol> Not: Büyük cihazlar, multishank cihazları ve açılı cihazlar kalın doku dilim (&gt; 500 mikron) bir doku parça yakalama aygıtı gerekebilir; yenidenuygulanan etiket penetrasyon ve mikroskobu görüntüleme derinliği de bu çok kalın dilimler gelen nihai veri toplama sınırlı olacağını üyesi. Eğer mümkünse bu doku ve morfolojik deformasyon sayesinde cihazın sürükleyerek neden olabilir, vibratome bıçak cihazı çarpıcı kaçının. 4. Doku İşleme ve Takas <ol><li> HBHS içinde yıkama başına 5 dk 3x dilim yıkayın </li><li> 30 dakika toplam (15 dakika dilim her iki tarafında) (5 mg NaBH4 / HBHS, 1 ml) içinde sodyum borohidrid inkübe edin. Paslanmaz çelik veya Teflon kaplı mikro kaşık ve küçük bir fırça (Ted Pella) kullanarak dilimleri çevirin. Yavaş ve düşünceli hareketleri her dilim flip başarısını artırmak. Fırça ile implante cihaz etrafında herhangi alanlar dokunmaktan kaçının. Mümkün olduğunda, gerekli (&gt; 2 ml) göre anlamlı olarak daha çözeltisi ilave bir daha kolay doku dilimleri işlemek ve çevirmek için izin verir. </li></ol>Not: Bu adım otofloresans endojen azaltır; floresan etiketler perfüzyon sırasında uygulanan veya xFP transgenik işaretleri mevcut olsaydı bu adımı atlayın. <ol start="3"><li> Oda sıcaklığında Yıkama Çözüm yıkama başına 5 dk 3x dilimleri yıkayın. </li></ol> Not: yıkama ve İnkübasyon sırasında Ajitasyon isteğe bağlıdır. Yazarlar çevredeki beyin dokusu ile ilgili sert implantın sarsıcı ince ajitasyon oluşabilir spekülasyon. Çözümler hareket kabiliyetini arttıran Bununla birlikte, bir yumuşak oranı (&lt;60 rpm) hareket eden bir orbital karıştırıcı bu önlemek olabilir. <ol start="4"><li> Oda sıcaklığında (kapak dilimler bir saat sonra) yıkama çözeltisi içinde 2 saat için engelleme. </li><li> 4 ° C&#39;de yaklaşık 48 saat (dilim her iki tarafında 24 saat) için primer antikorlar (yıkama çözeltisi içinde seyreltilmiş) içinde inkübe </li><li> Yıkama Çözeltisi ile 6 hızlı 3 dk yıkama yapın. </li><li> 6, 1 saat yıkar (3 yıkama gerçekleştirmeYıkama Çözüm doku dilim her tarafında es) (4 mağaza ° C yıkama gecede varsa). </li><li> 4 ° C&#39;de yaklaşık 48 saat (her bir yan üzerinde 24 saat) için ikincil antikor (yıkama çözeltisi ile seyreltilmiş) içinde inkübe </li><li> Yıkama Çözeltisi ile 6 hızlı 3 dk yıkama yapın. </li><li> Gecede yıkama eğer 4 mağaza ° C; Yıkama Çözüm 6, 1 saat yıkar (her tarafta 3 yıkar) gerçekleştirin. </li><li> Takas çözümü - Çözüm yıkayın ve gliserol tabanlı &quot;Sca l e U2&quot; Kaldır eklentisi. 4 ° C&#39;de çok kalın doku kesitlerinde (&gt; 500 mikron) için kalın dilim (250-500 mikron) veya 2-3 hafta boyunca yaklaşık 1 hafta temizlemek için izin ver </li><li> 4 ° C&#39;de folyo ve mağaza ile Rozet </li><li> Montaj medya olarak takas çözümü kullanarak ve net oje ile sızdırmazlık kalınlığında doku kesitleri (Şekil 2b, 2c) accomodating slaytlar monte edin. ° C ışıktan uzak 4. depolayın. </li></ol> 5. Tam Ti Panorama Görüntülemessue ve Aygıt Arabirimi <ol><li> Uzun çalışma mesafesi mikroskop hedefleri (&gt; 2 mm) kullanarak, konfokal mikroskop veya 2-foton mikroskop tarama lazer görüntüleme başlar. Biz Zeiss LSM 710, Carl Zeiss &quot;Zen&quot; yazılım (2010), ve görüntü bir implant etrafında 3D panorama için bir bilgisayar kontrollü XY çeviri aşaması ile gösterecektir. </li></ol> Not: objektif bir düzeltici yaka yoluyla yazılım temizleme solüsyonu, kırılma indeksi için doğru ya da toplandıktan sonra veri işleme. Bu gösteri biz Leica Zen mikroskop yazılımı içine 1.4 &quot;U2&quot; takas çözümü için bir kırılma indisi değer girin; bu ayar kurnazca kırılma endeksi uyuşmazlığı için hesap z adım aralıklarla ayarlar. <ol start="2"><li> Cihazın yanına dokusunda, kabaca düşük lazer güç (~ 0 kullanarak her floresan kanal için z boyutu uygun z ekseni pencere ve veri toplama ayarlarını değerlendirmek0,5-5%) ve büyük z-adım boyutları (&gt; 25 mikron). </li></ol> Not: Panoramik veri toplama için kurarken doku cam dia (~ 20 mikron her yöne) tamamen düz bir yalan olabilir, z-ekseni ayarlarken üstünde ve altında ek boşluk ekleyin. <ol start="3"><li> Sizin nihai panorama xy merkezinde hedefi ayarlayın; Zen panorama yazılımı kullanarak, ilgi bölgenizdeki kapsayacak şekilde her bir eksen (x ve y) için gerekli toplama pozisyonların sayısını belirlemek. </li><li> Yeniden değerlendirmek ve z ekseni toplama penceresinden sonuçlandırmak. </li><li> Elle artan derinliği ile uygun rampa dedektör hassasiyeti ve lazer gücünü ayarlamak, amacı doku dilim içine bakılmaksızın görüntüleme derinliği yaklaşık aynı görüntü yoğunluğunu korumak için, ancak yüksek arka plan gürültü önlemek için de tipik olarak. </li><li> Her floresan görüntü veri serisi toplayın. Sinyalleri çakışmasını önlemek için gerekirse lazer satırını çalıştırınsırayla s. </li></ol> Not: Eğer mümkünse, otomatik toplama sırasında sabit disk verileri kaydetmek için yazılım ayarlanır. <ol start="7"><li> &quot;Yansıma&quot; ve &quot;geçirgenlik&quot; veri toplamak için yazılım ayarlarını değiştirin ve bu kanallar yakalamak için daha uzun, daha keskin dalga boyunda lazer (örneğin 633 nm) kullanın. &quot;Yansıtma&quot; ve &quot;geçirgenlik&quot; koleksiyonu için uygun lazer güç ve dedektör hassasiyeti belirleyin ve implante cihaz etrafında aynı koleksiyon serisi tekrarlayın. </li><li> Daha sonra işleme, ölçme ve analiz için veri verir. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwartz, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Neural+Prosthetics.">Cortical Neural Prosthetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).</li><li>Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+Insight:+future+neuroprosthetic+therapies+for+disorders+of+the+nervous+system.">Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system.</a> Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).</li><li>Rousche, P., Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+recording+capability+of+the+Utah+Intracortical+Electrode+Array+in+cat+sensory+cortex.">Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).</li><li>Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal,+longitudinal+assessment+of+intracortical+microstimulation.">Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation.</a> Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).</li><li>Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+in+auditory+cortex+provides+a+substrate+for+detailed+behaviors.">Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors.</a> Hearing Research. 210, 112-117 (2005).</li><li>Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+planar+multisite+microprobes+in+recordingextracellular+single-unit+intracortical+activity.">Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+interface+between+neural+tissue+and+chronically+implanted+intracortical+microelectrodes.">Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes.</a> IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).</li><li>Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+impedance+spectroscopy+for+monitoring+tissue+responses+to+inserted+neural+implants.">Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants.</a> J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).</li><li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes.">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li><li>Szarowski, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+responses+to+micro-machined+silicon+devices.">Brain responses to micro-machined silicon devices.</a> Brain Research. 983, 23-35 (2003).</li><li>McConnell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+neural+electrodes+cause+chronic,+local+inflammation+that+is+correlated+with+local+neurodegeneration.">Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration.</a> J. Neural Eng. 6, 056003 (2009).</li><li>Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intact+interface+between+neural+tissue+and+implanted+microelectrode+arrays.">Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays.</a> J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).</li><li>Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-film+silica+sol-gel+coatings+for+neural+microelectrodes.">Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).</li><li>Wilks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(3,4-ethylene+dioxythiophene)+(PEDOT)+as+a+micro-neural+interface+material+for+electrostimulation.">Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation.</a> Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+voltage+biasing+improves+unit+recordings+by+reducing+resistive+tissue+impedances.">Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances.</a> IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).</li><li>Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+pulses+change+neural+interface+properties+and+improve+unit+recordings+with+chronically+implanted+microelectrodes.">Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+characterization+of+the+brain-microdevice+interface+using+Device+Capture+Histology.">In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li><li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Tissue+Fluorescent+Imaging+in+Scattering+Specimens+Using+Confocal+Microscopy.">Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).</li><li>Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Biasing,+Cyclic+Voltammetry,+&amp;+Electrical+Impedance+Spectroscopy+for+Neural+Interfaces.">Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces.</a> J. Vis. Exp. (60), e3566 (2012).</li></ol>

Yazarlar, mali ya da başka ilan etmek hiçbir ilgili açıklamaları var.

Burada gösterilen &quot;Cihaz Yakalama Histoloji&quot; (DCHist) yöntemi, beyin dokusu ve doku implantları arasındaki morfolojik korunmuş etkileşimlerin yakın histolojik değerlendirmesine olanak tanır. DCHist doku toplama beyin implante bileşenleri kafatası monte edilmiş bir aygıt bileşenlerinin dikkatli bir şekilde ayrılması gerekir. DCHist de, kalın bir histolojik doku dilim (&gt; 250 um) toplanması gerekmektedir. Bu doku kesitlerinde, bir kez, etiketli temizlenmiş, monte, ve görüntülü, implantasyon yaralanma veya kalıcı cihazlar izleyen kronik tepkisi konusuna yeni bakış açıları sağlayabilir. Şekil 3-5 de gösterildiği gibi ileri mikroskopi araçları kullanarak, doku ve cihaz arasındaki arayüz imaged olabilir ve yüksek detaylı olarak incelenmiştir. Mevcut formunda sunulan teknikler yavaş yavaş aşağı cihazın implantasyonu noktasına iki parçalı diş çimento ve Kwik-Sil yapılan headcap uzakta kazmaya yeteneğine güveniyor.Uzaklıkta yanmış veya başka çıkarılabilir diş çimento ve küçük makas görsel ölçüde başarıyla kafatası monte bileşenleri implante cihaz ayıran yardımcı rehberlik hangi aracılığıyla açık bir silikon elastomer kullanılması. In situ onu toplamak için kafatası altı ve beyin yukarıda cihaz kesmek çalışmak kafatası monte edilmiş bir implant beyin, önemli miktarda çıkardı edileceği gibi, tavsiye edilmez. Böyle NeuroNexus Technologies tek saplı ÇÇA&#39;lar gibi ince, daha küçük implantlar, DCHist en müsait olmasına rağmen, ilkeleri tek bir cihaz Shanks veya mikroelektrot diziler ile sınırlı değildir. Toplama ve görüntüleme stratejilerini gereksinimleri herhangi bir kafatası montaj ayrılmış ve kalın bir doku bölüm içinde toplanması gerektiğini olmanın, multi-şaft cihazları ve kanüller gibi büyük implantlar geniş uygulanabilir. Yazarlar doku analizi üzerinde duruldu rağmenÇevre kortikal implantlar, beynin derinliklerine tahrik cihazları da toplanan ve yansıması olabilir. Implant yerleştirme ve derinlik cihaz ekleme bilinen açıdan vahşice sapma şartıyla bir dilim içinde implant yakalama etkilememelidir. Sınırlamalar DCHist yöntemin yararlı bir uygulama için mevcuttur. Optik temizleme çözümleri büyük ölçüde çeşitli dokularda 21 görüntüleme derinlikleri artırabilir ancak Beyin doku kesitlerinde, özellikle beyaz cevher alanlarında, mikrometre yüzlerce görüntü meydan okuyorlar. İlave görüntüleme derinlik arttırmak için, iki-foton uyarılması tarif edilen optik mikroskopi temizleme ile birlikte kullanılabilir. Tarif edilen yöntemin bir başka potansiyel sınırlama araştırmacılar tarafından kullanılan özel floresan immünohistokimya yöntemler ve antikorları olabilir. Pasif difüzyon genellikle sabit dokusu ile bu belirteçlerin eklenmesi sürücülerve antijen bağlama siteleri üzerine. Final antikor çalışma konsantrasyonları arka etiketleme yüksek düzeylerde kaçınarak etiketi penetrasyonu maksimize vaka bazında bir durumda ilgili araştırmacılar tarafından tespit edilmelidir. Antikor etiketleme aynı işlenir dilimleri arasında değişken olmamalıdır, ancak farklı antikorları bazı antikorlar kolayca antijenleri mikrometre sadece onlarca derin antijenleri etiketlenmesi birçok derin yüz mikrometre ve diğer etiketleme ile antijen nüfuz ve etiketlemek için yeteneklerini önemli ölçüde değişebilir. Biz uygulama birden fazla gün için, tipik konsantrasyonları daha yüksek de antikor etiketler ekleyerek bu difüzyon iyileştirilmesi ve seyreltik deterjan içeren ve serum engelleyen bir çözüm. Tanımlayınız Periyodik dilimleri saygısız dahi etiketleme destekler. Antijen alma adımları ve alternatif fiksasyon süreçler (örneğin glutaraldehid, mikrodalga, vb) belirli antijenleri için uygun olabilir. İkincil antikor-fluorochBu Invitrogen Alexa Fluor etiketleri kullanarak yazarlar tarafından gözlenmemiştir olsa rome konjugatları da kalın kesitler etiketleme performans değişebilir. Alternatif olarak, ilgi hücre tiplerinde floresan protein eksprese eden transgenik hayvan deneklerin, antikor etiket penetrasyon ile ilgili sorunları önlemek için kullanılan olabilir örneğin eGFP gibi birçok floresan protein olarak, formaldehit ile tedavi sonrası floresan korumak ve doku kesitlerinde hemen görüntülenebilir. DCHist beyin dokusu üzerine implante Mikrocihazların etkisini yakalamak ve analiz etmek için teknikler güçlü bir kümesidir. Elektrofizyoloji kalitesi ve elektrot empedans verileri 22 in vivo değerlendirilmesi ile bu histolojik protokol Coupling ölçüde fizyolojisi değişkenliği ve bozunma biyolojik kaynaklarının anlayışımızı artırabilir. Özellikle implant sinir protez cihazları alanında detaylı DCHist ima yararlanabilirbiyolojik nötr MEA cihazların geliştirilmesi bilgilendirmek için sağlam cihaz / doku arayüzünün ging.

Neuroprosthetic araştırma alanında cihazlar 1,2 arabirim MSS yoluyla vücudun hastalıklı yada hasarlı yapıların atlayarak çeşitli engelli ve rahatsızlıkları olan kişilerde yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Böyle mikroelektrot diziler (ÇÇA&#39;lar) gibi beyin-implante Mikrocihazlarda, kaydedebilir veya teşvik beyin yapıları, ve böylece elektronik ve MSS dokusu 3-5 arasında uzun dönemli arabirimler kurulmasına izin vermek için kullanılabilir. Penetran ÇÇA&#39;lar, beyin dokusu içine sürülür cihazları, onlar yakın nöronlar 6 nispeten küçük bir dizi elektrot sunmak, içinde yakınlığı nedeniyle çift yönlü arayüzleri olarak özellikle sözü tutun. Ancak, penetran ÇÇA&#39;lar ve uzun vadeli implantasyonu kompleks yumuşak doku tepkileri sonucu, genellikle ay gün boyunca değişken ve giderek aşağılayıcı elektrofizyolojik sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanan ve elektrik imped bir artışElektrot bölgelerinde ve toprak 7,8 arasındaki ance. Bu değişikliklerin olası kökenleri mikroglia aktivasyonu, Mikrocihazlarda boyunca reaktif astrositoz ve implante cihazlar 9-11 çevreleyen dokudan nöronların kaybı veya göç almaktadır. Kronik, penetrasyon ÇÇA&#39;lar etrafında bu doku değişiklikleri anlamak için büyük bir meydan okuma kronik implante cihazlarda 12 çevredeki sağlam doku arayüzünün histolojik verileri yakalayan zorluk. Hala mevcut cihaz / doku arayüzü ile doku histolojik analizi Geçerli aygıt kaldırma histolojik protokolleri geliştirmek istiyorum. Doku içinde kalan deliksiz bir cihaz ile, bu gibi biyo uyumlu kaplama 13,14 ya da 15,16 elektrot yüzey arasında elektrik açıklığın kullanımı gibi nispeten ince etkileşim, biyolojik etki yansıması olabilir ve implant ile ilgili olarak incelenmiştir. Here biz toplamak için yöntem, süreç ve görüntü çevreleyen beyin dokusunun ayrıntılı mikroskopi tabanlı analiz için sağlam microdevice arabirimi göstermelidir. Bu yöntem, aygıt ve beyin dokusu çevresindeki bir vibratome kullanılarak kalın (&gt; 250 um) doku bölümü içinde toplanır. Bu kalın dilimler halinde histolojik etiketi penetrasyonunu artırmak için, floresan histokimyasal ve immünohistokimyasal etiket birden fazla gün için engelleme serum ve deterjan içeren solüsyonlar yüksek konsantrasyonlarda uygulanır. Bir optik temizleme solüsyonu mikroskobu görüntüleme derinliklerinde iyileştirmek için kullanılır ve doku konfokal mikroskopi 17 tarama sonraki lazer için 2 taraflı odalarına monte edilir. Tam histolojik arayüzü yakalamak için, bilgisayar kontrollü translasyon aşamasında implantların uzunluğu boyunca z yığın panoramalar toplamak için görüntüleme sırasında kullanılır. Görüntüleme yanı sıra implantlar geri lazer yansıma toplanması, doku etiketleri uygulananve doku yardımı ile her ikisi de transmisyon ışığı çevreleyen doku ile ilgili olarak, cihaz arabirimi yerleşir. Doku Bu &quot;Aygıt Yakalama Histoloji&quot; kullanılarak hazırlanmıştır (DCHist) protokolü morfolojik korunmuş doku / cihaz etkileşimler görüntüleme erişim sağlar ve böylece önceki aygıtın kaldırılması histolojik protokolleri 18 geliştirir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> DNA işaretleyicisi </td></tr><tr><td> Tavşan anti-Iba1 </td><td> Wako (Japonya) </td><td> 019-19741 </td><td> Monosit antikor </td></tr><tr><td> Diş akrilik </td><td> Lang Diş (çeşitli distribütörler) </td><td> Jet Protez Tamir Toz ve Sıvı </td><td> Headcap inşaat </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> KWIK-SIL </td><td> Maruz kranial implantlar Kaplama </td></tr><tr><td> Normal keçi serumu </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 005-000-121 </td><td> Doku işleme </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Doku işleme </td></tr><tr><td> Üre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Çözüm Takas </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Çözüm Takas </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Kavisli mikro-makas </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14208 </td><td> Beyin çıkarmadan önce implant Kesme </td></tr><tr><td> Tıraş bıçağı </td><td> Ted Pella </td><td> (Çeşitli ebatlarda) </td><td> Beyin Blok ile kullanım için </td></tr><tr><td> Akrilik Beyin Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Dokuda başlangıç ​​düzlemi oluşturmak için Beyin Blok </td></tr><tr><td> Plastik slaytlar </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Montaj doku </td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Ted Pella </td><td> (Çeşitli ebatlarda) </td><td> Montaj doku </td></tr><tr><td> Elektrot diziler </td><td> NeuroNexus Teknolojileri </td><td> (Çeşitli tasarımlar) </td><td> Örnek ÇÇA&#39;lar </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Sunulan yöntemde kullanılan özel sistem </td></tr><tr><td> Vibratome bıçakları </td><td> (Çeşitli tedarikçiler) </td><td></td><td> Dilimleri Toplama </td></tr><tr><td> 24 oyuklu plakalar </td><td> (Çeşitli tedarikçiler) </td><td></td><td> Doku dilimleri saklama ve işleme </td></tr><tr><td> Motorlu XY tarama aşaması ile konfokal mikroskop </td><td> Carl Zeiss Mikroskopi </td><td> Zeiss LSM 710 ve &#39;Zen 2010&#39; programı </td><td> Sunulan yöntemde kullanılan özel sistem </td></tr><tr><td> Havya </td><td> (Çeşitli tedarikçiler) </td><td></td><td> Headcap Kazı </td></tr></tbody></table>

intact histological characterization of brain-implanted microdevices and surrounding tissue

Tasarım ve bu mikroelektrot dizileri gibi beyne yerleştirilmiş Mikrocihazlarda, kullanımı üzerine araştırmalar, beyin dokusu çevresindeki kronik arayüz klinik cihazlar üretmeyi hedeflemektedir. Bu implantlar çevreleyen doku cihazlar etrafında bir yalıtım &quot;glial yara izi&quot; oluşumunu içeren saat boyunca cihazların varlığına tepki olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu doku değişikliklerin histolojik analiz tipik olarak ilgili doku morfolojisi bozabilir bir süreç içinde, aygıt eksplante sonra gerçekleştirilir. Burada kortikal implante cihazlar kemirgen beyin dokusu çevresindeki bozulmamış toplandığı bir protokol göstermektedir. Bir kez sabitleştirici ile perfüze nasıl tarif beyinleri çıkartılmış ve eksplante cihazlar önlemek için olduğu gibi bu tür bir şekilde dilimlenmiş. Biz floresan antikor etiketleme ve bilgilendirici, ama kalın bir doku üretmek için kullanışlı optik temizleme yöntemleri ana hatlarıylabölüm. Son olarak, beyne yerleştirilmiş aygıtların çevresindeki biyolojik arayüzü araştırmak amacıyla bu doku bölümlerinin montaj ve görüntüleme göstermektedir.

Beyin implante ÇÇA&#39;lar birinci beyin gömülü bileşenleri herhangi bir kafatası monte bileşenlerini ayırmak göre doku kesitlerine toplanır. Şekil 2a, bir diş, bir çimento headcap yan ve bir MEA kablo çevreleyen Kwik-Sil bir kısmının çıkarılıp sonuçlarını gösterir Sıçan kafatası üzerinde. Bir havya bir davlumbaz diş çimento ve Kwik-Sil çıkarmak için kullanılmıştır. Kablo ve uygun olmayan yapıların implante MEA sonraki yavaş yavaş sabit beyin yüzeyine Kwik-Sil boyunca aşağı kazılarak mikro makasla kesilmiştir. Dilimleme sonra, etiketleme, ve doku temizleme, basit bir ölçüye slaytlar kalın dilimler doku (Şekil 2b) monte edilmesi için yararlıdır. Implante microdevice ihtiva eden bir monte edilmiş beyin kesit Şekil 2c &#39;de gösterilmiştir. Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi sürgünün her iki tarafı ile Görüntüleme, bir cihaz arabirimi etrafında değerlendirmek için izin verebilir </stElektrot bölgelerini ve iz boyunca rong bir MEA silisyum destek mikroglianın yanı sıra bir taraftan görülebilir&gt; (Şekil 3a) ve mikroglia diğer tarafında (Şekil 3b) üzerinde görünür. Bir kez monte doku bir XY çeviri aşamasında kullanılarak görüntülenebilir. Tüm doku dilimleri boyunca floresan etiket Özetler istediğiniz çözünürlüğü (Şekil 4) oluşturulabilir. Implante Mikrocihazlarda etrafında morfolojik korunmuş doku arayüzü Detaylı incelemede lokal doku yanıtı (Şekil 5) analizi için yüksek büyütme altında toplanabilir. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Prosedürün genel bakış. (Ac) Beyin mikro-implant ameliyatları fina vardırhemen cihaz çevreleyen Kwik-Sil polimer bir tabaka ile lized, bir akrilik çimento kaplama izledi. (D, e) Aşağıdaki ötenazi, akrilik tabaka uzaklıkta yandığı, ve kafatası cihazın monte edilen bileşenler silikon elastomer ile kesme ile implante edilen bileşenleri ayrılır. (F, g) daha sonra beyin kafatası kaldırılır ve kesilmiş ve vibratome aşama için monte edilir. (HK) Doku dilimler cihaz ihtiva eden bir dilim içeren doku toplanır. (L) Doku ardından işlenir ve detaylı mikroskopi için özel odalarına monte edilebilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. (A) Kwik-Sil silikon elastomer su temizlemebir elektrot-dizi kablosu (ok) rrounding bir havya kullanarak perfüze kemirgen baş diş çimento kap içinde bir pencere uzak yakarak maruz kalmıştır. (B) bir dilim kalınlığında doku bölgesinin her iki tarafında içine görüntüleme yerleştirmek için basit bir &quot;kayar bölmelere&quot; plastik bir slayt kesme ve doku etrafında her iki tarafına coverglass yapışan ve çözelti montaj yapılabilir. (C) sağlam implant (kırmızı ok) ile sıçan beyin dokusu dilim montajdan sonra gösterilir. Doku iki tarafında bu kurulum ile mikroskobu görüntüleme için hızla erişilebilir. Panelleri (b, c) alt kısmında çapında 80 mm iken ölçek için, panel (a), taban boyunca da 25 mm &#39;dir. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Şekil 3. Maksimum intdensite 40 mikron kalınlığında görüntü yığınlarını z-projeksiyonlar, ters (a) ve implante mikroelektrot dizinin ön (b) etrafında toplanmıştır. Mikroglia (anti-Iba1 ve Alexa Fluor 633, beyaz etiketli) ve cihazın yüzeyinde toplanmış lazer ışık yansıtma (kırmızı), sıralı olarak bir 400 mikron kalınlığındaki bir doku dilim her iki yüzünden görüntülenmiştir. Beyin implantları çoğunlukla opak olduğundan, her iki taraf için optik erişim montaj mikroskop objektif açısından implant &quot;arkasında&quot; etiketli doku yapıları net bir görünüm sağlar. Ölçek çubuğu 50 mikron. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4. Konfokal mikroskop tarama bir lazer üzerinde bilgisayar kontrollü sahne kullanarak görüntülü A etiketli DCHist dilim. (A) hücre çekirdekleri (Hoechst 33342 ile boyanmış) ve (b) monositler / mikroglia(Anti-Iba1 etiketli) aynı anda ayrı kanallarda görüntülendi. (C) Transmisyon ışığı yansıtma ve aynı zamanda Hoechst ve Iba1 veri göre 4-haftalık implant yerini gösteren toplanmıştır. (D) tüm kanalları ama iletim Overlay de gösterilir. Beyaz dikdörtgen alanı sağ görünen görüntüler genişletilir. Ölçek çubuğu 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Şekil 5," fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Şekil 5. Bilgisayar kontrollü mikroskop sahne ve uygun yazılımı kullanarak, panoramik görüntüleme verileri implant çevresindeki toplanabilir. Yansıtma (a) ve geçirgenlik (b), cihaz lokalizasyonu izin verirken, floresan antikor ya da kimyasal etiketler (c, mikroglia ve yağmurluk anti-Iba1 etiketleme) rophages sağlam doku arayüz boyunca doku bileşenlerinin ayrıntılı görüntüleme sağlar. Ölçek çubuğu 200 mikron.

Watch this Scientific Journal Video about Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue at JoVE.com

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K Görüntüleme.  Purdue University. Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.

Video: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

Histolojik Analiz Domuz MSS Pozlama: Decapitation, Kafatası Açılış İçin El Kitabı ve Beyin Kaldırma

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

Electroencephalographic, kalp hızı ve galvanik deri tepkisini değerlendirmesi için bir reklam algı çalışma: Sigara karşıtı kamu hizmet duyuruları uygulamaya

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Microcoil stenoz ile hafif intrauterin hipoperfüzyon fare modeli

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...