Bu çalışma NIH / NCRR / RCMI hibe G12-RR003060 tarafından desteklenen, Yeni Şehir Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Bilim Vakfı CBET 0754158 ve PSC-CUNY 62337-00 40 Eunice Shriver Ulusal Enstitüsü SC1HD068129 hibe York.

Aşağıdaki protokol New York City College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından kurulan hayvan bakım yönergeleri takip eder. 1.. Hayvan Entübasyon (10-20 dakika) <ol><li> Ameliyat öncesinde, memeli Ringer çözeltisi hazırlar. Cerrahi aletler, ısıtma pedi, ve bankta küçük hayvan vantilatör (Şekil 2) birleştirin. <ol><li> Kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin ölçümleri için Ringer içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi 10 ml yapmak ve% 1 BSA çözeltisi, 25 mm şırınga filtresinden (0.2 um filtre ile çözelti içinde 8 mg / ml &#39;de TRITC-dekstran 155 kD çözülür gözenek boyutu) ve karanlıkta bir folyo kaplı şırınga saklayın. </li></ol></li><li> Izofluran kullanarak hayvan anestezisi. Idamesi ve 1.5-3.0% için 5.0% kullanın. Alternatif olarak, ketamin (41.7 mg / kg) ve ksilazin (2.5 mg / kg vücut) bir karışımı kullanılabilir. Anestezi derinliği ayak tutam refleksi ile kontrol edilebilirüst ve alt ekstremite. <ol><li> Ketamin sonraki doz (41.7 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (2.3 mg / kg vücut ağırlığı) doz aşımı önlemek için en yüksek dozun ⅓ artışlarla tatbik edilmelidir. Bir kemirgen vantilatör kullanılması ksilazin ile indüklenen solunum depresyonu ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Dorsal yan yatarken anestezi yavru yerleştirin ve anestetik (Şekil 3a) teslim etmek için kullanılan plastik koni ile başını sağlamlaştırmak. <ol><li> Ön bacaklarda ve kuyruk (Şekil 3a) üzerinde yapışkan bant ile hayvan sabitleyin. </li><li> Yavru kafasını sağlamak için alternatif bir metal çubuk bağlanmış bir kafa plakası kullanmaktır. Not: ısıtma pedi hipotermi (Şekil 3a) önlemek için 37 ° C&#39;ye ayarlanmış olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Bir boyuna yapmak için makas (Şekil 2b) kullanın ve cilt üzerinde dört yan insizyon (boyun örtenŞekil 3b). Künt tekniği kullanarak, cildi incelemek ve forseps kullanarak bir kenara koyun (Şekil 2c ve 3c). <ol><li> Yapışkan bant kullanılarak cilt basılı tutun. Yatay konumda (Şekil 3c) &#39;de baş stabilize. </li></ol></li><li> Trakea (Şekil 3c) maruz kenara yaylı makas (Şekil 2d) ve künt tekniği, itme bezleri ve yağ katmanları kullanma. Karotid arter konumunu belirlemek. <ol><li> Uzak trakea karotis arterler tutun. Not: karotis delme yavru masif kan kaybı ve ölüme neden olabilir. </li></ol></li><li> Yaylı makas kullanılarak (Şekil 2d) trakea kapsayan boyuna kasları teşrih. Trakea (Şekil 3d) altında bulunan uzunlamasına kaslar kesin. Not: trakeal halkalar (Şekil 3e) açıkça görünür olmalıdır. <ol><li> Kullanmaforseps (Şekil 2c), trakea etrafında dikiş iki adet kravat. Sütür tek parça havalandırma tüp güvenli ve ikinci iplik havalandırma tüpü yerleştirilmesi noktasında (Şekil 4a) trakea rostral kapatmak için kullanılır. Not: nemlendirir, su kaybını önlemek için Ringer solüsyonu ile düzenli doku maruz. </li></ol></li><li> Yaylı makas kullanılarak (Şekil 2d) aşama 1.6.1 (Şekil 4c) yerleştirilen iki dişin arasında bulunan trakeal halkalardan birinde bir kesi yapmak. Not: herhangi bir sıvı açık trakea girer emin olun. Trakea sıvı boğulmaya neden olur. </li><li> Trakea içine entübasyon tüpü (Şekil 4b) takın ve sabitlemek için alt iplik sıkın. Forseps (Şekil 2c), entübasyon tüpünün ekleme noktasına trakea posterior kapatmak için üst iplik sıkın. <ol><li> Tighten ve iki ipliği (Şekil 4d-f) uçlarını kesin. Not: entübasyon tüpünün içine Buhar üfleme kontrolü iyi bir işaretidir. </li></ol></li><li> Derhal ventilatöre izofluran kaynağını açın. Hayvanın ağırlığına göre vuruş hacmi ve havalandırma hızını ayarlayın. <ol><li> Elastomer ile maruz çevreleyen doku (Şekil 5a) sıkıca kapatın. Yüzeyi nemli ve temiz tutun. </li></ol></li></ol> 2.. Trakea ve Kas Kaldırma Kraniyumun Expose (5-10 dk) <ol><li> Havalandırma borusuna yakın trakea kesmek için yaylı makas (Şekil 2d) kullanın. Damak kaudal ucunu açığa çıkarmak için ağız boşluğuna kas duvarı boyunca iki kesim yapın (Şekil 5b). Not: Gerekirse, kanamayı durdurmak için bir cauterizer kullanın. Kontrolsüz kanama hayvanın ölümüne neden olacaktır. </li><li> Temizleyinalan Ringer solüsyonu (Şekil 5c) bol miktarda kullanarak. Son vertebra ve Basi-oksipital kemik (Şekil 5d) arasındaki boşluğu belirleyin. Not: kemikler arasındaki boşluk beyin sapı yapıları bulmak için yararlı bir kafatası bir dönüm noktası olduğunu. Aşağı zeytin bu boşluğun altında yer almaktadır. Işitsel superior oliver kompleks (Şekil 1 de bakınız), bu boşluğu gelen rostral yönde Basi-oksipital kemiğin altında bulunur. </li><li> Forseps (Şekil 2c) ve yaylı makas (Şekil 2d) kullanarak bölgeyi temizleyin. Kan damarlarını delmeyin. Not: Gerekirse, kanamayı durdurmak için dağlamak. <ol><li> Açık alan, yağ ve kas dokusu, temiz sonra, Basi-oksipital kemik ve son omur ayıran boşluk görebilir (Şekil 5d) olmalıdır. </li></ol></li></ol> 3.. Kranyotomi (15-30 dakika) <ol><li> Bir mikrotur veya ultra kullanınsonik temizleyici. Bullasının medial duvar bulun. <ol><li> Yatan arterler (Şekil 5e) görünene kadar bir ters D şekli yaparak ince kafatası. Not: baziler arter (bas) beyin sapı orta hat üstünde çalışır. Anterior inferior serebellar arter (AICA) dalları bilateral ve farklı hayvanlarda sabit bir konuma sahip olduğu bir dönüm noktası olarak güvenilir kullanılabilir. </li><li> Kafatası inceltilmiş olduğunda, yavaşça bir kesme keski (Şekil 2e) kullanarak bölünürler. Forseps ile kemik parçası (Şekil 2c) sökün. Alternatif olarak, asansör ve bükülmüş bir iğne kullanılarak kafatası kırmak. Not: kraniotomi boyutu ve şekli planlanan deney için uygun olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Bas ve aica dura zarı (Şekil 5f) aracılığıyla görünür olmalıdır. </li></ol></li><li> Alanı taze Ringer çözeltisi ile birkaç kez temizleyin. Emici pa kullanmads dura zarın yüzeyini kurutun. <ol><li> Gerekirse, dönüm arterler bas ve AICA yerinden veya bozmadan dura zar kaldırmak için bir dikiş iğnesi kullanın. Not: beyin omurilik sıvısı delinmesiyle dura dışarı akacaktır üzerine. Ringer çözeltisi ile bölgeyi temizleyin ve deney boyunca nemlendirilmiş tutmak. </li></ol></li></ol> 4. Elektrofizyoloji Deney <ol><li> Deney tasarımı ile (Şekil 7) göre polytrode seçin. Kat DII ile polytrode ince bir fırça kullanın. , 1 ml mikrosantrifüj tüpü içine DII çözüm aktarın çözelti içindeki daldırma fırça ve yavaşça (örneğin bir Stereoskop kullanılarak) görsel gözetiminde polytrode çarpar. Prob ucu başlayın ve elektrotlar muntazam biçimde kaplanmış kadar dikkatli bir şekilde devam eder. <ol><li> Ağız boşluğu içindeki toprak elektrotu yerleştirin. Elektrot tutucu (Şekil 7b içine yerleştirin polytrode <li> Üzerinde amplifikatörü açmak ve tüm bağlantıların iyi çalıştığını kontrol edin. </li></ol></li><li> AICA (pozisyon sıfır) şube noktada bas yukarıda elektrot yerleştirin. Uygun rostral-yanal koordinat (Şekil 7c) kullanılarak istenilen hedef noktasına elektrot taşıyın. <ol><li> Beyin yüzeyinde elektrot yerleştirin ve 5-10 mikron adımlarla istenilen derinliğe taşıyın. </li></ol></li><li> Deneme desenine göre kayıt yapın. Daha fazla analiz için verileri kaydetmek. </li></ol> 5. İki foton Görüntüleme Deneyi <ol><li> Mikroskop açın. Dalgaboyu ayarlayın ve uygun bir emisyon filtresi kullanın. 800 nm uyarma ve TRITC-dekstran görüntüleme için de bir 607 ± 45 nm band geçiren emisyon filtresi çalışma. </li><li> Sağ veya sol karotis arter tespit. Künt tekniği kullanarak komşu bağ dokuları ya da sinirlerden karotis arter teşrih. <ol><li> Karotis almak ve tutunhemostatla arter. Karotid arter çevresinde dikiş üç adet kravat. </li><li> Kan akışını durdurmak ve gevşek diğer iki Konuları bırakmak yakın kalp tarafına iplik sıkın. </li><li> Bağlı iplik ve sonraki gevşek parçacığı arasında karotis arter üzerinde bir 45 ° &#39;lik açıyla küçük bir kesim yapmak için ince makas kullanın. Not: emici kağıt ile kanı temizleyin. </li></ol></li><li> Karotid arter Cannulate. Yaklaşık 5 mm derinliğinde yavrunun kafası yönelik karotis arter üzerinde kesim içine TRITC-dekstran solüsyonu ile dolu tüp yerleştirin. <ol><li> Birlikte, tüp ve arter tutmak için arter çevresindeki diğer iki konuları sıkın. , Konuları sıkın Döşeme ve daha fazla stabilize etmek için elastomer ekleyin. Not: borunun diğer tarafında (aşama 1.1 &#39;de elde edilmiş) TRITC-dekstran çözeltisi ihtiva eden bir şırınga ile bağlanır. </li></ol></li><li> Şırınga pompası şırınga Fix. <ol><li> Setyavru karotid arter kan akış hızında hızı. Birkaç saniye için bir şırınga pompası açın ve boya çözeltisi karotid arter içine enjekte edilebilir elle kontrol edin. Not: Yetişkin farelerin karotid arter kan akış hızı (240-280 g) varsayılarak, yaklaşık 3 ml / dakika, 14, bir yavru fare için kan akış hızı (örneğin, P10 yavru 15-25 g ağırlığında) için hesaplanan edilebilir 0.16-0.3 ml / dak aralığı. </li></ol></li><li> Mikroskop objektif altında hayvan yerleştirin. Kana floresan dekstran enjekte edilir. <ol><li> 5X hava amacı ile ventral beyin sapı üzerinde ilgi alanları belirlemek. 20X veya 40X amacı geçmek ilgi (ROI) bölgesini odak (suya daldırma, NA sırasıyla 0.5 ve 0.8, =). </li><li> Görüntüleme başlatın ve ROI damar içinde floresan yoğunluğu kadar görüntü elde etme parametreleri (örneğin, maruz kalma süresi, lazer gücü, dedektör kazanç) ayarlamak optimize edilir (yani) çok düşük değil ama doymuş değil. </li><li> Karotid artere boya çözeltisinin enjekte ve sabit bir odak düzlemi bir zaman serisi elde etmek için bir şırınga pompası açın. </li></ol></li></ol> 6.. Hayvan Bakımı ardından Prosedürü <ol><li> Bu, bir terminal işlemdir. Bir deney hayvan sonunda yüksek dozda pentobarbital (100 mg / kg, karın içinden enjeksiyon) veya American Medical Association Veteriner Ötenazi Rehberi tarafından onaylanmış ötenazi herhangi bir başka yöntem ile ötenazi gerekir. Not: Perfüzyon Ringer çözeltisi ile kalbinden bir tespit çözeltisi ile ve ardından fazla histolojik analiz için tavsiye edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Zaman kritiktir. Deneyimli bir araştırmacı (1-3 adım) 1 saat içinde bu protokol tamamlamak gerekir. Farklı adımları için belirtilen süreleri uzmanlık düzeyi yüksek bir orta varsayalım. Yoksul havalandırma kontrol hayvanın boğulma ve ölüme yol açabilir beri doğru ve zamanında trakeostomi ve entübasyon, önemlidir. Hatalar hayvanın kontrolsüz kanama ve ölüme yol açabilir, çünkü kas ve yağ dokularının dikkatli açıklık da çok önemlidir. Kanül yerleştirilmesi için karotis arter hazırlarken Benzer şekilde, bir iplik düğüm gevşek olursa kontrolsüz kanama gerçekleşecek, dikkatle arter sıkın ve kesmek gerekir. Son olarak, kraniotomi damarsal işaretlerini aksatmadan, dikkatle yapılmalıdır. Dış meningeal tabakası (dura) dikkatsiz çıkarılması şiddetli kanama ve arteriyel arz hasara yol açabilir. Havalandırma ayarları hayvanın yaşına göre seçilir.Çoğu ticari tedarikçiler gibi ayarları hakkında yararlı bilgiler sağlar. P15 daha yaşlı farelerde deneyler büyük bir hayvan vantilatörü kullanımını gerektirecektir. Ergin hayvanlar ketamin / ksilazin ile anestezi eğer havalandırma ihtiyacı olmayabilir, ancak entübasyon trakea giren sıvıyı önlemek için tavsiye edilir. Bu protokolün bir ana sınırlama deneyleri sadece akut gerçekleştirilebilir olmasıdır. Laboratuarımızda iki ve on kadar saat arasında süren deneyler var. İkinci bir sınırlama deneyleri anestezi altında yapılabilir zorunda olmasıdır. Bu nedenle, anestezik seçimi deneylerin planlanması ve tasarımında dikkate almak önemli bir değişkendir. Bununla ilgili bir konu yenidoğan hayvanlar doz aşımı özellikle hassas olmasıdır. Örneğin, ketamin / ksilazin karışımı seçimi ise, yavru ağırlığına göre dozu hesaplamak ve maksimum hacim ⅓ da ilaçlar yönetmek. Ayak tutam r tarafından her 5-10 dakikada hayvanın durumunu kontrol edinesponse. Izofluran kullanıyorsanız, önlemler aynı zamanda araştırmacı (uygun havalandırma ve düzgün kalibre buharlaştırıcı) için güvenli bir ortam sağlamak için gereklidir. Stereomikroskop iki foton mikroskop için elektrotlar ve hayvanın taşınması yer görüş açısını ayarlamak ve alan açıklık kolaylaştırmak için esnek bir tutucu üzerine monte edilebilir. Ventilatöre güç bir pil kullanın hayvan hareket kolaylaştırmak ve elektrofizyoloji deneyleri sırasında elektrik eserler azaltabilir. Bu amaçla, bir küçük breadboard (7.5 x 12 inç) ventilatör, ısıtma yastığı ile anestezi uygulanmış hayvan (Şekil 2a) birlikte monte etmek için kullanılabilir. Bu kurulum için yararlı ve önemli bir değişiklik ameliyat sırasında vital işaretler izlenmesi için bir cihaz eklenmesidir. Bir oksimetre veya diğer analog cihazların laboratuvar bütçesine bağlı olarak kullanılabilir. Bu protokol elektrofizyoloji ve araya görüntüleme ile kullanılır olmuşturpatch clamp kayıtları 8,10,11, polytrode kayıtları (Şekil 7) ve iki foton görüntüleme de dahil olmak üzere 9 hods, (Şekil 6 ve 8). Bir gelecekteki olası uygulama elektrofizyolojik kayıt 16 için floresan etiketli hücreleri hedef için bu yöntemleri birleştirmek olacaktır. Yeni görüntüleme uygulamalar da 2-D veya iki-foton mikroskopi kullanılarak 3-D zaman serisi içerebilir. Örneğin, beyin nöronal ve glial hücre popülasyonlarının aktivitesini incelemek için kalsiyum göstergelerin bolus yükleme kullanılarak. Şekil 8&#39;de gösterildiği gibi, bir boya çözeltisi karotid arteri yoluyla kan dolaşımı içine enjekte edilen beyin damar yüksek kontrast görüntüleri üretmek için kullanılabilir. Floresan boya mikro damar lümeni doldurur ve çevredeki dokuya yayılır, bu eriyik difüzyon katsayısı, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğinin belirgin çözünen hesaplamak için değil, aynı zamanda kullanılabilirbeyin dokusunda 3 ficient. Karotid arter yoluyla floresan etiketli çözünmüş enjekte edilmesi için bir ana nedeni, boya çözeltisi doğrudan bir kuyruk damarından enjeksiyon ilk olarak kalp gitmeden beyindeki kılcal gitmek olabilir. Bu, en azından iki avantajı getirir. Bir perfüzyon oranı kanülasyon yerinde sabit ise mikrodamar lümeninde floresan boya konsantrasyonu, hemen hemen sabit olmasıdır. Bu, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin doğru belirlenmesini sağlar. Başka bir test maddesi Perfüzat dahil olması durumunda, doğrudan vücut dolaşımdan diğer faktörler ile seyreltildi ve kombine edilmeden, kan-beyin bariyeri gidecek olmasıdır. Yeni deneyler de genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere transgenik hayvanların yararlanabilir. Bu (floresan probları yerinde yüklenmesine gerek olmaz olanaklar sağlayacak sürece Deneyin tasarımızaman tasarrufu ve muhtemelen daha sağlam hazırlıkları (örn. kafa penceresi 17) için izin) olarak belirtiyor. Son olarak, deneyler bu tür alt zeytin ya da yüz motor çekirdeği gibi diğer beyin bölgelerinde yapılabilir. Belirli bir türün belirli hücresel popülasyonların Nöroanatomisinin ve gelişimi hakkında bilgiler anatomik oluşumlar hayvanlar (Şekil 1) büyüdükçe değişebilir özellikle de, bu amaca yönelik önemli olacaktır. Biz bu protokol vivo elektrofizyolojik ve görüntüleme yöntemleri kullanılarak ventral beyin sapı yapıları incelemek için başkalarını teşvik umuyoruz.

Flüoresan görüntüleme ve elektrofizyoloji teknikleri ile kombinasyon halinde bir kranyotomi kullanılması izleme sağlar: kan akımı, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin ve canlı hayvan 1-3 nöron ve glial hücrelerin aktivitesinin ölçülmesi. Çeşitli laboratuarlar sağlıklı ve hastalık durumlarında beyin fizyolojisi içgörü sağlamak için bu yaklaşımı kullanmış, ancak boşluklar bu süreçlerin gelişimi sırasında ortaya nasıl anlayışımıza kalır. Ayrıca, çalışmaların çoğu çeşitli fizyolojik rolleri ile ventral beyin sapı yapıları ex vivo yaklaşımlar kullanılarak çoğunlukla çalışılmıştır şekilde, kolayca kafatasının dorsal yüzeyinden erişilebilir beyin bölgelerinde odaklanmıştır. Bu protokol ana amacı kemirgen ventral kafatası kranyotomi açılması için bir yöntem sağlamaktır. Bu yaklaşım, duyusal neurophysiology reco için köpek ve kedi gibi daha büyük memelilerde gerçekleştirilen klasik çalışmalar uyarlanmıştırişitsel beyin sapı 4-7 rdings. Bu protokolde Ancak, yenidoğan hayvanlarda prosedürü yerine yeni bir meydan okuma vardır. Damar işaretlerini kullanarak, bu adapte protokol yenidoğan sıçanlar, yetişkin farelerin ve alt zeytin 8-11 (Şekil 1) gibi diğer beyin sapı bölgelerin işitsel beyin sapı incelemek için önceden kullanılan olmuştur. Ventral beyin sapı çekirdekleri çalışma mevcut yöntemlere göre bir ventral kranyotomi bir ana avantajı yaşayan hayvanlar ilgi yapılarına doğrudan erişim sağlamasıdır. Örneğin, üstün olivary kompleksinin işitsel hücreleri probları hedef yerleştirilmesi için ve görüntüleme derinliği 0,5 mm ile sınırlı hangi iki foton görüntüleme yaklaşımlar kullanılarak için önemli olan beyin yüzeyinden mikrometre arasında birkaç on lokalizedir Hafif doku saçılma ve soğurma. Bir ventral kraniotomi de wh, nispeten bozulmamış sinirsel bağlantıları ile bir hazırlık sağlar,ich akut ve organotipik dilim hazırlıkları 12 bozulur. In vivo deneyler neurophysiology 13 için diğer protokollere aksine, ventral bir yaklaşım, çok elektrot kayıt ve hücre toplulukları hakkında bilgi görüntüleme yöntemleri ile kombine edilebilir (Şekil 6 ve 7). Son olarak, bu protokol ile kombinasyon halinde bir floresan işaretli çözünen çözünen için, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin değişiklikleri (Şekil 8) ölçmek için damar enjekte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

In vivo deneyler için bir kranyotomi kullanılması erişkin memeli beyninde ve gelişme sırasında çeşitli hücresel süreçlerin dinamiklerini araştırmak için bir fırsat sağlar. Çoğu in vivo yaklaşımlar sırt tarafında bulunan beyin bölgelerini incelemek için kranyotomi kullanmalarına rağmen, bu tür ventral tarafında bulunan pons, gibi beyin bölgeleri nispeten ilgili yeterli kalır. Bu protokolün ana amacı, elektrofizyolojik ve görüntüleme yöntemleri kullanılarak in vivo okudu böylece ventral beyinsapı yapılarının erişimi kolaylaştırmaktır. Bu yaklaşım sağlar yapısal uzun menzilli akson değişiklikler, tek bir elektriksel aktivite desen ve hücrelerin topluluklar ve yenidoğan hayvanlarda kan beyin bariyeri geçirgenliğinin değişikliklerin çalışma. Bu protokol, yeni doğmuş sıçanlarda beyin sapı işitsel çalışma için en çok kullanılmış olmasına rağmen, bu tür kolay yeni doğmuş farelerde, yetişkin Roden gibi diğer kemirgen türlerde çalışmalar için uyarlanabilirts ve diğer beyin bölgeleri.

Nöral izleyiciler eîektroporasyonu Trapezoid gövdenin (MNTB) medial çekirdeği Bu protokol kullanılarak, daha önce araştırılmıştır üstün olivary karmaşık bir hücre grubudur. Örneğin, yama kelepçe pipetler (Şekil 6) 9 sinir izleyiciler elektroporasyonu için kullanılabilir. Şekil 6A&#39;da gösterildiği gibi, pipetler orta hatta yakın yerleştirilir, sonuç çaprazlaşma afferent aksonlar etiketlenir olmasıdır. Yüksek sayısal açıklık suya daldırma objektif ile donatılmış bir iki-fotonlu mikroskop çok ince tamamlayıcı dallar dahil olmak üzere MNTB ulaşan elyaflar, görüntü için kullanılabilir (Şekil 6b oklar). Şekil 6c&#39;de gösterildiği gibi sinir izleyiciler aynı zamanda, doğrudan MNTB teslim edilebilir. Düşük bir sayısal açıklık suya daldırma hedefi (Şekil 6d) ile görüntüleme tarafından takdir edilebilir gibi sonuç MNTB hücreleri ve afferent aksonların etiketleme. Malt büyütme objektif kullanarak bir ain fayda açısından daha geniş bir alanı kontrol edilebilir olduğunu ve bu durum, daha düşük amacı sayısal açıklık için uzamsal çözünürlük bir azalma ile sonuçlanır, ancak tek tek MNTB hücreleri de (Şekil 6d de oklar) ayırt edilebilir . Yaşları P1-P5 için bu deneylerin süresi ortalama 3.1 ± 1.4 saat (n = 22 yavru) &#39;dir. Elektrofizyoloji kayıtları Spontan patlama ateşleme 11,13 işitme başlangıcından önce tek MNTB hücrelerinde gözlenen gelişimsel elektriksel aktivitenin bir şeklidir. Bu cerrahi protokolü kullanarak bu MNTB (Şekil 7a-b) için multielectrode diziler (polytrodes) hedeflemek de mümkündür. Sonuç MNTB hücrelerin bir topluluk spontan aktivitede bir kayıttır. Şekil 7e bir P6 sıçan bir temsilci polytrode kaydını gösterir. Bu deneyde, polytrode kullanılarak lipofilik DII boya ile kaplanmıştırince bir fırça (adım 4.1). Kayıt yaptıktan sonra beyin histolojik analiz için işlenmiştir ve DII etiketli polytrode parçanın konumu MNTB (Şekil 7d) hedefleyen uygun teyit etmek için kullanıldı. Yaşları P1-P6 için deneylerin süresi ortalama 2.0 ± 0.7 saat (n = 33 yavru) &#39;dir. Mikrovasküler geçirgenliği Ölçme Bu protokol, aynı zamanda, vasküler geçirgenliğin, iki foton görüntüleme deneyler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bir floresan çözünen (TRITC-dekstran, MW 155 kD, Stokes yarıçapı ~ 8.5 nm)% 1 BSA Ringer çözeltisi içerisinde çözündürüldü ve karotid arteri 14 takılı bir kanül yoluyla serebral dolaşıma enjekte edilmiştir. Kuyruk ven enjeksiyonları farklı olarak, bu prosedür, kalp atlar ve doğrudan beyin mikro içine floresan çözünmüş madde sunar. Şekil 8a, bu prosedür kullanılarak sonuçları, kan damar etiketleme kalitesini göstermektedir. Sürekli sonraŞekil 8b&#39;de gösterildiği gibi, kan akımı içine etiketli solutların perfüzyon bu, ilgi konusu bir bölge bir zaman atlamalı dizisi elde etmek mümkündür. Ilgi bölgesi içindeki toplam flüoresan yoğunluğu offline ölçülür ve bir matematiksel model flüoresan (Şekil 8c) 15 eriyiklerin etiketli için kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin saptanması için kullanılmıştır. Yaşları P9-P10 için deneylerin süresi ortalama 2.3 ± 0.8 saat (n = 3 yavru) &#39;dir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Yenidoğan sıçanlarda damar noktalara göre ventral beyin sapı sinir yapıları Göreli konumu. Bir, beynin yan görünümü. B, beynin ventral görünümü. Büyük kan damarları ilgilendiren kırmızı ve sinir yapıları gösterilmiştir indrenkli kareler ile gili bölümü. Ölçekli çizilmemiştir. AICA = anterior inferior serebellar arter; bas = baziler arter; icv = alt serebral ven; mca = orta serebral arter; = vertebral arter vert; vsp = ventral spinal arter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Cerrahi kurulum. A, Cerrahi (1) istikrarlı bir tablo üstüne üstüne oturan bir küçük ekmek gemide yapılabilir. Bir ısıtma pedi (2) ve küçük bir hayvan ventilatör (3) gerektiğinde tüm hazırlanmasını kolaylaştırmak için hareket ekmek kartına tespit edilebilir. Küçük hayvan ventilatör bir batarya olabilir (4). Manyetik bir tutucu (5), anestezi sağlamak için kullanılan burun konisi güvence altına almak için de kullanılabilir. Burun konisi yapabilirsinizAyrıca sabit bir pozisyonda kafa güvenli yardımcı olur. Hayvan konumlandırılarak gerek yoksa, bir mikromanipülatör (6) elektrofizyoloji veya nöral izleme deneyler için konum problar için kullanılabilir. Bir ışık kaynağı (7) ve (resimde) bir steroskop mikrocerrahi. B sırasında dönüm yapıları görselleştirmek için gerekli olan, küçük makas 1.4 adım kullanılır. C, Forseps adımlarla 1.4, 1.6.1, 1.8 ve 1.8.1 kullanılmaktadır . d, yaylı makas adımlarla 1.5, 1.6 ve 1.7. e kullanılan, kesme keski adım 3.1.2 kullanılmaktadır. E = 1 mm Ölçek çubuğu, BD için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. Entübasyon trakea merceğin.Bir, hayvan, anestezi yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir ve burun konisi ve bant (kesik çizgiler). b ile sabitlenir, deri kesilir ve temel yağ tabakası. c örten yağ ve bezleri (gösterilen maruz kenara konur gri) trakea ortaya çıkarmak için bir kenara itilir. Bant örten deri (kesik çizgiler). D sabitlemek için kullanılan, nefes borusu kas disseke. E, trakea halkaları Görselleştirme örten kas başarılı kaldırma gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Hayvan Entübasyon., Bir, iki dikiş ipler (beyaz oklar) trakea etrafında bağlanır(T). B, entübasyon boru (it) sıkıca hayvan vantilatör. C y tüpüne bağlı olması, bir trakeostomi iki dikiş iplikleri (siyah ok). D, havalandırma tüpü yerleştirildiğinde ve arasında yapılır iki dikiş iplikleri sıkılır. Ipliklerin uçları (beyaz ve siyah ok uçları ile gösterilen) bir çapraz şekilde tekrar sıkılır. E, sütür uçları bağlıdır. F, sütür uçları kesilmiş ve entübasyon tamam olmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. Trakea Çıkarma ve kraniotomi yapım. A, hazırlık elastomer (bölge Insi ile stabilize edilir<html> de yeşil) kesikli çizgiler. b, trakea tanımlanır ve daha sonra keser ilk deplasman entübasyon tüpü trakea ayırmak için, ve sonra mandibular kasları (noktalı çizgiler). c kesmek için, künt kullanarak kafatasının yüzeyini temizleyin yapılır teknik kas kaldırmak ve yağ ve kan. d kaldırmak için emici kağıt kullanmak için, temiz bir alanda örneği son omurları (v) ve Basi-oksipital kemik (bo) gösterir. Iki kemik (siyah oklar) arasında doğal bir uçurum var. E, ters D şeklinde (siyah oklar) bir microdrill veya ultrasonik temizleyici ince kafatası kullanma. Yavaşça inceltilmiş kafatası kırmak ve kemik parçasını çıkartın. Landmark damarsal görünür. F, maruz kalan beyin sapı yüzeyinde damar yerlerinden Yüksek büyütmeli görünüm olmalıdır. Bas = baziler arter; AICA = anterior inferior serebellar arter. B = 1 mm Ölçek çubuğu, ce için de geçerlidir.highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Sinir izleyiciler eîektroporasyonu. Bir, nöral izleyici mikro-yakut içeren bir cam elektrot orta hat (kırmızı daire) yanına konulmuştur. İzleyici 7 ikinci uzun -5 uA bakliyat 15 dakika boyunca her 14 saniyede teslim kullanılarak elektroporatlanmıştır. Iyileşme süresi 1 saat sonra, kutu alanı ile bir iki-fotonlu mikroskop ile görüntülendi. P1 sıçan yavru. B MNTB içeri götüren akson etiketleme Exemplar z-yığını görüntüsü. Oklar bireysel teminat dalları işaret. C mikro-yakut ile dolu bir cam elektrot MNTB (kırmızı daire) üstüne yerleştirildi. Izleyici, bir de açıklanan aynı ayarları kullanarak elektroporasyona tabi tutulmuştur. Iyileşme süresi 1 saat sonra, kutulu alan olduİki foton mikroskop ile görüntülendi. P5 sıçan yavru. D MNTB etiketli hücreleri ve akson Exemplar z-yığını görüntüsü. Oklar bir MNTB hücreleri göstermektedir. B ve c Etiketler objektif büyütme ve sayısal açıklığı göstermektedir sırasıyla. , Bir ve c = 300 mikron ölçek çubuğu = 45 mikron b ölçek bar; d = 90 mikron ölçekli bar. AICA = anterior inferior serebellar arter; bas = baziler arter; r = rostral; l = yanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Polytrode Kaydı Hedeflenen. Bir, Polytrode incik başına 4 elektrotlar (siyah daireler) ile 4 saplar oluşur. Elektrodlar arasında intra-ve inter-sap mesafeleri gösterilir. B, </strong&gt; elektrofizyoloji deney Exemplar görüntüsü. Bir referans elektrot bukkal boşlukta sokulur ve ploytrode headstage bağlanır. P6 sıçan yavru. C polytrode hedefleme için kullanılan damar yerlerinden yüksek büyütme görünümü. Polytrode (polytrode parça kırmızı gösterilir) yamuk vücudun (kırmızı kutu). D, Posthoc histolojik analiz DiI kaplı polytrode doğru hedefleme gösteren medial çekirdeğini hedef rostral-yanal koordinatlarını kullanarak konumlandırılmış. E, Exemplar multi -birimi kaydı. Trace sipariş Panel A elektrot için aynıdır. Incik kayıtların içinde aynı renge sahiptir. E Ölçek çubuğu = 5 saniye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"width = &quot;600&quot; /&gt; Beyin mikrodamarlar Şekil 8.. In vivo iki foton görüntüleme. karotid artere TRITC-dekstran 155 kD perfüzyon sonrası beyin damar sisteminde bir, 2-boyutlu bir görüntü (daraltılmış Z-yığın). Görüntülenmiş alan Şekil 7c gösterilene benzer. 20x/0.5 suya daldırma hedefi. P10 sıçan yavru. B, faiz (ROI) Bölge floresan yoğunluğu (kırmızı çerçeve kapalı bölge) ölçmek için kullanılır. Mikrodamar ~ 14.2 um&#39;lik bir çapa sahip olan ve. C, floresan yoğunluğu (normalize değeri) tipik eğri zamanın bir fonksiyonu olarak 182 um beyin yüzeyinin altında bulunan oldu. Flöresans çözüm sadece damar lümeni doldurur zaman 0 ROI floresan yoğunluğunda adım artıştır. (DI / dt) 0 ve 0 çözünen için mikro damar geçirgenliğinin saptanması için kullanılır. TRITC-dekstran 155 kD geçirgenliği 1.5 x 10 -7 cm / sn olduğu hesaplandı.B = 100 mikron ölçekli bar, için de geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Bir cerrahi yöntem, yeni doğmuş sıçanlarda ventral kafatasını açığa çıkarmak için tarif edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak bu anestezi yavruların beyin sapı akut elektrofizyoloji ve iki-foton mikroskopi deneylerini gerçekleştirmek için bir kraniotomi açmak mümkündür.

Yenidoğan Kemirgenlerin Ventral Kafatası kranyotomi olun Bir Yöntem

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Görüntüleme.  The City University of New York, City College.  Bir cerrahi yöntem, yeni doğmuş sıçanlarda ventral kafatasını açığa çıkarmak için tarif edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak bu anestezi yavruların beyin sapı akut elektrofizyoloji ve iki-foton mikroskopi deneylerini gerçekleştirmek için bir kraniotomi açmak mümkündür. 

Video: A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Nörobilim

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Multi-bilişsel işlevler Test ve Kemirgenler Nöronal Etkinlikler kayıt için Tam Otomatik ve Çok Yönlü Sistemi

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Interstimulus Aralık kemirgenler zamansal işleme değerlendirilmesi için güç

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

Phasic Dopamin'in Ventral Tegmental Alan Reseptör Reseptör Reseptör Düzenlemesini Değerlendirmek için Hızlı Taramalı Döngüsel Voltammetri (CIS-FSCV) ile Kombine infüzyon ve stimülasyon

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...