The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement&#160;n&#176; 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.

Astmatik olmayan bireylerden alınan birincil ASM hücreleri Glenfield Hastanesi, daha önce tarif edildiği gibi (Leicester, UK) ile bronş biyopsilerinde izole edilmiştir. Araştırma Leicestershire Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve hastaların yazılı bilgilendirilmiş onam verdi. 1. Elektrospinning PET iskeleleri (Şekil 2) <ol><li> - Trifloroasetik asit (TFA) çözelti 1 diklorometan (DCMro) bir 1: içki şişe sınıf PET içeren bir çözelti (10 mi) hazırlanır. 8,% 30 ve% 10,% ağırlık / hacim (ağırlık / hacim) PET konsantrasyonları nano, mikrofiber için gereklidir ve iskeleleri, sırasıyla hizalanır ve PET çözünmesi için daha sonra çözelti, oda sıcaklığında O / N karışmaya edilir. </li><li> Bir şırınga içine PET çözüm aktarın ve şırıngaya (nanolif için) 23-G veya 18 G (mikrofiber ve hizalanmış) bir iğne takılır ve bir motorlu şırınga pompası içine şırınga yerleştirin. Iğne noktası altına döndürülür emin olun. </li><li> Ma yerleştirinİğneyi sağlanması uzağa iğne ucundan ndrel 15 cm, tambur merkezinde işaret edilmektedir. </li><li> Timsah klipler ile iğne ucu elektrik beslemesini takın ve yeryüzüne (muz soketi üzerinden) mandrel topraklayın. Nanolif ve mikrofiber iskeleleri (yaklaşık 13.2 m · min -1 eşdeğer) 60 rpm güç mandrel arz ve set hız açın. Için hizalanmış iskeleleri (yaklaşık 440 m min -1 eşdeğer) 2,000 rpm Set hızı. </li><li> 0.5 ml akış hızına şırınga pompası ayarlayın · hr -1 nanolif rastgele ve hizalanmış iskeleler veya 2.0 ml · hr -1 mikrofiber iskeleleri için. Çözelti iğne herhangi bir havayı çıkarmak için iğne ucu kadar uzatılan kadar pompa çalışmasına izin verin. Sonra pompayı durdurun. </li><li> Şırınga pompası üzerinde, solüsyonun toplam hacmi 2 ml bırakılırlar ve pompayı çalıştırmak üzere ayarlanmıştır. </li><li> Güç SUPP Set gerilimi 14 kV besleme ve anahtarly. </li><li> Electrospin çözeltisi 2 mi electrospun kadar (nano ve hizalanmış İskele 4 saat, mikrofiber iskeleler 1 saat). </li><li> Mandrelin genişliği boyunca bir bıçak ile iskele kesin. Bu (bu durumda, dikdörtgen bir tabaka 22 cm x 11 cm), iskele 2B tabaka göbek yüzey alanı boyutu dikkatle mandrel kazınabilen) üretir. ) Elektrostatik yük azaltmak için alüminyum folyo ile iskele saklayın. Not: İki fazlı iskeleleri sıralı mikrofiber iskelesi üzerine direkt olarak bir nano iskele Elektrospinning üretilir. </li></ol> Hücre Kültürü Kullanım öncesi iskelelerinin 2. Sterilizasyon <ol><li> Iskele levhadan, 0.8 mm çaplı biyopsi kalem kullanarak bifazik veya hizalanmış iskelelerinin diskleri yumruk ve toksik olmayan akvaryum tutkal kullanarak conta sopa. </li><li> Bir 20&#39;de iliklerine önce iskelelerinin her iki tarafında 30 dakika süreyle ultra viyole radyasyon kullanarak iskeleleri sterilize% Hac / hac antibiyotik / antimikotik solüsyon ile (2x10 5 birim mi -1 penisilin G, 2.000 mg mi -1 streptomisin sülfat ve 500 ug ml -1 amfoterisin B) O / 4 ° C &#39;de N. </li><li> Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de PBS ile PBS içinde TCP yuvalı plakalar 3 kez ve sonra deposu iskeleleri iskeleleri yıkayın. </li></ol> 3. Hücre Kültürü Medya Bileşenleri <ol><li> DMEM-F12 ortam içinde kültür Calu3 epitel hücreleri (% 10 hacim / hacim, fetal sığır serumu (FCS), 2 nM L-glutamin çözeltisi,% 1 hacim / hacim antibiyotik / antimikotik çözümü ile 10,000 ünite ml -1 penisilin G, 100 mg desteklenmiş ml -1 streptomisin sülfat ve 25 ug ml -1 amfoterisin B). </li><li> DMEM ortamında kültür MRC5 fibroblast ASM hücreleri (% 10 hacim / hacim, fetal sığır serumu (FCS), 2 nM L-glutamin çözeltisi,% 1 hacim / hacim antibiyotik / antimikotik çözümü ile 10,000 ünite ml -1 penisilin G, 1 desteklenmiş00 mg ml -1 streptomisin sülfat ve 25 ug ml -1 amfoterisin B). </li><li> Kültür epitelyal fibroblast ASM hücresi ko-kültürler 70:30 DMEM-F12: DMEM ortamı karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li></ol> İki Fazlı Scaffold üzerine Fibroblast ve Epitel Hücreleri 4. Tohum <ol><li> Bir doku kültürü tabağında DMEM-takviye edilmiş ortam içinde iskeleleri emmek ve hücre tohumlamadan önce 1 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DMEM-takviye ortamları çıkarın apikal iskele mikrofiber aşamasını yerleştirin ve DMEM-desteklenmiş medya 30 ul 1.5 x10 4 MRC5 fibroblast hücreleri tohum. Hava O / N 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde bir kuluçka makinesi içinde ayrılmadan önce, 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka çalkalayın. </li><li> Böylece iskele nanolif aşaması apikal yüzleri üzerinde iskele nanolif fazı üzerine DMEM-F12-desteklenmiş medya 30 ul, tohum 3,0 x10 4 Calu3 epitel hücreleri iskele çevirin ve fo inkübeR 70:30 DMEM-F12, skafoldu daldırılması önce havada, 37 ° C&#39;de 2 saat,% 5 CO2: DMEM-takviye edilmiş ortam O / N önceden biyoreaktöre transfer etmek. </li></ol> Bağlantısızlar Scaffold üzerine ASM Hücreleri 5. Tohum <ol><li> Bir doku kültürü tabağında DMEM-takviye edilmiş ortam içinde iskeleleri emmek ve 2 saat (37 ° C,% 5 CO DMEM-takviye edilmiş bir ortam, 30 ul 2.5 x10 4 hücrelerini tohumlama ve inkübe edildi, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe 2 havada). Inkübatör ve O bırakmak DMEM-desteklenmiş medya karşılığında iskele Batmak / N biyoreaktörde bir tri-kültür kurmadan önce. </li></ol> 6. Ayar-up Biyoreaktör Sistemi kullanılarak Tri-kültür (Şekil 7) <ol><li> Epitel faz odasına yukarı bakacak şekilde tek odasının içinde oluğuna bifazik iskele conta yerleştirin. </li><li> Bifazik iskele altına hizalanmış iskele yerleştirin (yani mi bitişikcrofiber bifazik iskele fazı) ve birlikte biyoreaktör iki odadan kilitleyin. </li><li> (DMEM-F12 / DMEM-takviye edilmiş bazal haznesindeki ortam apikal haznesindeki DMEM-F12-takviye edilmiş bir ortam) iki devre çevresinde ve pompa ortam, yaklaşık 0.1 ml / dak bir peristaltik pompa kullanılarak iki orta rezervuar bağlı iki perfüzyon akış devreleri monte (40 mi ortamı her bir devre aracılığıyla geri dönüştürülmektedir). Ev 37 ° C&#39;de, hava içinde% 5 CO2 ile kuluçka makinesi içindeki sistemin tüm parçalar. </li><li> Bir hafta sonra, analizden önce bir başka hafta ALI de epitel hücreleri apikal odasından ortamı çıkarın ve kültür. </li></ol>

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li><li>Wenzel, S., Holgate, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+trap:+it+still+yields+few+answers+in+asthma.">The mouse trap: it still yields few answers in asthma.</a> American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).</li><li>Zosky, G. R., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+asthma.">Animal models of asthma.</a> Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).</li><li>Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+asthma.+American+journal+of+physiology.">Animal models of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).</li><li>Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth+on+nano-imprinted+patterns.">Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns.</a> Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).</li><li>Paik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+micropatterning+of+cell+lines+and+human+pluripotent+stem+cells+on+elastomeric+membranes.">Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes.</a> Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).</li><li>Williams, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+Cell+Sheets+Grown+on+Thermo-Responsive+Substrates+with+Microcontact+Printed+Protein+Patterns.">Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns.</a> Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).</li><li>Schindler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+nanofibrillar+matrix+promotes+in+vivo-like+organization+and+morphogenesis+for+cells+in+culture.">A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture.</a> Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).</li><li>Schindler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+Three+Dimensions.">Living in Three Dimensions.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).</li><li>Ahmed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+cytoskeletal+organization,+and+myosin+dynamics+of+mouse+embryonic+fibroblasts+cultured+on+nanofibrillar+surfaces.">Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).</li><li>Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+synthetic+micro-and+nano-structured+surfaces+on+cell+behavior.">Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior.</a> Biomaterials. 20, 573-588 (1999).</li><li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+Cell+Culture+System+for+Investigating+Cell+Interactions+With+Electrospun+Fibers.">Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).</li><li>Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function.">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).</li><li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+in+Asthma+and+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.">Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+a+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Miller, C., George, S., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+tissue-engineered+model+of+the+human+bronchiole.">Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).</li><li>West, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+3D+multicell+microtissue+culture+model+of+airway+smooth+muscle.+American+journal+of+physiology.">Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).</li><li>Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+musculature+on+a+chip:+an+in+vitro+model+of+allergic+asthmatic+bronchoconstriction+and+bronchodilation.">Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation.</a> Lab on a chip. , (2014).</li><li>Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano/micro+electro-spun+polyethylene+terephthalate+fibrous+mat+preparation+and+characterization.">Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization.</a> Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).</li><li>Morris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+smooth+muscle+maintain+in+situ+cell+orientation+and+phenotype+when+cultured+on+aligned+electrospun+scaffolds.">Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).</li><li>Morris, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electrospun+biphasic+scaffold+provides+optimal+three-dimensional+topography+for+in+vitro+co-culture+of+airway+epithelial+and+fibroblast+cells.">A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).</li><li>Sell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Natural+Polymers+in+Tissue+Engineering:+A+Focus+on+Electrospun+Extracellular+Matrix+Analogues.">The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues.</a> Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).</li><li>Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers.">Electrospinning of nanofibers.</a> Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).</li><li>Dalton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+and+additive+manufacturing:+converging+technologies.">Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies.</a> Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).</li><li>Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+tissue+engineering+scaffolds+using+electrostatic+processing+techniques:+A+study+of+poly(glycolic+acid)+electrospinning.">Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning.</a> Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).</li><li>Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospraying+and+electrospinning+of+polymers+for+biomedical+applications.+Poly(lactic-co-glycolic+acid)+and+poly(ethylene-co-vinylacetate).">Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate).</a> Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).</li><li>Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibers+for+regenerative+medicine.">Electrospun nanofibers for regenerative medicine.</a> Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).</li><li>Veleirinho, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+concentration+effects+on+the+properties+of+electrospun+poly+(ethylene+terephthalate)+nanofiber+mats.">Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats.</a> Journal of Polymer. , 460 (2008).</li><li>Balguid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+Fiber+Diameter+in+Electrospun+Poly(epsilon-Caprolactone)+Scaffolds+for+Optimal+Cellular+Infiltration+in+Cardiovascular+Tissue+Engineering.">Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).</li><li>Shalumon, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+three-dimensional+nano,+micro+and+micro/nano+scaffolds+of+porous+poly(lactic+acid)+by+electrospinning+and+comparison+of+cell+infiltration+by+Z-stacking/three-dimensional+projection+technique.">Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique.</a> IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).</li><li>Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+Analyze+Three-Dimensional+Cell+Distribution+and+Infiltration+in+Degradable+Scaffolds.">Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).</li><li>Rose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-Based+Materials+in+Ocular+Tissue+Engineering.">Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering.</a> Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).</li><li>Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Endothelial+Basement+Membrane+Nanotopography+in+Rhesus+Macaque+as+a+Guide+for+Vessel+Tissue+Engineering.">Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).</li><li>Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -. Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basement+membrane+topography+of+the+bladder+epithelium.">Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium.</a> Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).</li><li>Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+the+Canine+Corneal+Basement+Membranes.">Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes.</a> Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).</li><li>Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+equivalent+as+cell+culture+model+for+in+vitro+drug+permeation+studies.">Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies.</a> British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).</li></ol>

The Authors have nothing to disclose.

Doğal ECM&#39;ye benzer yapısal özelliklere sahip polimer lifleri electrospin yeteneği, bu ortamları yeniden electrospun olan bir çok doğal ya da sentetik polimerler ya da polimer harmanları yol açmıştır. Geleni etkisi iskele özelliklerine (polimer seçimi, polimer konsantrasyonu, çözücü, iğne ucu mesafesi ve sıcaklık dahil) işlem parametrelerinin Manipülasyon; ancak bazı parametreler, diğerlerinden 25 den iskele özelliklerine büyük bir etkiye sahip olabilir. PET lif çapı modifiye zaman, kullanılan polimerin konsantrasyonu, polimer çözeltisi electrospun olduğu hızı ve iğne çapı için anahtar parametreler bulundu. Hizalanmış lifleri elektrospinning zaman anahtar parametreleri (dönen mandrel) kullanılan toplama yöntemi ve hızda mandrel döndüğü vardır. 60 rpm mandrel hızını azaltarak sayesinde, üretilen rastgele hizalanmış iskeleleri daha iskele uni gösterdi bulunduuyumunun düz kollektör plaka üzerine elektrospinning karşılaştırıldığında. Decellularized havayolu dokusunun özellikleri, her havayolu hücre tipi kültürü için geliştirilen çeşitli iskele topografyalarına için rehberlik sağlamak için analiz edildi. Electrospun nanolifler hücre hareketini önleyen ve aynı zamanda artan metabolit difüzyonu için izin veren küçük bir gözenek boyutu, ancak yüksek oranda gözenekliliğine bağlı bazal membran yapıları çoğaltmak için çekici bir skafold olup. 9 elektro parametrelerini optimize ederken, PET konsantrasyonları ve akış oranlarının bir dizi test edildi. ince lifler, daha önce diğer gruplar tarafından kullanılan bir% 6 ağırlık / hacim PET çözeltisi kullanılarak elde edilmiştir. Ancak, yüksek boncuk düzeyleri ve tekdüzelik eksikliği sürekli sorunlar vardı. Boncuk kaldırmak için ilk girişimleri çeşitli kaynaklardan yüzey gerilimini düşürmek için çözeltiye, bir katyonik yüzey aktif madde, setiltrimetilamonyum bromür (CTAB), ekleme ve test dahilPET. surfaktan eklenmesi değil tamamen boncuk miktarı azalır. TFA çözücü solüsyonu: PET peletlerinin ticari kaynaklardan çok sayıda denemeden sonra, gıda sınıfı içecek şişesi PET içecek şişeleri kesme ve DCM içindeki bu çözülmesiyle kullanılmıştır. PET kaynağı fiber homojenliğini bir artış ve elyaf boncuk bir azalma ile sonuçlandı olarak kullanılması. Ağ / hac% 8 hafifçe Çözelti konsantrasyonu artar ve (23 g kadar 18G) İğne çapının azaltılması ile sürekli olarak yaklaşık 250 nm arasında bir lif çapına sahip hatasız nanolifler üretti. Electrospun Nanofiber iskeleleri zor iskelelerinin manuel kullanım yapım mandrelden koleksiyonunda üzerine yüksek elektrostatik olabilir. Bu eğirme ve kullanılmadan önce% 70 IMS ile yıkadıktan sonra, alüminyum folyo içine iskeleleri depolamak sureti ile geliştirilmiştir. Bu Elektrospinning işleminden iskele üzerinde kalan artık elektrostatik yük dağıtmak yardımcı olmak için ortaya çıktı. Üst sağlamakyavaş yavaş, rastgele hizalanmış nanolifler oluşturulan düşük konsantrasyon PET çözümü elektrospinning: kaynakçalara hava yolu duvarının içinde üç ana havayolu hücre tipleri karşılaştığı bireysel mikroçevrelerde benzer bir temel elektrospinning protokolü bu hücre tipleri için üç benzersiz iskeleleri üretmek için uyarlanmıştır Üzerine epitel hücreleri (RBM taklit) ekilmiştir. Daha hızlı bir oranda daha yüksek bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning tarafından rastgele hizalanmış mikroelyaflar (daha gözenekli iskele üreten), içine fibroblastlar (RBM hemen altındaki alt-mukoza alan taklit) ekilmiştir oluşturulmuştur. Mandrel hizalanmış nanolifler dönen yüksek hızlı üzerine düşük bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning olarak, lif yönünde yönlendirilmiş düz kas hücrelerinin hücre yaprak hizalanmış üretilmesi, bunun üzerine, elde edilmiştir. Artan lif çapı daha büyük hücre penetratio sağlayan artan gözenek boyutuna yoln iskelelerinin içine ve böylece, gerçek bir 3D ortamı oluşturmaya yardımcı olur. Mikrofiber iskeleleri hücrelerin iskele içinde birden düzlemlerde ikamet sağlamak için çalışmaya fibroblastların kültürü için kullanılmıştır. % 30 ağırlık / hacim PET konsantrasyonunu arttırarak, 2.5 um arasında bir ortalama çapa sahip PET lifler üretilmiştir. Daha çaplı elyafı (≈ 4 um)% 35 ağırlık / hacim, PET çözeltisi kullanılarak üretilmiştir, ama skafold kalınlığı homojenliği kayboldu ve tek tek lifler arasındaki yüksek farklılıklar belirgin oldu. Mikro fiber iskele gözenekler (sırasıyla 1.43 mikron vs 10.45 uM) nano iskeleleri ölçülenlerden daha 7 kat daha fazla, ama hücrelerin de statik tohumlama sınırlı hücre penetrasyonu sağlanır. Bu, dinamik bir orbital bir karıştırıcı, daha önce etkili olduğu gösterilmiştir bir yöntem kullanılarak tohum hücreleri ile iyileştirildi. Son derece uyumlu Nanofiber iskeleleri 10% elektrospinning tarafından oluşturulanağırlık / mandrel üzerine hacim PET çözümü 2,000 rpm&#39;de dönen (≈ 440 m min -1). PET konsantrasyonu elyaflar daha düşük konsantrasyonlarda sergilenen düzensiz bir dalga şeklinde bir yapıya önlemek için% 8 den yükseltilmiştir. Lifleri hizalamak konsantrasyonda artışa rağmen, (rastgele genel hizalanmış 216 nm genel 255 nm), ortalama elyaf çapı azalır. Kuruyan önce lifleri çekme mandreline yüksek hızda bu etkiye neden olması muhtemeldir. liflerin uyum ASM hücrelerinin uyum etkiledi ve aynı zamanda başka bir yerde, 21 karakterize edilmiştir ASM hücreleri üzerinde diğer fizyolojik etkileri vardır. Bu protokolün en önemli sınırlama örnekleri ödün vermeden belirlemek mümkün uzun bir süre boyunca ilk hücre eki veya ayrıma iskeleleri / &#39;görüntü canlı hücrelere yetersizliğidir. Yani düzeltmek; Bu en iyi duruma getirme kültür döneminden sonra ortaya çıkar demektirörnekleri ing ve daha sonra, hücre kültürü, hücre kültürü sırasında sonra değil başarılı olup olmadığını ölçmek. (Pembe mavi) AlamarBIue inkübe iskeleler bir renk değişimi gözlemlemek hücreleri mevcut ve yaşayabilir gösterir ama ideal değil. Jelatin gibi elektrospinning daha şeffaf polimerler iskelelerinin üzerinde hücrelerin görselleştirme yardımcı olabilir. Bizim modeli içinde bir nanofibröz iskele Elektrospinning benzer epitel hücreleri ikamet hangi yoğun nanolifler oluşan hava yolu RBM&#39;nin çoğaltma, izin verdi. Bu, daha önce immün hücreleri (veriler gösterilmemiştir) mümkün olmakla birlikte, yapısal hücreler, nano iskele 22 boyunca geçiremez gösterilmiştir. 3B yüzeyi üzerinde spesifik hücre tiplerinin kültür avantajlı iken (epitelyal ve endotelyal hücreleri gibi), nano yoluyla yapısal hücre göçü, bu koruma, diğer hücre tipleri kültürü için zararlı olabilir. Düz kas th yoluyla göç edemiyor gibiE hizalanmış nano skafold (İki hücre tipleri ayırma hizalanmış iskele karşı) birbirine bakan düz kas ve fibroblast tabakaları ile üç tabakalı birlikte-kültür toplandı. Bu hücreler yakın appozisyon içinde olmasını sağlar iken, bu çalışma bir hücre tipi (fibroblast veya düz kas ya) daha uzun bir süre boyunca bütün kültür katmanı sollamak edip sonuçlandırmak olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, hava yolu duvarının uygun bir üç katmanlı modeli bu çoklu hücre türleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için alternatif bir platform sağladığı geliştirilmiştir. Fibroblastlar bir lümen yüzeyi 17 içinde dış yüzey ve epitel hücreleri üzerinde tohumlandı düz kas hidrojel silindirik kollajen içinde gömülmüş olduğu benzer bir üç-tabakalı bir çalışma yakın zamanda yayımlanmıştır. içindeki boru şeklinde sağlayacak Burada geliştirilen electrospun iskelelerinin mekanik stabilite oluşturulacak oluşturur, ve bir akım resea kalırrch Grubumuzun içinde hedefliyoruz. Çalışma bu çalışmada vurgulanan, vücut payı içinde birkaç organları bu temel mukozal yapısal birim ve kiracı değiştirme yoluyla hava yolu odaklanmıştır iken, benzer platformlar kan damarları, mesane ve dahil olmak üzere bazal membran ünitesi içeren dokular için geliştirilmiş olabilir kolajen bazlı çok katmanlı modeller istihdam edilmiştir kornea,.

rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanında hızla trakea ve böbrek rejenerasyon iki önemli yeni başarıları ile devrimler, ilerliyor. doku mühendisliği geliştirilen biyomalzemeler az özelleşmiş laboratuvarlarda tür protokolleri aktarmak için fırsatları ile daha erişilebilir hale gelmektedir. Biyomalzeme kullanımını artırarak faydalanmak için astarlanmalıdır bir alan vitro diagnostik bulunmaktadır. In vitro çalışmalar tek hücre tipleri içinde hücre içi sinyal yolları araştırmak için önemli bir platform olduğunu ve çok sayıda hastalık patofizyolojilere yatan mekanizmaları tasvir yardımcı olmuştur. Bu çalışmalar genellikle doku kültürü plastik (TCP) bir tek tabaka olarak kültürlü olmanın bir tek hücre tipi güveniyor; daha az esnek ve gözenekli bir üç boyutlu (3D) bir ortam hücrelerden daha iki boyutlu (2D), sert yüzey, bir doku ya da organın içinde maruz kalmaktadır. Hayvan modelleri, geleneksel E olmuşturaynı zamanda bütün dokuya tercüme in vitro tespit etkilerini teyit etmek için mployed, ve aynı zamanda insan hastalıklarının araştırılması, klinik öncesi platformlar olarak kullanılabilir. Ancak, türler arası farklılıkların insan hastalığı anlayışımızda hayvan modellerinde bu güveni zayıflatmak -. Örneğin, akciğer hastalığı, astım çok anlayış küçük hava yolu düz kas demetinin mast hücresi infiltrasyonu kanıtı, ya da hayvan içinde kendiliğinden hastalık gelişimi için kapasite dahil olmak üzere insan durumuna ve bu model arasındaki içsel farklılıklara rağmen bir fare modelinde dayanır 3,4 modeli. İngiltere ve diğer ülkelerde teşvik ediliyor hayvan deney &quot;yerine, arıtma ve azaltma&quot; nin &quot;3R&quot; standardı ile hayvan modellerinde kullanımı ile ilgili etik hususlar da vardır. Çekici bir alternatif yaratma in vitro yapısında insan dokusunun tekrarlama olacağınıs, tek bir ünitede yetişkin insan hücre türleri arasındaki işbirliği doğasını araştırmak için. Hücreler benzersiz bir mikro-çevre içinde her doku içinde 3D çoklu-hücresel yapılar var. TCP hücrelerin kültürlenmesi sadece bu ortamı çoğaltmak ya da çok hücreli kültür kapasitesi sağlayamaz hücre mono tabakaları, kültür sağlar. Biyomalzeme ilerleme hücre kültürü için doğal ve sentetik 3D platformları hem geliştirme fırsatı sunmaktadır. Kök hücre 1 de dahil olmak üzere başka hücre tipleri ile recellularized olduğunda hücresizleştirilmiş ECM doku sınırlı ve büyük ölçüde insan olmayan kökenli durumu ile, bununla birlikte bu protokoller, karmaşık ve zaman alıcı olabilir, 3D hücre kültürü için de kullanılabilir. Diğer protokoller nanoimprinting, ECM birikimi, hücre tabaka teknolojileri, ya da elektrospinning gibi oluşturulan hücresel ortamlar üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Elektrospinning nanometreden mikrometre arasında değişen çap, r elyafların dokunmamış 3D gözenekli tabakalar oluştururDoğal ECM boyutlarını eplicating. Electrospun iskeleleri giderek 3D hücre kültürü platformları olarak istihdam edilmektedir -. Elektrospinning parametreleri manipülasyonu gibi gözenek boyutu, elyaf çapı, topografya ve uyum ve yüzey kimyası olarak iskele özellikleri üzerinde karmaşık kontrol sağlar. Hücreler izole kültive edildiğinde, bu parametrelerin değişiklikler, doğrudan hücre yapışmasını ve büyümeyi etkilediği gösterilmiştir. Bu avantajlar bir modeli 3D doku yapısı olarak hava yolu bronşiole kullanarak, tek bir 3D doku yapı olarak birden fazla hücre tiplerinin kültürlenmesini izin Bu çalışmada istismar edilmiştir. Bronşiyol duvarı, üç ana bölge (Şekil 1) oluşur. havayolu epitel hücreleri dış ortama önemli bir bariyer sağlayarak, hava-sıvı arayüzü (ALI) oturup nerede mukoza olduğunu. Onlar retiküler bazal membran (RBM) bulunması, sıkıca kompakt ECM esas collag oluşanen IV perlecans ve Lamininler. alt mukoza tabakası doğrudan mukoza, fibroblastlar, miyofibroblastlar de dahil olmak üzere hastalık koşullarında lökosit infiltre birden fazla hücre tiplerinden müteşekkildir, daha gözenekli bir bölümünün altında bulunur. Sonunda düz kas demetleri bir sarmal biçimde havayolu etrafında sarın ve hava yolu düz kasında (ASM) hizalanmış yaprak oluşmaktadır. Bu havayolu tonunu kontrol pürüzsüz kasının kasılma göreceli durumudur. Pulmoner sistem içinde electrospun iskelelerinin istihdam yakın zamana kadar rejeneratif amaçlı sınırlı olmuştu; bir electrospun trakeal yerine başarılı bir şekilde nakledilen edilir. Başarılı iken, bu tür tedaviler sayıda sınırlıdır ve bağlı dokusunun fonksiyonu göreceli basit doğasına trakea üzerine odaklanmıştır. In vitro teşhis için kullanılan havayolu modellerinin sınırlı örnekleri vardır, ve çoğunlukla düz kas kasılması ölçümlerine odaklanmıştır. toksik-olmayan ve hiçbirn-bozunur polimer polietilen tereftalat (PET) daha önce electrospun edilmiş ve uygun zamanda (onlara &quot;kapalı raf&quot; kullanılmasına izin) bozmadan uzun süre saklanabilir olabilir üretilen iskeleleri sağlamak için bu çalışmada kullanılan ve edildi uzun süreler boyunca kararlı hücre kültürü için. Grubumuzun Önceki çalışmalar temel elektrospinning protokolünün üç varyasyon istihdam üç ayrı PET electrospun iskeleleri kültür havayolu epitel, fibroblast için optimal topografyalarının ve izolasyon 21,22 düz kas hücreleri ve solunum yolu kokültürü sağlamak için üretilebilir göstermiştir epitel ve fibroblast hücreleri 22. Elyaf çapı büyük ölçüde epitel işlevselliği 22 etkilediği bulundu ve fiber hizalama düz kas 21 hizalanmış yaprak nesil izin verildi. Bu çalışmalar, statik koşullar altında, birbirinden bağımsız olarak yapıldı. Bu çalışmada, bu differetam olarak farklılaşmış yetişkin insan hücreleri içeren nt iskelesi, hava yolu arası hücresel yanıtları araştırmak için bir in vitro model fizyolojik ilgili sağlayan hava yolu duvarının 3B bölümü olarak bir ticari olarak temin edilebilir bir biyo-reaktörde ALI az bir hafta boyunca kültive edilmiştir. Bu protokol, bir model sistem olarak hava yolu bronş kullanarak iken, diğer organlarda mukozal birimlerinin 3B birlikte-kültür için bir platform olarak adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Lucozade (GSK) bottles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Mandrel</td>
			<td>Built in house</td>
			<td></td>
			<td>Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td>used in the electrospinning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for CALU3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for HASM cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for MRC5 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/ antimycotic solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Watson Marlow</td>
			<td></td>
			<td>For providing media flow through bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DKube</td>
			<td>Kiyatec</td>
			<td></td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting the electrospinning process to provide three unique environments for a tri-layered in vitro model of the airway wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Decellularized havayolu dokusu ya da biz electrospun iskele topografyalarına içine tanıtmak istediği havayolu ECM istenen özellikleri tespit havayolu biyopsilerinden immünohistolojik görüntülerin Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri: Yerli RBM matris yaklaşık 30.6 nm ± nm 153 (n ortalama ± SD = 50 ölçümleri liflerden oluşur ) çapı (Şekil 3A ve 5A) RBM çevreleyen matris iken doğası (Şekil 3C) &#39;de daha çok gözenekli olmuştur. Düz kas demetlerinin aracılığıyla immünohistolojik bölümler hücreleri 21 (Şekil 3E) hizalanmış yaprak olarak ASM hediye gösterir. Bu bilgiler electrospun iskelelerinin sokulan özelliklerini rehberlik kullanıldı. Bir dönen mandrel stabil yüksek hızlarda döndürmek başardı (&gt; 2.000 rpm / 440 m min -1) hizalanmış lifleri ile iskeleleri üretmek. Yavaş mandrel rotasyon (60 rpm 13.2 m · dk -1) lif yönünü etkilemediAma statik plaka Elektrospinning duruma göre daha muntazam kalınlıkta iskeleleri üretti. Elektro parametrelerini (PET konsantrasyonu ve çözelti akış hızı) değiştirerek, bu (elektro parametreleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir) bir kaç mikrometre veya nanometre yüzlerce çapları iskeleleri lifleri oluşturmak mümkün olmuştur. Bununla birlikte, düşük PET konsantrasyonlarda doğal RBM liflerin (150 nm), bir% 6 PET çözeltisi kullanılarak üretilmiştir, eşdeğer elyaf çapları electrospun elyafları elyafların boncuk (Şekil 4A) oluştu. Bu 2.4 Nm ± mil 255 arasında bir ortalama çapa sahip düzgün nanolifler üretilen% 8 PET solüsyonu konsantrasyonunun arttırılması ile elimine edilmiştir (ortalama ± SEM) ve 1.43 um ± 0.02 um (Şekiller 4B, 5A ve B) ortalama gözenek boyutu. Nanolifler electrospin için daha yavaş akış hızları sağlayan, 23 G 18 G iğne boyutunu azaltmak için gerekli olduğunu whilsdaha yüksek bir akış hızını muhafaza ve iğne blokajı, büyük iğne ile yinelenen sorunu azaltmada t. Nedeniyle yüksek bir çözelti viskozitesine mikro-iğne ucunda birden tıkanmalar ek olarak, elyaf çapı (Şekil 4F) yeknesaklık eksikliğine&gt;% 30 PET kurşun PET solüsyonundan bir artış electrospinning zaman. Um ± 0.02 um 2.50 arasında bir ortalama lif çapı sahip düzgün mikrofiber hasırlar 2 ml / st bir akış oranında bir% 30 ağırlık / hacim solüsyonu PET electrospinning, üretilen ve 10.45 mikron ± 0.13 um ortalama gözenek boyutuna (ortalama ± SEM) -1 (Şekil 4F, 5A &amp; B). Mikrofiber iskele (hala mandrele bağlı) üzerine direkt olarak nano iskele Sıralı elektro bifazik iskele (Şekil 3D) oluşturuldu. ortalama lif çapları sırasıyla nanolif ve mikrofiber fazları için 20 nm ve 2.30 mikron ± 0.06 mikron ± nm 280 idiBireysel nanolif ve mikrofiber iskelelerinin boyutlarına karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, iki fazlı iskele kalınlığı bağımsız nano ve mikrofiber iskeleleri (Şekil 5C) toplamına benzemektedir. Mandrel hızını artırarak (2.000 rpm / 440 m · dk -1), son derece uyumlu nano veya mikrofiber iskelelerinin üretildi. % 8 ağırlık / hacim PET çözeltisi, bir dalga şeklinde bir yapıya (Şekil 3F) sahip hizalanmış nanolifler ve üretilen elyafın üretilmesi için uygun değildir. % 10 PET artış bu etkiyi iptal, ama yine de düşük bir lif çapı rastgele hizalanmış nano iskeleleri ile karşılaştırıldığında (2.2 nm (± SEM ortalama) ± nm 216) sonuçlandı. Fiber hizalama ortalama elyaf açısı, her elyafın açısının sapmasını belirlenerek hesaplandı. Hizalanmış Nanofiber iskelelerinin liflerin% 79 rastgele hizalanmış nanolif Scaff liflerin% 10,2 oranla (± 10 ° ortalama lif açısı) hizalanmış edildiyaşındakiler (Şekil 5D). % 8 nano skafold epitel hücreleri bulunan üzerinde RBM özetlemek için kullanıldı ve Calu3 hücre kültürü (bir hava yolu epitel hücre hattı) desteklemek için kullanılmıştır. Doğada daha gözenekli olan% 30 ağırlık / hacim mikrofiber iskeleti, alt mukozal bölge taklit etmek için kullanılır ve MRC5 hücreleri (bir hava yolu fıbroblast hücre hattı) ile kültürlenmiştir edildi. Topolojik referans verilen% 10 ağırlık / hacim hizalanmış nanolif iskele ASM hücre uyum sağlamak için zaman iskele kültüre. 2 haftalık bir süre (Şekil 6A) içinde bireysel iskeleler üzerine kültürlenmiş ve 2 haftalık kültür dönemi (Şekil 6B, 6C, ve 6D) sonra hücre tipi belirli proteinleri eksprese edildiği zaman, tüm üç hücre tipi canlılığında bir artış göstermiştir. Tek tek hücre-iskele etkileşimlerinin daha fazla karakterizasyon, başka bir yerde 21 bildirilmiştir. nano skafoldun sıralı elektromikrofiber iskele sırasıyla nanolif ve mikrofiber aşamalarında üzerine Calu3 epitel hücreleri ve MRC5 fibroblast hücrelerinin kokültürü için bifazik iskele üretti üzerine. birlikte, statik koşullar altında, iki hücre kültür başka 22 bildirilmiştir. Statik koşullar altında 2 hafta ötesinde bifazik kültür kez diğer hücre katmanları eklemek veya genişletmek için çalışırken daha fazla çalışma (veriler gösterilmemiştir) başarısız oldu. Kültür için uzun bir süre boyunca bir üç katmanlı bir model, bir perfüzyon akış biyoreaktör kullanılır. Calu3 ve MRC5 hücreleri iki fazlı yapı iskelesi üzerine ekilir ve ASM Hücreler hizalanmış bir yapı iskelesi üzerinde, ve her ikisi de 2 gün boyunca ayrı ayrı kültürlendi edildi. İki iskeleleri sonra biyoreaktör içinde hava yolu duvarının bir tri-katmanlı modeli (Şekil 7) oluşturmak için bir araya satın alındı. Hem odalar apikal epitel haznesi ortam çıkarıldı olmadan önce 7 gün süreyle ortam ile perfüze ve epitel hücreler kültürlendi edildi7 gün daha ALI. Iskeleleri, sabit ve ya kesitli ve lekeli veya bütün iskeleleri hücreye özel markörler için immunohistokimyasal edildi. Üç-tabakalı kültürü yoluyla Bölümler kokültürü (Şekil 8B) her üç katman arasında dağıtılmaktadır hücre çekirdekleri göstermiştir. Hücreler, hücre spesifik belirteçler için immunosteyn edildi, epitel hücreler konfluent hücre katmanı olarak apikal nano faz doldurulur ve sitokeratin ile pozitif boyanmış (Şekil 8C), mikro elyaf faz, fibroblastlar S100A4 (Şekil 8D) için pozitif boyandı ve üzerine Hava yolu duvarının 3D model içinde her hücre tipi iyi hayatta kalma belirten SM22α (Şekil 8E) için pozitif boyandı hizalanmış% 10 iskele ASM hücreleri. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> Şekil 1. havayolu bronşiyol. Şiddetli gelen Bronş biyopsisimezenkimal hücreler ile doldurulan altta yatan submukozal bölge ile retiküler bazal membran (RBM) üzerine epitel gösteren astım havayolu, ve düz kas alfa-aktin (kahverengi) için boyanmış düz kas hücreleri ile doldurulur çevreleyen düz kas demetleri. Ölçek çubuğu 200 mikron gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> Şekil 2. elektro ekipmanın şeması. (Ekli bir iğne ile) polimeri / solvent solüsyonu ihtiva eden bir şırınga mandrel bakan bir şırınga pompa üzerine yerleştirilir. Bir elektrik potansiyeli iğne ve mandrel neden fiber iğne ucundan çıkarılır ve döner mandrel üzerine biriktirilecek arasında kurulur. Fiber atmosferi boyunca geçerken,mandrel polimer liflerin birikimi neden çözücü buharlaşır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> Yerli havayolu ECM electrospun iskelelerinin Şekil 3. karşılaştırılması. Decellularized bazal membran (A), enine kesiti (C) ve bir solunum yolu düz kas demetinin bir histolojik bölüm Bronşiyol decellularized havayolu Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri (haematoxylin ve eosin, ölçek ile boyandı çubuk 40 um) nanolif (B ile karşılaştırıldığında (E)) bifazik (D) ve hizalanmış (F) PET iskelelerinin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonu. Tablo 1. Parametreler mikrofiber, nanolif electrospinning için kullanılan tek tek ve iki fazlı skafold için iskeleler hizalanır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> PET konsantrasyonlarda Şekil 4. alterasyon elyaf vasıflarına.% 6,% 8,% 10 (AC),% 25,% 30 ve% 35 (EG), (ağırlık / hacim) PET çözeltilerinden ip electrospun iskelelerinin tarama elektron mikroskobu görüntülerini etkileyen . Ayrıca hizalanmış iskeleleri% 8 (D) ve% 30 den üretilmektedir (H) ağırlık / hacim PET çözümleri gösterildiği. AD 1,000X büyütmede görüntülü EH, 5,000X büyütme görüntülü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> Electrospun PET iskelelerinin Şekil 5. özellikleri. Retiküler bazal membran ekstrasellüler matriks (RBM ECM), rastgele hizalanmış nano ve mikro fiber iskeleleri ve hizalanmış nanolif iskele fiber çapı dağılımını gösteren (A) Dağıtım eğrileri. (B) Histogram nano ve mikro-fiber iskeleleri göreli gözenek boyutu dağılımını gösteren. (C) nanolif, mikrofiber, bifazik ve hizalanmış iskelelerinin ortalama kalınlığı (ortalama ± standart sapma n = 6). (D) İskele lif analizi ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir rastgele veya hizalanmış nano iskeleleri ortalama lif oryantasyonu sapma gösteren Histogram arsa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>kira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> Şekil 6. bireysel iskeleleri bireysel hücre tiplerinin kültürü. (A) hizalanmış İskele üzerinde ASM hücreleri için AlamarBIue hücre canlılığı tahlil sonuçları, Calu3 nanofiber iskelelerinin üzerinde hücreleri ve mikrofiber iskeleleri üzerine MRC5 hücreleri (± SEM ortalama n = 3 20). Nanofiber, mikrofiber Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ve hizalanmış lif iskeleleri (B, C ve D sırasıyla) ve SM22α lekeli vinkülin (kırmızı) ve ASM hücreleri için boyanmış E-kaderin (kırmızı) için boyanmış Calu3 hücreleri, MRC5 hücreleri immunofluorescent görüntüleri (sırasıyla, E, F ve G) ve tüm özel bir platform üzerinde (kırmızı). Hoechst çekirdekleri (mavi) leke için kullanılan, ölçek çubuğu gösterir 40# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> Üç katmanlı hava yolu duvar modeli için Şekil 7. Perfüzyon sistemi. Peristaltik pompa ve 2x medya rezervuar bağlı biyoreaktör geminin (A) Fotoğraf. Tri-tabakalı iskeleleri (B) şematik. (C) şematik havayolu modeli hava-sıvı arayüzü düzenlenen iki biyoreaktör devrelerin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> Şekil 8. Tam 3D hava yolu duvar modeli. (A) kırmızıyla vurgulanır mukoza tabakası ile hava yolu duvarının Bronş biyopsisi, submukozal bölgede yeşil vurgulanır ve düz kas demeti altın vurguladı. Epitel, fibroblast ve 2 hafta kokültürü sonra sabit düz kas hücreleri ile doldurulur bifazik ve hizalanmış iskelelerinin oluşan üç katmanlı hava yolu duvarı boyunca (B) Bölüm. Hücre çekirdeği aynı anda görüntülü iskele yansıtma (gri) ile DAPI (mavi) ile boyandı. Iskeleleri da sitokeratin (yeşil) için boyandı Calu3 hücrelerinin (C), S100A4 (yeşil), (D) ve SM22α (kırmızı) için boyanmış yumuşak kas hücreleri için boyanmış MRC5 hücreleri ile (sabit ve 2 hafta sonra hücre spesifik belirteçler için immunohistokimyasal e). Ölçek çubuğu 200 mikron gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1.

Watch this Scientific Journal Video about Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall at JoVE.com

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

adapting-electrospinning-process-to-provide-three-unique-environments

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

12.3K Görüntüleme.  University of Nottingham. Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall. 

Video: Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Yerli Arter Mimarlık polycaprolactone, Elastin ve Kollajen kullanarak Mimik Üç katmanlı elektrospinning: Bir Ön Çalışma

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Biyomühendislik

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Model Vocal Fold Polip'in Neden Olduğu Üç Boyutlu Akış Ayrımının Araştırılması

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.